1

Antybiotyki i chemioterapeutyki

1. Podział ogólny preparatów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym

Antybiotyk to substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, wytwarzana przez mikroorganizmy
(bakterie, grzyby) lub uzyskana na drodze półsyntetycznej lub syntetycznej, mająca swój naturalny wzorzec.

Chemioterapeutyk to substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, uzyskana na drodze syntezy
chemicznej, nie posiadająca naturalnego wzorca.

Antybiotyki

Chemioterapeutyki

naturalne

półsyntetyczne syntetyczne

syntetyczne

metabolity naturalny produkt syntetyczne odtworzenie preparaty nie posiadające
drobnoustrojów wyjściowy - struktury naturalnej naturalnego wzorca
pochodne w przyrodzie
uzyskane drogą
chemicznej modyfikacji

2. Grupy chemiczne antybiotyków i chemioterapeutyków

Grupa chemiczna

Podgrupa

Przedstawiciel

β - laktamy

Penicyliny naturalne

penicylina benzylowa,
penicylina fenoksymetylowa

Penicyliny aktywne wobec
penicylinazo (+) szczepów
gronkowców,

w tym penicyliny izoksazolilowe

nafcylina, metycylina (nie
stosowana),

oksacylina, kloksacylina,
dikloksacylina, flukloksacylina

Penicyliny półsyntetyczne

(szerokowachlarzowe):

- aminopochodne:

- karboksypochodne:

– ureidopochodne:

- piperazynowo pochodne:

ampicylina, amoksycylina

karbenicylina, tikarcylina

azlocylina, mezlocylina

piperacylina

Połączenie penicylin z
inhibitorami β - laktamaz

ampicylina + sulbaktam =
Unasyn

amoksycylina + kwas
klawulanowy = Augmentin

tikarcylina + kwas
klawulanowy = Timentin

piperacylina + tazobaktam =
Tazocin

Cefalosporyny (I, II, III, IV
generacja)

I - cefazolina, cefradyna,

cefalotyna, cefaleksyna,
cefadroksyl

II - cefuroksym, cefamandol,
cefaklor, cefprozil, cefoksytyna

III - ceftazydym, cefoperazon,
ceftriakson, cefotaksym,

2

cefiksym, cefetamet, ceftibuten,
moksalaktam

IV - cefepim

Monobaktamy

aztreonam

Karbapenemy

imipenem, meropenem,
doripenem, ertapenem

Makrolidy

Stara generacja

erytromycyna C

14

Makrolidy

Nowa generacja

roksytromycyna C

14

,

klarytromycyna C

14

,

oleandomycyna C

14

,

azytromycyna C

15

, josamycyna

C

16

,

spiramycyna C

16

Ketolidy

trolitromycyna

Linkozamidy

-

linkomycyna, klindamycyna

Tetracykliny

-

tetracyklina, doksycyklina,
minocyklina

Aminoglikozydy

Naturalne

streptomycyna, neomycyna,
kanamycyna, gentamycyna,
tobramycyna, sisomycyna

Półsyntetyczne

netylmycyna, amikacyna

Streptograminy

Grupa A

pristinamycyna IIA i IIB –
półsyntetyczne pochodne
chinupristina, dalfopristina

Grupa B

Pristinamycyna IA i
wirginamycyna S1

Oksazolidynony

-

linezolid

Glikopeptydy

-

wankomycyna, teikoplanina

Lipopeptydy

-

daptomycyna

Chloramfenikol

-

chloramfenikol

Polimiksyny

-

kolistyna

Ryfamycyny

-

ryfampicyna

Chinolony

Stare

kwas nalidyksowy, kwas
pipemidynowy

Nowe - fluorochinolony

ciprofloksacyna, ofloksacyna,
norfloksacyna, pefloksacyna,
lewofloksacyna, enoksacyna

Nitrofurany

-

Nitrofurantoina, furagin,
nifuroksazyd

Nitroimidazole

-

Metronidazol, ornidazol

Sulfonamidy

-

sulfametoksazol

Leki przeciwgrzybicze

Polieny

nystatyna, natamycyna,
amfoterycyna B

Azole

flukonazol, ketokonazol,
ekonazol, mikonazol, tiokonazol,
itrakonazol, klotrimazol,
terkonazol, worikonazol

