Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz
modyfikowania

1

ĆWICZENIE Nr 1

FERMENTACJA MLEKOWA

UWAGA: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz na kontakt z materiałem biologicznym, studenci

zobowiązani są używać fartuchów i rękawiczek jednorazowych.

Fermentacja mlekowa jest mikrobiologicznym, beztlenowym procesem przemiany

cukrów do kwasu mlekowego. Wywoływana jest przez bakterie fermentacji mlekowej w

mleku i jego przetworach oraz w kiszonych warzywach. Substratem dla tej fermentacji jest

glukoza i inne heksozy oraz laktoza jako główny węglowodan mleka.

Bakterie fermentacji mlekowej zaliczane są do rodzajów: Lactobacillus, Lactococcus,

Bifidobacterium, Propionibacterium. Są to Gram-dodatnie nie przetrwalnikujące ziarniaki lub

pałeczki bez zdolności do ruchu. Biorąc pod uwagę zdolność bakterii mlekowych do

przeprowadzania fermentacji różnych cukrów i wytwarzania różnych produktów końcowych,

można podzielić je na trzy grupy:

•

BAKTERIE

HOMOFERMENTACYJNE

–

bakterie

właściwej

fermentacji mlekowej. Wykorzystują cukry proste i dwucukry. Wytwarzają

niemal wyłącznie kwas mlekowy jako końcowy produkt przemiany materii.

Przedstawicielami tej grupy są:

-

Lactococcus lactis subsp. lactis - występuje w mleku surowym

-

Lactococcus lactis subsp. cremoris - występuje w ukwaszonej śmietanie

-

Lactobacillus casei – obecny w mleku i dojrzewających serach

-

Lactobabacillus plantarum- czynny podczas zakiszania kapusty i ogórków

•

BAKTERIE HETEROFERMENTACYJNE – bakterie właściwej

fermentacji mlekowej. Oprócz heksoz, przeprowadzają fermentację pentoz,

wytwarzają obok kwasu mlekowego (50% końcowych produktów

metabolizmu) kwas octowy, etanol, CO

2

, glicerol, mannitol. Są to bakterie z

rodzaju Leuconostoc.

-

Leuconostoc mesenteroides – powoduje śluzowacenie słodkich napojów i

fermentujących warzyw

-

Leuconostoc cremoris – wytwarza kwas octowy i CO

2

, stosowany do

ukwaszania śmietany

Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz
modyfikowania

2

-

Lactobacillus brevis – występuje w mleku, serach i kiszonkach

-

Lactobacillus fermenti – występuje w zalewie kiszonych ogórków i kapusty

-

Bifidobacterium bifidum – ściśle beztlenowa bakteria, stanowiąca większość

mikroflory jelita grubego niemowląt karmionych mlekiem matki oraz do 50%

tejże mikroflory u dzieci i dorosłych. Wytwarza kwas

L

(+)-mlekowy, dzięki

czemu ma duży wpływ na prawidłowe funkcjonowanie przewodu

pokarmowego

•

BAKTERIE PSEUDOMLEKOWE – są to bakterie zakażające różne

produkty (wino, piwo). Mogą powodować np. obniżenie zawartości kwasu

jabłkowego w winach, zamieniając go w kwas mlekowy z wydzieleniem CO

2

(tzw. odkwaszanie win). Należą tu m.in. Bacterium gracile i Bacterium

mannitopem.

Bakterii mlekowych używa się w przemyśle owocowo - warzywnym do kiszenia

ogórków, kapusty i innych warzyw; w rolnictwie do otrzymywania kiszonek paszowych. W

mleczarstwie w produkcji masła, serów i napojów mlecznych; zsiadłe mleko zawiera 0,8-2%

kwasu mlekowego, stosuje się tu bakterie kwaszące i aromatyzujące: L. lactis, L. cremoris;

jogurt – szczepionka jogurtowa zawierająca w proporcji 1:1 lub 1:2 Lactobacillus bulgaricus i

Streptococcus termophilus; kefir – napój lekko musujący zawierający 0,1-0,8% alkoholu. Do

jego otrzymywania stosuje się „grzybki kefirowe”, w skład wchodzą liczne bakterie: L. lactis,

L. cremoris, L. diacetilactis, L. brevis, L. casei oraz Candida kefir, Saccharomyces

florentinum, Torula kefir. Należy zauważyć, że kwas mlekowy jest właściwie jedynym

kwasem powstającym fermentacji mlekowej znajdującym się w wyżej wymienionych

produktach.

Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz
modyfikowania

3

1. Oznaczanie ogólnej liczby bakterii w mleku metodą próby reduktazowej

Metoda ta stosowana jest w mleczarstwie do oznaczanie ogólnego zakażenia mleka.

