1

WICZENIE

6

C

HROMATOGRAFIA POWINIWACTWA

Oczyszczanie N-acetylo-ββββ-D-glukozaminidazy ze linianek 3-miesi cznych szczurów
metod chromatografii powinowactwa lektynowego. Bilans oczyszczania.

Materiały i odczynniki
Homogenat linianek 3-miesi -
cznych szczurów, bufor wyj cio-
wy:10 mM Tris-HCl pH 8,0,
0,15 M NaCl, 1 mM CaCl

2

,

1 mM MgCl

2

, 1mM MnCl

2

,

eluent: 0,5 M metylo-

α-D-

mannozyd w buforze wyj cio-
wym.
Aparatura i sprz t laboratoryjny
kolumna chromatograficzna
Con A-Sefaroza, spektrofoto-
metr UV-VIS, zestaw do ELISA,
kuweta

kwarcowa,

pipety,

probówki, statyw na probówki,
czasomierz

Wykonanie
Oznaczy st enie białka całkowitego w homogenacie linianek szczura metod Bradforda
(w tym celu homogenat rozcie czy 100x i 500x). Oznaczy aktywno enzymatyczn
N-acetyloheksozaminidazy w homogenacie linianek szczura (w tym celu homogenat
rozcie czy 1x i 10x). Ustali szybko przepływu na kolumnie na warto ok. 1 ml/min. Na
kolumn Con A-Sefaroza o obj to ci ok. 3ml nało y 1ml homogenatu linianek szczura.
Kolumn chromatograficzn przepłuka 40 ml buforu wyj ciowego zbieraj c 20 frakcji po 2
ml. Nastepnie nało y na kolumn eluent i zamkn j na 15 min. Elucj prowadzi zbieraj c
8 frakcji po 2 ml. Przepłuka kolumn buforem wyj ciowym. Detekcj białka w poszczegól-
nych frakcjach wykona w spektrofotometrze Bio-Rad, przy długo ci fali

λ = 280nm,

pobieraj c z ka dej frakcji obj to 0,9 ml. Frakcje eluatu zawieraj ce białko poł czy i

2

oznaczy st enie białka metod Bradforda oraz aktywno enzymatyczn
N-acetyloheksozaminidazy.

Opracowanie wyników
Obliczy st enie białka oraz aktywno enzymatyczn i aktywno wła ciw
N-acetyloheksozaminidazy w homogenacie linianek szczura i w eluacie. Wyznaczy
współczynnik oczyszczenia enzymu (iloraz aktywno ci wła ciwej enzymu w eluacie
i aktywno ci wła ciwej enzymu w próbce nakładanej).

WYZNACZANIE ST

ENIA BIAŁKA. METODA BRADFORDA.

Odczynniki:

• odczynnik Bradforda

• roztwór wzorcowy białka (BSA) o st eniu 0,5 µg/µl

• H

2

O 3 x dest.

Sprz t laboratoryjny:

płytka do ELISA, czytnik do ELISA, filtr 595 nm, pipety nastawne, czasomierz

Wykonanie:
odpipetowa do kolejnych dołków płytki do ELISA: 0, 2, 4, 6, 8 i 10

µl roztworu

wzorcowego białka i uzupełni H

2

O 3x dest. do obj to ci 10

µl. Do dwóch oddzielnych

dołków w płytce odpipetowa po 10

µl 100x i 500x rozcie czonego homogenatu linianek

oraz do dwóch kolejnych dołków odpipetowa po 10

µl nierozcie czonego eluatu. Do

wszystkich dołków doda po 0,25 ml odczynnika Bradforda i po upływie 5 min odczyta
warto absorbancji przy

λ = 595nm wobec lepej odczynnikowej.

UWAGA !!!

wymagane rozcie czenia nale y wykona nast puj co:
100-krotne rozcie czenie – do 5

µl homogenatu doda 495 µl H

2

O 3x dest., wymiesza

500-krotne rozcie czenie - pobra 20

µl 100 razy rozcie czonego homogenatu i doda 80 µl

H

2

O 3x dest., wymiesza .