Antymetabolity

5-fluorocytozyna

Echinokandyny

kapsifungina

Leki przeciwwirusowe

-

acyklowir, zydowudyna,
gancyklowir, lamiwudyna,
rybawiryna, widarabina,
amantadyna, didanozyna,
foskarnet, interferon,
delawirdyna, zanamiwir,
sakwinawir, ritonawir, indinawir,
nelfinawir

3

3. Mechanizm, sposób i spektrum działania antybiotyków i chemioterapeutyków



Mechanizm działania

- blokowanie biosyntezy ściany komórkowej

antybiotyki β-laktamowe: penicyliny, połączenie penicylin z inhibitorami β-laktamaz,
cefalosporyny, monobaktamy, karbapenemy;
glikopeptydy
fosfomycyna
bacytracyna

- uszkodzenie błony protoplazmatycznej

polimiksyny

leki przeciwgrzybicze

- blokowanie biosyntezy białka

makrolidy

ketolidy

linkozamidy

streptograminy

aminoglikozydy

tetracykliny

oksazolidynony

chloramfenikol

kwas fusydowy

- blokowanie syntezy DNA

chinolony

nitroimidazole

nitrofurany

ryfamycyny

kotrimoksazol

leki przeciwwirusowe

- konkurencyjne wnikanie w łańcuch metaboliczny

sulfonamidy

Penicyliny i cefalosporyny
– wiążą i unieczynniają tzw. białka wiążące penicyliny PBP (penicillin binding proteins): transpeptydazę,
karboksypeptydazę i inne enzymy związane z syntezą ściany komórkowej. Unieczynnienie transpeptydazy
hamuje wiązanie krzyżowe peptydoglikanu, a przez to ściany komórkowej.
Wankomycyna, cykloseryna, bacytracyna
– hamują polimeryzację peptydoglikanu (syntezę ściany komórkowej) poprzez wiązanie się z peptydami
zawierającymi D-alanylo-D-alaninę.
Ryfampicyna
– inhibitor transkrypcji RNA – unieczynnia polimerazę RNA zależną od DNA
Chinolony
– hamują bakteryjną gyrazę DNA (topoizomerazę II lub topoizomerazę IV) prowadząc do zahamowania
replikacji DNA
Chloramfenikol, makrolidy, linkozamidy, streptograminy
– wiążą się z podjednostką 50S rybosomu, hamują peptydylotransferazę, prowadząc do przedwczesnego
zakończenia tworzenia łańcuchów peptydowych.
Aminoglikozydy
– wiążą się z jednostką 30S rybosomu bakteryjnego tworząc kompleks 30S-50S, blokują miejsca inicjujące
syntezę kwasów nukleinowych lub zaburzają tripletowe kodowanie mRNA. W konsekwencji bakterie stają się
niezdolne do syntezy łańcucha peptydowego.
Tetracykliny
- wiążą się z jednostką 30S rybosomu bakteryjnego, blokują wiązanie tRNA z kompleksem rybosom-mRNA,
hamują wydłużanie peptydów.
Sulfonamidy, trimetoprim
– blokują aktywność syntetazy dihydropterynianu i reduktazy dihydrofolianu, hamując syntezę nukleotydów.
Oksazolidynony
– miejscem ich działania są obie podjednostki rybosomalnego DNA. Hamują syntezę białka komórkowego
poprzez blokowanie translokacji tRNA. Tworzący się łańcuch peptydowy ulega znacznemu skróceniu.

4



Sposób działania

Antybiotyki mogą wykazywać działanie bakteriobójcze lub bakteriostatyczne. Miarą aktywności
bakteriobójczej antybiotyku jest najmniejsze stężenie bakteriobójcze MBC (Minimal Bactericidal
Concentration). MBC określa minimalne stężenie leku (mg/l lub μg/ml), oznaczone w warunkach in vitro, przy
którym ginie 99,9% komórek bakteryjnych przy określonej gęstości inokulum, w określonym czasie.
Najmniejsze stężenie hamujące MIC (Minimal Inhibitory Concentration) określa aktywność bakteriostatyczną
antybiotyku. MIC to najmniejsze stężenie leku (mg/l lub μg/ml), oznaczone w warunkach in vitro, hamujące
wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum, w określonym czasie.
Za bakteriobójcze uważa się te preparaty, dla których stosunek wartości MBC/MIC jest mniejszy lub równy 4.
Antybiotyki o wysokiej aktywności bakteriobójczej charakteryzują się zbliżoną wartością MBC do wartości
MIC.

