1

Ćwiczenie

Ćwiczenie

Ćwiczenie

Ćwiczenie 2C

2C

2C

2C –

–

–

– Część

Część

Część

Część praktyczna

praktyczna

praktyczna

praktyczna

I.

I.

Analiza rozmazów

Analiza rozmazów krwi obwodowej
– leukocyty oraz szpiku kostnego

II.

II.

Hemoliza

Hemoliza, badanie oporności
erytrocytów w rozmazach
hipotonicznych

III.

III.

Oznaczanie grup krwi

Oznaczanie grup krwi w układzie
ABO i czynnika Rh za pomocą
surowic wzorcowych

I.

I.

Analiza rozmazów krwi obwodowej

Analiza rozmazów krwi obwodowej oraz

oraz

szpiku

szpiku kostnego

kostnego

Do wykonania rozmazu szpik kostny pobiera się od pacjenta metodą

BIOPSJI

BIOPSJI

ASPIRACYJNA

ASPIRACYJNA CIENKOIGŁOWEJ

CIENKOIGŁOWEJ (PUNKCJA)

(PUNKCJA). Miazgę krwiotwórczą pobiera

się z jamy szpikowej kości : u osób dorosłych z

talerza kości biodrowej lub

mostka, a u dzieci również z kości piszczelowej i trzonów kręgów
lędźwiowych.
Pobraną miazgę krwiotwórczą rozprowadza się na szkiełkach mikroskopowych
wykonując tzw. rozmazy, następnie barwi się barwnikami

May-Grünwald-

Giemsa i ogląda się pod mikroskopem świetlnym przy dużym powiększeniu
(obiektyw imersyjny 100x).

OCENIA SIĘ:
-

liczbę i rodzaje poszczególnych komórek,

-

ustala udział procentowy określonych rodzajów komórek szpiku tzw.

MIELOGRAM

MIELOGRAM.

Układ

Szpik kostny

Krew obwodowa

Erytrocytarny

25,6%

99,9%

Granulocytarny

56,2%

0,1%

Elementy morfotyczne w szpiku kostnym i krwi obwodowej:

2

Rodzaj komórki

Zawartość średnia (%)

Układ erytrocytarny (łącznie)

25,6

Proerytroblasty
Erytroblasty zasadochłonne
Erytroblasty polichromatofilne
Erytroblasty ortochromatyczne

0,6
1,4

21,6

2,0

Układ neutrofilów (łącznie)

53,6

Mieloblasty
Promielocyty
Metamielocyty
Granulocyty pałeczkowate
Granulocyty segmentowane

0,9
3,3

15,9
12,4

7,4

Układ eozynofilów (łącznie)

3,1

Mielocyty
Metamielocyty
Granulocyty pałeczkowate
Granulocyty segmentowane

0,8
1,2
0,9
0,5

Układ bazofilów (łącznie)

0,8

Układ monocytów (łącznie)

2,0

Megakariocyty

0,3

Mielogram, skład komórkowy szpiku:

II. Hemoliza

II. Hemoliza, badanie oporności erytrocytów w

, badanie oporności erytrocytów w

rozmazach hipotonicznych

rozmazach hipotonicznych

-- cz. chemiczne

cz. chemiczne

np.: eter, chloroform, benzyna, kwasy, zasady,

mydła, saponiny

-- cz. biologiczne

cz. biologiczne

np.: toksyny bakteryjne, jady żmij, przeciwciała

powstające w konflikcie serologicznym, choroby związane z
nieprawidłową budową erytrocytów

- cz. fizyczne

cz. fizyczne

np.: temperatura. pole elektryczne, ciśnienie

osmotyczne i zmniejszenie oporności błon komórkowych erytrocytów

Czynniki hemolizujące

uszkadzające błonę komórkową:

3

Wykonanie:
1. przygotować w 20 probówkach szereg
roztworów roztworów hypotonicznych
NaCl (w każdej ok. 1ml roztworu).

2. szereg roztworów: od stężenia hipotonicznego (0.20%) do
roztworu fizjologicznego (0.85%) NaCl. Róznica stężeń
pomiędzy probówkami wynosi 0.02%.

