1
WICZENIE
6
C
HROMATOGRAFIA POWINIWACTWA
Oczyszczanie N-acetylo-ββββ-D-glukozaminidazy ze linianek 3-miesi cznych szczurów
metod chromatografii powinowactwa lektynowego. Bilans oczyszczania.
Materiały i odczynniki
Homogenat linianek 3-miesi -
cznych szczurów, bufor wyj cio-
wy:10 mM Tris-HCl pH 8,0,
0,15 M NaCl, 1 mM CaCl
2
,
1 mM MgCl
2
, 1mM MnCl
2
,
eluent: 0,5 M metylo-
α-D-
mannozyd w buforze wyj cio-
wym.
Aparatura i sprz t laboratoryjny
kolumna chromatograficzna
Con A-Sefaroza, spektrofoto-
metr UV-VIS, zestaw do ELISA,
kuweta
kwarcowa,
pipety,
probówki, statyw na probówki,
czasomierz
Wykonanie
Oznaczy st enie białka całkowitego w homogenacie linianek szczura metod Bradforda
(w tym celu homogenat rozcie czy 100x i 500x). Oznaczy aktywno enzymatyczn
N-acetyloheksozaminidazy w homogenacie linianek szczura (w tym celu homogenat
rozcie czy 1x i 10x). Ustali szybko przepływu na kolumnie na warto ok. 1 ml/min. Na
kolumn Con A-Sefaroza o obj to ci ok. 3ml nało y 1ml homogenatu linianek szczura.
Kolumn chromatograficzn przepłuka 40 ml buforu wyj ciowego zbieraj c 20 frakcji po 2
ml. Nastepnie nało y na kolumn eluent i zamkn j na 15 min. Elucj prowadzi zbieraj c
8 frakcji po 2 ml. Przepłuka kolumn buforem wyj ciowym. Detekcj białka w poszczegól-
nych frakcjach wykona w spektrofotometrze Bio-Rad, przy długo ci fali
λ = 280nm,
pobieraj c z ka dej frakcji obj to 0,9 ml. Frakcje eluatu zawieraj ce białko poł czy i
2
oznaczy st enie białka metod Bradforda oraz aktywno enzymatyczn
N-acetyloheksozaminidazy.
Opracowanie wyników
Obliczy st enie białka oraz aktywno enzymatyczn i aktywno wła ciw
N-acetyloheksozaminidazy w homogenacie linianek szczura i w eluacie. Wyznaczy
współczynnik oczyszczenia enzymu (iloraz aktywno ci wła ciwej enzymu w eluacie
i aktywno ci wła ciwej enzymu w próbce nakładanej).
WYZNACZANIE ST
ENIA BIAŁKA. METODA BRADFORDA.
Odczynniki:
• odczynnik Bradforda
• roztwór wzorcowy białka (BSA) o st eniu 0,5 µg/µl
• H
2
O 3 x dest.
Sprz t laboratoryjny:
płytka do ELISA, czytnik do ELISA, filtr 595 nm, pipety nastawne, czasomierz
Wykonanie:
odpipetowa do kolejnych dołków płytki do ELISA: 0, 2, 4, 6, 8 i 10
µl roztworu
wzorcowego białka i uzupełni H
2
O 3x dest. do obj to ci 10
µl. Do dwóch oddzielnych
dołków w płytce odpipetowa po 10
µl 100x i 500x rozcie czonego homogenatu linianek
oraz do dwóch kolejnych dołków odpipetowa po 10
µl nierozcie czonego eluatu. Do
wszystkich dołków doda po 0,25 ml odczynnika Bradforda i po upływie 5 min odczyta
warto absorbancji przy
λ = 595nm wobec lepej odczynnikowej.
UWAGA !!!
wymagane rozcie czenia nale y wykona nast puj co:
100-krotne rozcie czenie – do 5
µl homogenatu doda 495 µl H
2
O 3x dest., wymiesza
500-krotne rozcie czenie - pobra 20
µl 100 razy rozcie czonego homogenatu i doda 80 µl
H
2
O 3x dest., wymiesza .