działanie bakteriobójcze

działanie bakteriostatyczne

↓

↓

↓

efekt zależny

efekt zależny

zahamowanie wzrostu

od maksymalnego od czasu, w którym stężenie

↓

stężenia

przekracza wartości MIC

↓

↓

- aminoglikozydy

- β-laktamy

- chloramfenikol

- chinolony

- makrolidy/ketolidy

- linkozamidy

- tetracykliny

- trimetoprim

- sulfonamidy



Zakres działania

Leki przeciwbakteryjne mogą wykazywać wąskie spektrum działania ograniczone do jednej grupy lub
jednego typu drobnoustrojów (np. Gram-ujemne lub Gram-dodatnie) lub szerokie spektrum działania
obejmujące swoją aktywnością bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie, a czasem również beztlenowce.

Podział antybiotyków w zależności od spektrum działania

Typ drobnoustrojów

Aktywne antybiotyki

Bakterie Gram-dodatnie

Penicylina G, penicylina fenoksymetylowa, glikopeptydy,
makrolidy, linkozamidy, kwas fusydowy, linezolid
(oksazolidynony)

Bakterie Gram-ujemne

Aztreonam (monobaktamy)

Bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne

Penicyliny półsyntetyczne, cefalosporyny, aminoglikozydy,
chinolony, tetracykliny, kotrimoksazol

Bakterie beztlenowe (+/- tlenowe)

Linkozamidy,

metronidazol,

chloramfenikol,

penicyliny/inhibitor, cefoksytyna/cefotetan

Bakterie atypowe

Makrolidy/ketolidy, streptograminy, tetracykliny, chinolony,
ryfampicyna, kotrimoksazol

4. Metody oznaczania wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki w oparciu o zalecenia

EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility).

Określenie wrażliwości drobnoustroju na antybiotyki i chemioterapeutyki związane jest z poznaniem i

zdefiniowaniem podstawowych pojęć. Zalecenia EUCAST wprowadzają dwie kategorie wartości granicznych:

- kliniczne wartości graniczne służące do przewidywania możliwości osiągnięcia sukcesu terapeutycznego -

informacja dla lekarzy

- epidemiologiczne wartości graniczne (określane w skrócie ECOFF) stosowane do monitorowania zmian w

oporności populacji danego gatunku drobnoustrojów izolowanych z materiałów klinicznych - ważne narzędzie
dla mikrobiologów i zespołów zakażeń szpitalnych.

5

Kliniczne wartości graniczne są zdefiniowane następująco:

- wrażliwość kliniczna – oznacza wrażliwość drobnoustroju na standardowe dawki leku i wysokie
prawdopodobieństwo sukcesu terapeutycznego. Na skuteczność kliniczną, oprócz wrażliwości drobnoustroju na
dany antybiotyk in vitro, ma wpływ szereg czynników: właściwości farmakokinetyczne i farmakodynamiczne
stosowanego leku przeciwdrobnoustrojowego oraz aktywność układu immunologicznego pacjenta.
- kliniczna średnia wrażliwość – oznacza, że szczep mieści się w zakresie wartości MIC pomiędzy wrażliwym
a opornym; efekt terapeutyczny jest niepewny, ale może zostać osiągnięty, jeśli zakażenie przebiega z taką
lokalizacją, gdzie lek jest fizycznie zagęszczany (np. układ moczowy) lub jest możliwość podania wysokich
dawek leku.
- oporność kliniczna – oznacza wysokie prawdopodobieństwo niepowodzenia terapeutycznego, nawet w
przypadku zastosowania wysokich dawek leku.

Epidemiologiczne wartości graniczne (ECOFF) wynikają z zebrania wyników oznaczeń lekowrażliwości

pochodzących z różnych lat i z różnych ośrodków zajmujących się monitorowaniem lekowrażliwości
drobnoustrojów i analizy rozkładu wartości MIC dla poszczególnych antybiotyków i poszczególnych gatunków
drobnoustrojów. Oddzielają one populacje „szczepów dzikich”, czyli szczepów bez nabytych mechanizmów
oporności, wykazujących „oporność mikrobiologiczną” na dany antybiotyk.

Szczep dziki (ang. wild type WT) – szczep należący do najbardziej wrażliwej populacji, nie posiadający

nabytego drogą transferu horyzontalnego lub mutacji mechanizmu oporności na dany lek; klinicznie może nie
odpowiadać na leczenie danym lekiem ze względu na naturalną oporność; jest charakteryzowany przez
zastosowanie odpowiedniego, fenotypowego punktu odcięcia wartości MIC dla danego gatunku.