Drobnoustroje obecne w mleku zużywają zawarty w nim tlen, w skutek czego obserwuje się

stopniowy spadek potencjału oksydoredukcyjnego. Wzrasta jednocześnie zapotrzebowanie na

akceptor wodoru, jakim jest tlen rozpuszczony w mleku. Dodany do mleka błękit metylenowy

stanowi akceptor wodoru. Po wyczerpaniu tlenu zawartego w mleku związki te zmieniają

barwę wraz ze zmiana potencjału. Błękit metylenowy w postaci zredukowanej przechodzi w

bezbarwna postać leukozwiązku. Szybkość zużycia tlenu, związana z odbarwieniem błękitu

metylenowego, zależy od liczby drobnoustrojów w mleku, ich rodzaju, zdolności

redukujących, stanu fizjologicznego i obecności w mleku substancji hamujących np.

antybiotyków. Próby te pozwalają na wykrywanie bakterii mlekowych i E. coli. Ocena mleka:

mleko surowe nie może zawierać więcej niż 1,2·10

5

bakterii w jednym ml. Miano coli nie

może być niższe od 0,1. Ogólna liczba bakterii w mleku pasteryzowanym butelkowym nie

może przekroczyć 2·10

5

w 1 ml.

Wykonanie:

a) Do 10 ml kefiru, zsiadłego mleka, świeżego mleka oraz jogurtu naturalnego dodać 0,5 ml

wodno-etanolowego roztworu błękitu metylenowego

b) Próby inkubować w temp. 37

o

C bez dostępu światła i zanotować czas odbarwienia.

c) Odczyt wyników wg Jensena: jeżeli w 1ml mleka znajduje się:

< 10

5

– czas odbarwienia trwa ponad 7 godzin

5·10

5

– czas odbarwienia: ponad 5 godzin

5-40·10

5

– odbarwienie w ciągu 2-5 godzin

40-200·10

5

– czas odbarwienia: od 20 minut do 2 godzin

Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz
modyfikowania

4

2. Przygotowanie hodowli fermentacyjnej oraz wyznaczanie stężenia kwasu mlekowego

a) Przygotować pożywkę hodowlaną:

Do kolby miarowej o pojemności 1000ml dodać:

•

Ekstrakt drożdżowy 5.0 g;

•

Pepton: 10.0 g;

•

Glukoza: 20.0 g;

•

KH

2

PO

4

: 0.5 g;

•

K

2

HPO

4

:

0.5 g;

•

FeSO

4

·

7H

2

O: 10.0 mg;

•

MgSO

4

·

7H

2

O 200.0 mg;

•

MnSO

4

·

H

2

O: 7.5 mg;

•

Octan sodu: 20.0 g;

•

Laktoza 10.0 g;

Doprowadzić pH pożywki do 5,2 za pomocą H

2

SO

4

lub NaOH i zautoklawować

(temp. 121

o

C, czas ok. 45Min)

b) Do dwóch kolb płaskodennych o pojemności 250ml wprowadzić po 100ml pożywki.

Medium w kolbie pierwszej inokulować 1ml przygotowanych kultur bakteryjnych

(Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus,

zawiesina A), natomiast do drugiej dodać 1ml zawiesiny kultur bakteryjnych B

(Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus kefyr, Klyveromyces

marxianus, Saccaromyces unisporus, zawiesina B).

c) Hodowlę prowadzić w temp. 30

o

C; po 24, 48 i 96h pobrać po 22ml mieszaniny,

uzyskane próbki odwirować (10 min, 5000 rpm), a supernatant pozostawić do dalszej

analizy.

d) 10ml supernatantu miareczkować 0,2 M NaOH wobec fenoloftaleiny. Wszystkie

miareczkowania wykonać dwukrotnie.

e) Oznaczona kwasowość ogólna przeliczyć na ogólną ilość kwasu mlekowego i jego

stężenie, wykonać wykres zależności stężenia kwasu mlekowego od czasu i uzasadnić

wyniki.

Własność T. Ruman i K. Lecka-Szlachta. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz
modyfikowania

5

Odczynniki:

-

Wodno-etanolowy roztwór błękitu metylenowego (5ml nasyconego alkoholowego roztworu błękitu

metylenowego w zmieszanego z 195ml wody destylowanej)

-

Pożywka hodowlana: w 1000ml roztworu znajduje się: ekstrakt drożdżowy: 5.0 g; pepton: 10.0 g;

glukoza: 20.0 g; KH

2

PO

4

: 0.5 g; K

2

HPO

4

:

0.5 g; FeSO

4

·

7H

2

O: 10.0 mg; MgSO

4

·

7H

2

O 200.0 mg;

MnSO

4

·

H

2

O: 7.5 mg; octan sodu: 20.0 g; laktoza 10g

-

Próbki kefiru, zsiadłego mleka, świeżego mleka oraz jogurtu naturalnego

-

Zawiesina A: kultury Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus;

-

Zawiesina B: kultury Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus kefyr, Klyveromyces

marxianus, Saccaromyces unisporus.

-

0,2M NaOH

-

0,2M H

2

SO

4

-

Fenoloftaleina (roztwór 2% w etanolu)