3. do każdej probówki wlewamy po 60ul świeżo pobranej krwi
obwodowej żylnej

4. po ok. 0.5 godzinie obserwujemy procent zhemolizowanych
erytrocytów (zjawisko hemolizy). Ocena spektrofotometryczna

Oporność osmotyczna erytrocytów
w roztworach hipotonicznych NaCl

%

h

e

m

o

li

z

a

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

0.85

0

25

50

75

100

[%] NaCl

hemoliza całkowita

(oporność osm.
maksymalna)

hemoliza
średnia
(oporność
osm. średnia)

początek hemolizy

(oporność osm. minimalna)

0,85% roztwór izotoniczny
NaCl (sól fizjologiczna)

)

Hemoliza:

0.7% NaCl
= początek hemolizy

0.46% - 0.59% NaCl
= średnia hemoliza

(50%)

0.3% -0% NaCl
= hemoliza

całkowita (100%)

Oporność osmotyczna erytrocytów
w roztworach hipotonicznych NaCl

4

SEROLOGIA – nauka o grupach krwi (łac. serum, czyli surowica)

HISTORIA ODKRYĆ GRUP KRWI:

1901 - odkrycie grup krwi w układzie AB0

przez Landsteinera

1910 – L. Hirszfeld wykazał, że grupy krwi w układzie AB0

dziedziczą się według reguł Mendla i zaproponował

obecnie

stosowane nazewnictwo grup krwi układu AB0
1940 – układ grupowy Rh

Obecnie znamy łącznie kilkaset układów grupowych obejmujących

tysiące grup krwi (MNSs, Kk, P, HLA…).

III. Oznaczanie

III. Oznaczanie grup krwi w

grup krwi w układzie ABO

układzie ABO i

i Rh

Rh

za pomocą surowic wzorcowych

za pomocą surowic wzorcowych

Układ grupowy AB0 -

uwarunkowany

jest obecnością na erytrocytach antygenów A,

A, B

B lub H

H

Antygeny A, B, H → cząsteczki białkowo-polisacharydowe obecne w błonie
komórkowej erytrocytu. Różnią się sekwencją terminalnych monosacharydów.

5

Antygeny A, B i H występują samodzielnie na krwinkach
warunkując grupę krwi odpowiednio: A,

A, B

B lub 0

0. Antygeny A

i B mogą występować razem determinując grupę krwi AB

AB.

Antygeny układu AB0 występują oprócz erytrocytów na

powierzchni wszystkich komórek organizmu

wszystkich komórek organizmu

z wyjątkiem komórek nerwowych

oraz

w płynach ustrojowych

(ślina, nasienie, wody płodowe, sok żołądkowy)

z wyjątkiem płynu mózgowo-rdzeniowego.

Ciekawostka:

Ciekawostka: 20% ludzi należy do grupy tzw. niewydzielaczy, tzn. w ich płynach ustrojowych nie ma

20% ludzi należy do grupy tzw. niewydzielaczy, tzn. w ich płynach ustrojowych nie ma

substancji grupowych

substancji grupowych.

Antygen A nie jest jednorodny, dzieli się na A1 (80%) i

A2 (20%).

Inne słabsze odmiany występują bardzo rzadko.

Grupa krwi

Antygen

grupowy w

otoczce krwinek

czerwonych

Izohemaglutyniny w

osoczu

Częstość

występowania

grup krwi w

Polsce w %

A

A

1

A

1

anty-B

31,5

A

2

A

2

anty-B

9,5

B

B

anty-A

19,0

AB

A

1

B

A

1

B

Brak

6,4

A

2

B

A

2

B

brak

1,6

0

H (bardzo słaby)

anty-A i anty-B

32,5

Bombay

brak

anty-A, anty-B,

anty-H (słabe)

Bardzo rzadko

izohemaglutyniny = izoprzeciwciała = naturalne przeciwciała

6

Układ grupowy Rh-

kontrolowany jest przez

trzy pary genów C i c, D i d oraz E i e. W praktyce
klinicznej największe znaczenie ma antygen D, ponieważ
jest najbardziej immunogenny.

Grupa Rh

+

: antygen D w otoczkach

erytrocytów (85% populacji).
Grupa Rh

-

: brak antygenu D w otoczkach

erytrocytów. Brak naturalnych przeciwciał anty-
D w surowicy!!!.