Oporność mikrobiologiczna (ang. Non-Wild Type NWT)) – szczep „nie-dziki” to szczep posiadający

nabyte drogą transferu lub mutacji mechanizmy oporności na dany lek; jest charakteryzowany poprzez
zastosowanie odpowiedniego, fenotypowego punktu odcięcia wartości MIC dla danego gatunku; szczep taki w
niektórych przypadkach może odpowiadać na leczenie danym lekiem jeśli wykazuje wartości MIC w zakresie
klinicznej wrażliwości.

Oporność krzyżowa – oznacza niewrażliwość na wszystkie lub niektóre antybiotyki należące do tej samej
grupy chemicznej (np. antybiotyki β-laktamowe, aminoglikozydy, makrolidy) lub czasem nie spokrewnionej
grupy chemicznej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków znajdują się blisko siebie (np. oporność na makrolidy
i linkozamidy). Mechanizmy oporności wynikające z braku przepuszczalności błony komórkowej lub
aktywnego wypompowywania leku z komórki mogą powodować oporność na więcej niż jedną grupę
chemiczną, zjawisko to jest niekiedy określane jako oporność skojarzona.

A. Metody jakościowe oznaczania lekowrażliwości bakterii

a) metoda dyfuzyjno-krążkowa

Oznaczenie wykonywane jest:

 dla pałeczek Enteobacteriaceae, pałeczek niefermentujących (Pseudomonas

spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia), Staphylococcus spp.,
Enterococcus spp. na podłożu Mueller-Hinton (MH)

 dla drobnoustrojów o szczególnych wymaganiach (Streptococcus spp.,

Haemophillus spp., Moraxella catarrhalis) na podłożu Mueller-Hinton z 5%
krwią końską i 20mg/L NAD (MH-F).

Skład podłoża jest ściśle ustalony, a grubość podłoża nie powinna przekraczać 4 mm (na bardzo cienkich
podłożach może wytwarzać się większa strefa zahamowania wzrostu, odwrotnie przy zbyt grubym podłożu).
Podłoże wpływa na wielkość strefy, decydując o stopniu wzrostu, współczynniku dyfuzji i aktywności leku.

Przygotowuje się zawiesinę bakterii o zmętnieniu odpowiadającym bezwzględnie 0,5 jednostki w skali

McFarlanda. W przypadku zbyt małej gęstości zawiesiny strefa zahamowania wzrostu, niezależnie od
wrażliwości mikroorganizmu, będzie większa i oporne szczepy mogą zostać zakwalifikowane jako wrażliwe.
Przy zbyt dużej gęstości zawiesiny, wielkość uzyskanej strefy zahamowania wzrostu będzie mniejsza, a szczepy
wrażliwe mogą zostać zakwalifikowane jako oporne.

Zawiesinę nanosi się na powierzchnię podłoża za pomocą jałowej wymazówki odciśniętej uprzednio o

ścianki probówki w celu usunięcia nadmiaru płynu. Całą powierzchnię agaru pokrywa się zawiesiną, obracając
płytkę trzykrotnie o kąt 60

o

.

6

Na powierzchnię posianego podłoża w ciągu 15 minut nakłada się krążki z antybiotykami (na

posianych płytkach pozostawionych w temperaturze pokojowej dłużej niż podano, przed nałożeniem krążków
dochodzi do namnożenia szczepów i w efekcie strefy zahamowania wzrostu mogą być mniejsze i szczepy mogą
zostać zakwalifikowane jako oporne) w odległości 24 mm jeden od drugiego (najlepiej za pomocą dyspensera,
który ułatwia właściwe rozmieszczenie krążków na podłożu). Na płytce o średnicy 10 cm układa się nie więcej
niż 5 krążków, natomiast na płytce o średnicy 15 cm – 12 krążków. Właściwe rozmieszczenie krążków
zapobiega nakładaniu się stref zahamowania wzrostu lub powstawaniu zniekształceń przy brzegach płytki.
Średnica strefy zahamowania wzrostu zależy od zawartości antybiotyku w krążku. Krążki wymagają
odpowiedniego przechowywania, zgodnie z instrukcją.

Po posiewie przed ułożeniem krążków należy odczekać około 15 minut w celu wysuszenia płytek. Po

15 – minutowej preinkubacji w temperaturze pokojowej, należy rozpocząć inkubację w temperaturze 35

o

C przez

16-18 godzin. WYJĄTEK! Dla cefoksytyny i wankomycyny inkubację prowadzi się pełne 24 godziny.

