Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 3

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

1

Ćwiczenie 3

Temat: WPŁYW STĘŻENIA SUBSTRATU I OBECNOŚCI INHIBITORÓW

NA SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ.

WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA K

M

.

Część teoretyczna

Szybkość reakcji chemicznej jest w każdej chwili proporcjonalna do stężenia substancji re-

agujących i oznacza stosunek przyrostu stężenia produktu reakcji (lub ubytku substratu) do czasu, w
którym ten przyrost (ubytek) nastąpił. Miarą szybkości w danym momencie jest więc przyrost stę-
żenia produktu (lub ubytek stężenia substratu), jaki by nastąpił w jednostce czasu, gdyby szybkość
reakcji w tym okresie była niezmienna. Wobec tego, że szybkość ta się zmienia (maleje wskutek
wyczerpywania się reagujących substancji), przyrosty czasu, w którym mierzone są stężenia, po-
winny być możliwie krótkie.

Przy stałym stężeniu enzymu szybkość reakcji enzymatycznej zależy w pewnych granicach

od stężenia substratu. Przy bardzo niskim stężeniu substratu szybkość reakcji zależy liniowo
(wprost proporcjonalnie) od tego stężenia (reakcja rzędu I). Przy bardzo wysokich - w stosunku do
stężenia enzymu - stężeniach substratu szybkość reakcji ma wartość maksymalną i niezależną od
dalszego zwiększania stężenia (reakcja rzędu 0). Przy pośrednim stężeniu substratu mamy do czy-
nienia z reakcją rzędu ułamkowego. Takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga
wartość równą połowie szybkości maksymalnej (1/2 V

max

), wyrażone w molach na dm

3

ewentualnie

w gramach na dm

3

- określa się mianem stałej Michaelisa-Menten (K

m

). Im mniejszego potrzeba

stężenia substratu (S) aby uzyskać szybkość reakcji równą 1/2 V

max.

, tym mniejsza jest wartość K

m

i

tym większe powinowactwo enzymu do substratu, będące odwrotnością stałej Michaelisa,
(1/K

m

).

Wyznaczenie wartości K

m

pozwala określić stopień powinowactwa różnych enzymów i róż-

nych substratów. Dla reakcji hamowanych można tym sposobem określić charakter i intensywność
inhibicji. W przypadku inhibicji kompetycyjnej (współzawodniczącej) wartość K

m

będzie większa

(mniejsze powinowactwo enzymu do substratu) niż w reakcji niehamowanej, a szybkość maksy-
malna reakcji nie ulegnie zmianie. Natomiast w przypadku reakcji hamowanej niekompetycyjnie
(niwspółzawodnicząco) wartość K

m

pozostanie bez zmian, obniżeniu ulegnie natomiast szybkość

maksymalna takiej reakcji. Jeżeli wzrostowi stałej Michaelisa-Menten będzie towarzyszył jedno-
cześnie spadek szybkości reakcji enzymatycznej to mamy do czynienia z inhibicją o charakterze
mieszanym. Substancje zmniejszające szybkość reakcji enzymatycznej (hamujące) nazywane są in-
hibitorami. Inhibitory enzymów należą do narkotyków, środków konserwujących, różnego rodzaju
trucizn i toksyn. Inhibitorami są również związki tworzące kompleksy z metalami będącymi częścią
centrum katalitycznego lub biorącymi udział w procesie katalitycznym. Należą tu np. cyjanki,
azydki, H

2

S i CO, które upośledzają oddychanie komórkowe, hamując większość oksydaz z Fe lub

Cu w grupie czynnej. Na zasadzie inhibicji kompetycyjnej działa także wiele leków stosowanych
np. w leczeniu hipercholesterolemii i AIDS.

Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 3

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

2

Część praktyczna

1. WYZNACZANIE V

MAX

, K

M

I TYPU INHIBICJI DLA REAKCJI HYDROLIZY

SACHAROZY PRZEZ INWERTAZĘ DROŻDŻOWĄ.

Inwertaza (sacharaza, -fruktofuranozydaza) należy do hydrolaz katalizujących rozszczepia-

nie wiązań -glikozydowych w cząsteczkach sacharozy z uwolnieniem cząsteczek glukozy i frukto-
zy. Sacharoza jest -D-glukopiranozylo- -fruktopiranozydem, jej hydroliza może więc dotyczyć
dwóch różnych wiązań glikozydowych: -glukopiranozydowego (od strony pierścienia glukozy)
lub -fruktofuranozydowego (od strony pierścienia fruktozy).