Antygeny układu Rh występują tylko na erytrocytach

Przeciwciała anty–D mają charakter odpornościowy, pojawiają się w ustroju w
następstwie uodpornienia antygenami D. Ma to miejsce w przypadku:
- przetoczenia krwi niezgodnej grupowo
- domięśniowego podawania minimalnej dawki antygenu D
- konfliktu serologicznego

KONFLIKT SEROLOGICZNY

Występuje pomiędzy D-ujemną matką a D-dodatnim płodem.
Polega na wytworzeniu przez matkę przeciwciał skierowanych

przeciwko antygenom krwinek dziecka. Prowadzi do

choroby

hemolitycznej noworodków (ChHN).

Warunki wystąpienia

Warunki wystąpienia

konfliktu serologicznego:

konfliktu serologicznego:

- Zaistnienie niezgodności

grupowej

- Wielokrotna ekspozycja

na antygen

- Nadreaktywność układu

immunologicznego

7

ZASTOSOWANIE

ZASTOSOWANIE OZNACZEŃ

OZNACZEŃ

GRUP KRWI

GRUP KRWI:

:

W celu transfuzji krwi

W celu transfuzji krwi

(Uwaga: Naczelna zasada

współczesnej transfuzjologii to odchodzenie od
podawania krwi pełnej i przetaczanie takich preparatów
krwi jakich potrzebuje organizm pacjenta)

W transplantologii

Do celów medycyny sądowej

Identyfikacja osób
Identyfikacja próbek krwi
Badanie śladów biologicznych

W ustalaniu spornego ojcostwa

Poza medycyną → seroantropologia (bada grupy
krwi różnych odmian etnicznych człowieka)

Transfuzja krwi

Transfuzja krwi

– powinno się przetaczać tylko

krew grup

równoimiennych, gdyż taki dobór uchroni biorcę przed wystąpieniem
wewnątrzustrojowej hemolizy i aglutynacji. Szczególnie ważne jest
uwzględnienie silnych antygenów należących do układu AB0 i Rh.

Przed przetoczeniem krwi:
- Oznacza się przynależność grupową krwiodawcy i krwiobiorcy
- Wykonuje się

próbę krzyżową (próba zgodności)

Osoby z grupą krwi AB-

Uniwersalni Biorcy

Osoby z grupą krwi 0-

Uniwersalni Dawcy

We współczesnej transfuzjologii

We współczesnej transfuzjologii

o

określenia nieaktualne

kreślenia nieaktualne

8

Oznaczanie grup krwi w układzie AB0 i Rh

metodą płytkową

b/

b/ surowice wzorcowe anty-A,

anty-B, anty-AB i anty-D

a/

a/ Krew włośniczkową pobraną na

3,8% cytrynian sodu

rozcieńczoną 20× w PBS

Na płytce do oznaczania grup

krwi miesza się

rozcieńczoną krew z surowicą

wzorcową w stosunku1:3

1.

1.

Przygotować:

Przygotować:

c/

c/ płytkę do oznaczania grup krwi

2

2. Wykonanie

. Wykonanie

anty-A anty-B anty-AB anty-D PBS

Pacjent 1

Pacjent 2

Pacjent 3

Pacjent 4

W kolumnach do

dołków nanosimy po

150 µ

µ

µ

µl odpowiedniej

surowicy wzorcowej

W

r

z

ę

d

a

ch

d

o

d

a

je

m

y

d

o

su

ro

w

ic

p

o

5

0

µ

l

kr

w

i

b

a

d

a

n

e

g

o

p

a

cj

e

n

ta

9

Aglutynacja

Aglutynacja - zlepianie się krwinek czerwonych pod wpływem przeciwciał
zawartych w surowicy w duże, widoczne gołym okiem skupiska

3. Odczyt

3. Odczyt

Oceniamy zachowanie się krwinek czerwonych w obecności
surowicy wzorcowej zawierającej określone przeciwciała czyli
pojawienie się lub brak

AGLUTYNACJI

AGLUTYNACJI

Odczyt

Odczyt wykonujemy po 5-10 minutowej inkubacji
w temperaturze pokojowej

anty-A anty-B anty-AB anty-D PBS

Pacjent 1

Pacjent 2

Pacjent 3

Pacjent 4

Grupa A Rh-

Grupa B Rh+

Grupa AB Rh-

Grupa 0 Rh+

PBS-zbuforowany

roztwór soli

fizjologicznej,

służy jako kontrola,

brak aglutynacji

krwinek w obecności

PBS

A

A- aglutynacja

A

A

A

A

A

A

A

A