Miarą wrażliwości badanego szczepu na antybiotyk jest wielkość średnicy strefy zahamowania wzrostu

mierzona z dokładnością do 1 mm przy pomocy cyrkla, linijki lub aparatu do pomiaru stref zahamowania
wzrostu. Strefę zahamowania wzrostu odczytuje się w dziennym świetle przechodzącym (dla cefoksytyny w
świetle odbitym).

Dla prawidłowo wykonanych posiewów uzyskuje się koliste strefy zahamowania wzrostu, a wzrost

bakterii jest równomierny. Korzystając z tablic EUCAST, zawierających wytyczne co do wielkości stref
zahamowania wzrostu dla poszczególnych antybiotyków i drobnoustrojów, należy zakwalifikować badany
szczep jako: wrażliwy (S - susceptible) lub oporny (R – resistant), a dla niektórych antybiotyków i
drobnoustrojów średnio wrażliwy (I - intermediate).

Precyzja i dokładność metody powinny być monitorowane za pomocą programu kontroli jakości.

Okresowo (raz w miesiącu, przy nowej serii krążków) przeprowadza się kontrole wrażliwości dla szczepów
wzorcowych o znanej lekowrażliwości. Uzyskiwanie wyników, które nie mieszczą się w określonym zakresie,
może być efektem błędu technicznego lub użycia niewłaściwych odczynników. Należy sprawdzić każdy
odczynnik i etap badania, odnaleźć i wyeliminować błąd.

Fot.1. Dyspenser (H. Kukuła)

Fot.2. Antybiogram (bioMerieux)

Metoda stężeń granicznych (breakpoint) polega na

zakwalifikowaniu drobnoustroju do jednej z trzech kategorii: wrażliwy, średnio wrażliwy, oporny, na
podstawie zachowania się szczepu wobec dwóch granicznych stężeń antybiotyku. Stężenia graniczne
opisywane są jako c i C, co oznacza niskie i wysokie stężenie antybiotyku. Wzrost szczepu w obecności
niskiego i wysokiego stężenia antybiotyku oznacza, że szczep jest oporny; wzrost tylko w obecności
niskiego stężenia antybiotyku oznacza, że szczep jest średnio wrażliwy; brak wzrostu w obecności

7

niskiego i wysokiego stężenia antybiotyku oznacza, że szczep jest wrażliwy. Badanie można
przeprowadzić w podłożu płynnym lub na podłożu stałym.

b)

Metody ilościowe oznaczania lekowrażliwości bakterii

 - metoda seryjnych rozcieńczeń w podłożu płynnym (makro- i mikrorozcieńczeń)

Metoda ta pozwala na określenie wartości MIC czyli najmniejszego stężenia antybiotyku koniecznego do
zahamowania wzrostu szczepu odpowiedzialnego za zakażenie oraz na oznaczenie najmniejszego stężenia
bakteriobójczego – MBC.

a) klasyczna metoda makrorozcieńczeń

Przygotowuje się serię probówek zawierających taką samą objętość bulionu (minimalna objętość bulionu 2 ml) i
seryjne rozcieńczenie danego antybiotyku. Do każdej probówki z bulionem i odpowiednim rozcieńczeniem
antybiotyku dodaje się jednakową objętość standaryzowanej zawiesiny badanego drobnoustroju. Probówka
kontrolna nie zawiera antybiotyku. Roztwory inkubuje się przez 18-24 godziny. Odczyt polega na obserwacji
zmętnienia w probówkach po zakończonej inkubacji.
W probówkach, w których stężenie antybiotyku jest niższe niż stężenie hamujące, bakterie rosną i
obserwowalne jest zmętnienie. W probówkach, w których stężenie antybiotyku jest równe lub większe od
stężenia hamującego, bulion pozostaje klarowny. Najniższe stężenie, w którym nie obserwuje się wzrostu
określa się jako MIC.