Opracowanie wyników:

wykre li krzyw kalibracyjn zale no ci absorbancji od st enia białka wyra onego w

µg/10µl. Odczyta st enie białka w homogenacie i eluacie (uwzgl dniaj c ewentualne

rozcie czenie). Obliczy rednie st enie białka w homogenacie i eluacie.

3

Krzywa kalibracyjna:

A

595

St enie białka

c

[

µg/10µl]

Homogenat linianek:

rozcie -

czenie

A

595

st enie białka

c [µg/10µl]

warto rednia

c [mg/ml]

100x

500x

Eluat:

rozcie -

czenie

A

595

st enie białka

c [µg/10µl]

warto rednia

c [mg/ml]

1x

1x

OZNACZANIE AKTYWNO CI ENZYMATYCZNEJ

N-ACETYLO-ββββ-D-GLUKOZAMINIDAZY

N-acetylo-

β-D-glukozaminidaza (EC.3.2.1.30) hydrolizuje wi zanie β-N-acetyloglukoz-

aminylowe (na nieredukuj cym ko cu ła cucha cukrowego) w oligosacharydach takich jak

kwas hialuronowy czy siarczan chondroityny. W celu wyznaczenia aktywno ci N-acetylo-

glukozaminidazy stosuje si substraty syntetyczne: glikozydy np. fenylowe lub p-nitrofenylo-

we.

O

NO

2

O

CH

2

OH

O

OH

NHAc

O

CH

2

OH

OH

HO

NHAc

OH

NO

2

HO

H

2

O

+

p-nitrofenylo-N-acetylo-

β-D-glukozamina

p-nitrofenol

N-acetylo-

β-D-glukozamina

Uwolniony p-nitrofenol wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długo ci
fali

λ = 405 nm.

Odczynniki:

• bufor cytrynianowy – 58 mM kwas cytrynowy, 41mM fosforan sodowy jednozasadowy,

0.1% Triton X-100, pH 4,2

• substrat – 2 mM p-nitrofenylo-N-acetylo-β-D-glukozamina

• stoper – 0,4 M glicyna-NaOH, pH 10,4

4

Sprz t laboratoryjny:

probówki, pipety nastawne, czasomierz, ła nia wodna, statywy, spektrofotometr UV-VIS

Wykonanie:

przygotowa 10-krotne rozcie czenia homogenatu linianek - w tym celu pobra do
oddzielnej probówki 5

µl homogenatu i uzupełni buforem do obj to ci 50 µl. Cało

wymiesza .
Do oddzielnych probówek odpipetowa po 30

µl nierozcie czonego i rozcie czonego

homogenatu oraz 2 razy po 30

µl nierozcie czonego eluatu, a nast pnie doda po 30 µl

substratu i po 100

µl buforu. Inkubowa w temperaturze 37°C przez 10 min. Reakcj

enzymatyczn zatrzyma dodaj c 0,5 ml stopera. Absorbancj przekształconego substratu
mierzy w czytniku do ELISA przy

λ= 405nm wobec lepej odczynnikowej.

Opracowanie wyników:

mno c warto absorbancji przez stał k = 1007 otrzymuje si st enie przekształconego
substratu

s wyra one w nmol/ml. Po uwzgl dnieniu czasu inkubacji t oraz rozcie cze

obliczy warto aktywno ci enzymatycznej

β-N-acetylo-D-glukozaminidazy i wyrazi j w

nkat. Obliczy aktywno wła ciw i wyrazi j w

µkat/kg.

Rozcie -

czenie

A

405

s

[nmol/ml]

t

[min]

Aktywno

enzymatyczna

[nkat]

rednia

warto

aktywno ci

enzymatyczna

[nkat]

1x hom.

10x hom.

1x eluat

1x eluat

Próbka

rednia warto

aktywno ci

enzymatyczna

[nkat]

c

[kg/ml]

Aktywno

wła ciwa
[

µkat/kg]

Wpółczynnik

oczyszczenia

homogenat

eluat

Literatura:

1) „Techniki bada fizjologicznych” (red. A. Lity ska, M.H. Lewandowski), str. 75-85.