Rzeczywiście wydzielono dwie grupy inwertaz posiadające zdolność katalizowania jednej lub

drugiej reakcji. Inwertaza izolowana z drożdży piekarskich jest -fruktozydazą, tzn. katalizuje hy-
drolizę fruktozydów, a glikozydy nie ulegają jej działaniu. Hydrolizę sacharozy nazywa się inwersją
i stąd nazwa enzymu – inwertaza. Katalizowaną przez inwertazę reakcję inwersji sacharozy wyko-
rzystuje się na skalę przemysłową do otrzymywania „cukru inwertowanego”, będącego namiastką
miodu (miód pszczeli jest mieszaniną fruktozy i glukozy). Optymalne pH działania inwertazy wy-
nosi około 5,0 a przy pH równym 10 enzym ten jest już zupełnie nieaktywny. Aktywność inwertazy
można mierzyć metodą redukcyjną, ponieważ w miarę postępowania hydrolizy sacharozy wzrasta
stężenie cukrów redukujących. Pozwala to wyznaczyć szybkości początkowe reakcji przy różnych
stężeniach substratu (sacharozy) i z wykresu Michaelisa-Menten lub Lineweavera-Burka wyzna-
czyć stałą Michaelisa. Inhibitorami aktywności katalitycznej inwertazy są np. glicerol, mocznik,
AgNO

3

.

Odczynniki:

0,1 mg% roztwór inwertazy drożdżowej w 0,05 M buforze cytrynianowym o pH 5,2
0,5%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8% i 12%, roztwór sacharozy w 0,05 M buforze cytrynianowym o

pH 5,2

wzorcowy roztwór glukozy o stężeniu 12 mg%, z którego należy sporządzić wzorce o stęże-
niach: 0 mg%, 6 mg% i 12 mg%, to znaczy rozlać do probówek:

0 mg% - 2 ml

wody destylowanej

6 mg% - 1 ml

wody destylowanej + 1 ml

glukozy 12 mg%

12 mg% - 2 ml glukozy 12 mg%

odczynniki do metody Somogyi–Nelsona

1 M roztwór mocznika w 0,05 M buforze cytrynianowym o pH 5,2

Postępowanie:

Przygotować trzy szeregi po 5 probówek. Do pierwszych dwóch szeregów probówek odmie-

rzyć po 1 ml przygotowanych uprzednio roztworów substratu (sacharozy), zaczynając od najniższe-
go stężenia, a więc 0,5%, a kończąc na najwyższym czyli 6%. Pierwszy z tych szeregów będzie sta-
nowił serię kontrolną, a drugi serię prób właściwych. Do trzeciego szeregu probówek rozlać naj-
pierw po 0,5 ml roztworu mocznika (inhibitora), a następnie po 0,5 ml odpowiednich roztworów
sacharozy, zaczynając od stężenia 1% a kończąc na stężeniu 12% (patrz poniższa tabela!!). Szereg
ten będzie stanowił próby właściwe z inhibitorem.

rodzaj prób

stężenie substratu

próby kontrolne

0,5%

1%

2%

4%

6%

próby właściwe

0,5%

1%

2%

4%

6%

właściwe z inhibitorem

1%

2%

4%

8%

12%

Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 3

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

3

a) próby właściwe bez inhibitora i z inhibitorem: wstawić do łaźni wodnej o tempera-

turze 30

o

C (± 0,1

o

C) na ok. 3 minuty w celu dogrzania. Następnie dodawać do nich w

odstępach trzydziestosekundowych (ze stoperem ) po 1 ml roztworu enzymu - inwer-
tazy, wymieszać przez wstrząsanie i inkubować przez dokładnie 10 minut w łaźni
wodnej o temp. 30

o

C. Reakcję przerywać dodając do każdej probówki (zachowując

kolejność i odstępy czasowe) po 2 ml miedziowego odczynnika Somogyi. Wyjąć pro-
bówki z łaźni i wymieszać.

b) serie kontrolne: dodawać najpierw 2 ml

miedziowego odczynnika Somogyi a później

1 ml roztworu enzymu i dobrze wymieszać. Inkubacja przez 10 minut nie jest tu po-
trzebna.

c) wzorce glukozy: należy także dodać po 2 ml

odczynnika Somogyi.

d) Oznaczanie cukrów redukujących metodą Somogyi – Nelsona,

Ustawić na statywie metalowym probówki z próbami właściwymi (z inhibitorem

i bez), kontrolnymi i wzorcami glukozy. Wstawić statyw na wrzącą łaźnię wodną i go-
tować przez 10 minut (stoper). Po ostudzeniu dodawać po 2 ml odczynnika arseno-
molibdenowego, intensywnie wstrząsając probówki aż do całkowitego rozpuszczenia
osadu i wypienienia roztworu. Następnie zawartość probówek uzupełnić do kreski
wodą destylowaną i dobrze wymieszać zatykając probówki korkiem. Odczytać absor-
bancję wszystkich prób na spektrofotometrze przy długości fali 500 nm. Barwa roz-
tworu po rozcieńczeniu jest trwała przez około 45 minut.

e) Opracowanie wyników.

Ilość cukrów redukujących, w przeliczeniu na glukozę, odczytać z krzywej

wzorcowej. Wyniki przedstawić graficznie. Sporządzić krzywą wysycenia enzymu
substratem tj. zależność V = f (S), gdzie: V = ilość glukozy wytworzona w ciągu 15
minut inkubacji, S = stężenie substratu (sacharozy)

Wyznaczyć szybkość maksymalną (V

max

) i stałą Michaelisa–Menten (K

m

) dla

reakcji hydrolizy sacharozy w obecności inhibitora i bez inhibitora.

Ostatnie zmiany: 13.02.2013