1 dzień

1 ml zawiesiny zawierającej 1 x 10

6

CFU/ml

wprowadzić do każdej probówki z szeregu rozcieńczeń antybiotyku w bulionie

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

→

kontrola

1ml

bulionu

64 μg/ml 32 16 8 4 0
↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
→

kontrola

Teraz probówki zawierają po 2 ml bulionu z antybiotykiem w μg/ml

i bakteriami w liczbie N = 5,0 x 10

5

CFU/ml

2ml

→ 0,5 ml →

32 μg/ml 16 8 4 2 0

0,5 ml z probówki kontrolnej przenieść do 0,5 ml bulionu

Całonocna inkubacja

a następnie 0,001 ml wysiać na

2 dzień

podłoże agarowe

↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
↓
32

MIC = 8 μg/ml

32 μg/ml 16 8 4 2 0

Z probówek nie wykazujących

wzrostu wysiać po 0,1 ml

na podłoże agarowe

0,1ml


250 CFU

Całonocna inkubacja

250 CFU odpowiada 5,0 x 10

5

CFU/ml

3 dzień

N

A

= 7,0 x 10 CFU/ml

MBC = 8 μg/ml

Wartość MBC w podanym przykładzie wynosi 8 μg/ml i jest równa wartości MIC.
Stosunek MBC/MIC = 8μg/ml / 8

μg/ml

= 1

-

taki antybiotyk wykazuje aktywność bakteriobójczą.

8

Metoda makrorozcieńczeń stosowana jest głównie tam, gdzie pojawia się potrzeba wykonania oznaczenia
wrażliwości na pojedynczy antybiotyk dla jednego szczepu.

b) metoda mikrorozcieńczeń – pozwala również na wyznaczenie wartości MIC, ale wykonywana jest na

płytkach titracyjnych, zawierających w studzienkach odpowiednie rozcieńczenia antybiotyku w formie
zliofilizowanej. Objętość bulionu z zawiesiną bakteryjną dodawaną do każdego rozcieńczenia
antybiotyku wynosi 100 μl.

 - metoda seryjnych rozcieńczeń w agarze – pozwala na określenie wartości MIC. W metodzie

tej antybiotyk jest obecny w podłożu agarowym w malejących stężeniach (jedno podłoże - jedno
stężenie antybiotyku), na które posiewa się zawiesinę bakterii o określonym inokulum. Wartość
MIC wyznacza stężenie antybiotyku w podłożu, przy którym brak wzrostu drobnoustrojów.

 - gradient stężeń (E-testy, M.I.C EVALUATOR) - metoda dyfuzyjna pozwalająca na

wyznaczenie wartości MIC antybiotyku. Jest to pasek plastikowy wysycony antybiotykiem w
gradiencie stężeń, który nakłada się na powierzchnię podłoża z wysianym szczepem. Po
inkubacji odczytuje się wartość MIC, którą wyznacza wyraźny punkt przecięcia eliptycznej
strefy zahamowania wzrostu drobnoustrojów z określoną wartością stężenia antybiotyku na
pasku (poza określonymi wyjątkami). Jest to metoda prosta, wygodna, mniej czuła na
niepoprawnie przygotowane inokulum.

Fot.3. E-test (H. Kukuła)

Fot. 4. M.I.C. Evaluator (Oxoid)

Oznaczanie w warunkach in vitro wartości MIC i MBC

pozwala przeprowadzić spekulację – czy stężenie jakie stosowany antybiotyk osiąga w ognisku zakażenia
odpowiada wartości MIC lub MBC w stosunku do drobnoustroju odpowiedzialnego za zakażenie. Stężenie
antybiotyku w surowicy odpowiadające wielokrotności wartości MIC zwiększa prawdopodobieństwo
osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego. Wartość prognostyczną mają także badania, oceniające efekt
bakteriobójczy surowicy chorego, leczonego określonym antybiotykiem lub antybiotykami w skojarzeniu.
Badanie takie ocenia sumę działania bakteriobójczego surowicy i zastosowanego antybiotyku i czasem jest
konieczne do oznaczenia, głównie u chorych z zakażeniami trudnymi do leczenia, np. endocarditis (zapalenie
wsierdzia), osteomyelitis (zapalenie kości i szpiku) lub w przypadku stosowania antybiotyków
charakteryzujących się dużą toksycznością i niewielką różnicą między dawką terapeutyczną a toksyczną
(aminoglikozydy, wankomycyna).