Opracowanie wyników:
wykre li krzyw kalibracyjn zale no ci absorbancji od st enia białka wyra onego w
µg/10µl. Odczyta st enie białka w homogenacie i eluacie (uwzgl dniaj c ewentualne
rozcie czenie). Obliczy rednie st enie białka w homogenacie i eluacie.
3
Krzywa kalibracyjna:
A
595
St enie białka
c
[
µg/10µl]
Homogenat linianek:
rozcie -
czenie
A
595
st enie białka
c [µg/10µl]
warto rednia
c [mg/ml]
100x
500x
Eluat:
rozcie -
czenie
A
595
st enie białka
c [µg/10µl]
warto rednia
c [mg/ml]
1x
1x
OZNACZANIE AKTYWNO CI ENZYMATYCZNEJ
N-ACETYLO-ββββ-D-GLUKOZAMINIDAZY
N-acetylo-
β-D-glukozaminidaza (EC.3.2.1.30) hydrolizuje wi zanie β-N-acetyloglukoz-
aminylowe (na nieredukuj cym ko cu ła cucha cukrowego) w oligosacharydach takich jak
kwas hialuronowy czy siarczan chondroityny. W celu wyznaczenia aktywno ci N-acetylo-
glukozaminidazy stosuje si substraty syntetyczne: glikozydy np. fenylowe lub p-nitrofenylo-
we.
O
NO
2
O
CH
2
OH
O
OH
NHAc
O
CH
2
OH
OH
HO
NHAc
OH
NO
2
HO
H
2
O
+
p-nitrofenylo-N-acetylo-
β-D-glukozamina
p-nitrofenol
N-acetylo-
β-D-glukozamina
Uwolniony p-nitrofenol wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długo ci
fali
λ = 405 nm.
Odczynniki:
• bufor cytrynianowy – 58 mM kwas cytrynowy, 41mM fosforan sodowy jednozasadowy,
0.1% Triton X-100, pH 4,2
• substrat – 2 mM p-nitrofenylo-N-acetylo-β-D-glukozamina
• stoper – 0,4 M glicyna-NaOH, pH 10,4
4
Sprz t laboratoryjny:
probówki, pipety nastawne, czasomierz, ła nia wodna, statywy, spektrofotometr UV-VIS
Wykonanie:
przygotowa 10-krotne rozcie czenia homogenatu linianek - w tym celu pobra do
oddzielnej probówki 5
µl homogenatu i uzupełni buforem do obj to ci 50 µl. Cało
wymiesza .
Do oddzielnych probówek odpipetowa po 30
µl nierozcie czonego i rozcie czonego
homogenatu oraz 2 razy po 30
µl nierozcie czonego eluatu, a nast pnie doda po 30 µl
substratu i po 100
µl buforu. Inkubowa w temperaturze 37°C przez 10 min. Reakcj
enzymatyczn zatrzyma dodaj c 0,5 ml stopera. Absorbancj przekształconego substratu
mierzy w czytniku do ELISA przy
λ= 405nm wobec lepej odczynnikowej.
Opracowanie wyników:
mno c warto absorbancji przez stał k = 1007 otrzymuje si st enie przekształconego
substratu
s wyra one w nmol/ml. Po uwzgl dnieniu czasu inkubacji t oraz rozcie cze
obliczy warto aktywno ci enzymatycznej
β-N-acetylo-D-glukozaminidazy i wyrazi j w
nkat. Obliczy aktywno wła ciw i wyrazi j w
µkat/kg.
Rozcie -
czenie
A
405
s
[nmol/ml]
t
[min]
Aktywno
enzymatyczna
[nkat]
rednia
warto
aktywno ci
enzymatyczna
[nkat]
1x hom.
10x hom.
1x eluat
1x eluat
Próbka
rednia warto
aktywno ci
enzymatyczna
[nkat]
c
[kg/ml]
Aktywno
wła ciwa
[
µkat/kg]
Wpółczynnik
oczyszczenia
homogenat
eluat
Literatura:
1) „Techniki bada fizjologicznych” (red. A. Lity ska, M.H. Lewandowski), str. 75-85.