Oznaczenie aktywności bakteriobójczej surowicy chorego

przeprowadza się metodą seryjnych rozcieńczeń. W metodzie tej w dwóch szeregach probówek sporządza się
wzrastające rozcieńczenia antybiotyku wzorcowego i badanego. Jako rozcieńczalnika używa się specjalnego
podłoża bulionowego, umożliwiającego wzrost używanego w badaniach szczepu wzorcowego. Do wszystkich
probówek, z wyjątkiem kontroli, dodaje się zawiesiny wrażliwego szczepu wzorcowego i próbki inkubuje się
przez 16-18 godzin. W probówkach, w których stężenie antybiotyku jest odpowiednio małe, występuje wzrost
drobnoustrojów, natomiast tam, gdzie stężenie antybiotyku jest odpowiednio duże, następuje zahamowanie

9

wzrostu. Znając najmniejsze stężenie hamujące wzrost szczepu wzorcowego przez antybiotyk wzorcowy,
można określić ile antybiotyku znajduje się w 1ml badanej surowicy.

Wykonanie (na przykładzie miareczkowania penicyliny):
- rozlać aseptycznie do 12 probówek po 2 ml jałowego podłoża bulionowego (11 probówka stanowi kontrolę
jałowości bulionu, 12 – kontrolę wzrostu szczepu)
- z probówki zawierającej roztwór penicyliny o stężeniu 2j/ml przenieść pipetą 2 ml do pierwszej probówki;
zmienić pipetę; wymieszać płyn w probówce i przenieść 2 ml roztworu z pierwszej probówki do drugiej;
zmienić pipetę i po wymieszaniu przenieść 2 ml roztworu do trzeciej probówki, itd. aż do ostatniej probówki w
szeregu; z ostatniej probówki po wymieszaniu usunąć 2 ml płynu.
W ten sposób uzyskuje się szereg rozcieńczeń penicyliny. W pierwszej probówce stężenie penicyliny wynosi
1j/ml, w drugiej 0,5j/ml, w trzeciej 0,25j/ml, itd.
- przygotować rozcieńczenie hodowli bulionowej szczepu wzorcowego w bulionie w stosunku 1:1000
- dodać do wszystkich probówek, z wyjątkiem 11, po 2 krople przygotowanej zawiesiny szczepu
- umieścić statyw z probówkami w cieplarce na 16-18 w temperaturze 35

o

C

- w ten sam sposób przygotować rozcieńczenia roztworu o nieznanej zawartości antybiotyku (surowicy) i po
dodaniu szczepu wzorcowego również umieścić w cieplarce
- po zakończeniu inkubacji odczytać wyniki
- obliczyć ile penicyliny (w jednostkach) znajduje się w 1 ml badanego roztworu (surowicy).

Stężenie antybiotyku w badanym roztworze oblicza się przez pomnożenie największego rozcieńczenia
wykazującego brak wzrostu przez stężenie antybiotyku w analogicznym szeregu wzorcowym.

Stężenie
antybiotyku

1

0,5

0,25

0,125

0,0625

0,03125

0,016

0,0078

0,0039

0,00195

j/ml

Kontrola

jałowości

Kontrola

wzrostu

Roztwór
wzorcowy

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

Rozcieńczenie
antybiotyku

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

1:512

1:1024

Kontrola

jałowości

Kontrola

wzrostu

Roztwór
badany

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

-

+

„+” – wzrost „-„ – brak wzrostu
Największe rozcieńczenie nie wykazujące wzrostu w szeregu badanym = 1:256
Najmniejsze stężenie w szeregu z roztworem wzorcowym nie wykazujące wzrostu odpowiada stężeniu
0,0039 j/ml
Stąd: 256 j/ml x 0,0039 j/ml = 0,998 j/ml

10

Część praktyczna

1. Wykonaj badanie wrażliwości na antybiotyki szczepu Escherichia coli metodą dyfuzyjno-

krążkową zgodnie z wytycznymi EUCAST.

Przygotuj zawiesinę bakterii o gęstości 0,5 jMcF w 0,9%

jałowym roztworze NaCl (porównaj zmętnienie z wzorcem). Jałową wymazówkę zanurz w
zawiesinie, odciśnij nadmiar płynu o ściankę probówki, a następnie wykonaj posiew
drobnoustrojów na podłożu Mueller-Hinton (trzy razy obracając płytkę o 60

o

). Odczekaj 15 minut i

nanieś przy pomocy pęsety krążki z antybiotykami, zachowując odległość 24mm między
krążkami. Po 15 minutowej preinkubacji w temperaturze pokojowej, płytki włóż do cieplarki
nastawionej na temperaturę 35

o

C. Takie samo oznaczenie wykonaj ze szczepem wzorcowym

Escherichia coli ATCC 25922. Odczytaj średnice stref zahamowania wzrostu bakterii po 16-18
godzinnej inkubacji.

Wpisz uzyskane średnice do tabeli i zinterpretuj wynik w oparciu o zamieszczone poniżej kryteria
EUCAST.

Antybiotyk/stężenie/skrót

Średnica strefy zahamowania

wzrostu w mm

Interpretacja*

Escherichia coli
ATCC 25922

I

szczep

II

szczep

Escherichia coli
ATCC 25922

I

szczep

II

szczep

Ampicylina 10 μg (AM, AMP)

Amoksycylina/kwas
klawulanowy 20/10 μg (AMC)

Cefuroksym 30 μg (CXM)

Gentamycyna 10 μg (GM)

* O – oporny (resistant) św – średnio wrażliwy (intermediate) W – wrażliwy (susceptible)

Dla szczepu wzorcowego „Z” – wynik zgodny „NZ” – wynik niezgodny z kryteriami


Kryteria interpretacji EUCAST dla szczepu badanego Escherichia coli

Antybiotyk/stężenie/skrót

Średnica strefy zahamowania wzrostu w mm

Wrażliwy

S

średnio

wrażliwy

I

Oporny

R

Ampicylina 10 μg (AM, AMP)

≥14

-

<14

Amoksycylina/kwas klawulanowy 20/10 μg
(AMC)

≥17

-

<17

Cefuroksym 30 μg (CXM)

≥ 18

-

<18

Gentamycyna 10 μg (GM)

≥ 17

14-16

<14

Kontrola jakości oznaczenia lekowrażliwości z zastosowaniem szczepu wzorcowego Escherichia coli
ATCC 25922

Antybiotyk/stężenie/skrót

Escherichia coli ATCC 25922

Średnica strefy zahamowania wzrostu w mm

Ampicylina 10 μg (AM, AMP)

16-22

Amoksycylina/kwas klawulanowy 20/10 μg (AMC)

18-24

Cefuroksym 30 μg (CXM)

20-26

Gentamycyna 10 μg (GM)

19-26

11

2. Odczytaj wartości MIC piperacyliny (antybiotyk β-laktamowy z grupy penicylin

półsyntetycznych) szczepów Escherichia coli pochodzących z różnych materiałów
klinicznych. Badanie zostało wykonane klasyczną metodą makrorozcieńczeń w bulionie
Mueller-Hinton. Wpisz odczytane wartości do tabeli i zinterpretuj wynik.

Materiał

Stężenie piperacyliny (PIP) μg/ml

MIC

szczepu

badanego

Interpretacja

*

MIC

Escherichia

coli

ATCC
25922

Interpretacja**

4

8

16

32

0

(kontrola

)

1. Krew

2. Wymaz z rany oparzeniowej

3. Wydzielina z dolnych dróg
oddechowych

4. Żółć

Wpisz: „+” – wzrost „-„ – brak wzrostu
* O – oporny (resistant) św – średnio wrażliwy (intermediate) W – wrażliwy (susceptible)

** Dla szczepu wzorcowego „Z” – wynik zgodny „NZ” – wynik niezgodny z kryteriami

Kryteria interpretacji EUCAST dla piperacyliny

Wartość MIC piperacyliny w μg/ml

Wrażliwy

S

średnio wrażliwy

I

Oporny

R

Szczep badany
Escherichia coli

≤ 8

16

>16

Escherichia coli ATCC

25922

1- 4

-

-

3. Odczytaj wartości stężeń granicznych piperacyliny dla szczepów Escherichia coli

pochodzących z różnych materiałów klinicznych. Badanie zostało wykonane metodą
makrorozcieńczeń w podłożu agarowym Mueller-Hinton. Wpisz odczytane wartości do
tabeli i zinterpretuj wynik.

Materiał

Stężenie piperacyliny w μg/ml

8

16

0 (kontrola)

Interpretacja*

1. Krew

2. Wymaz z rany
oparzeniowej

3. Wydzielina z dolnych
dróg oddechowych

4. Żółć

Wpisz: „+” – wzrost „-„ – brak wzrostu
* O – oporny (resistant) św – średnio wrażliwy (intermediate) W – wrażliwy (susceptible)

12

4.

Podaj stężenie penicyliny w surowicy ludzkiej. Oznaczenie zostało wykonane metodą

seryjnych rozcieńczeń.

Stężenie antybiotyku w badanym roztworze oblicza się przez pomnożenie największego rozcieńczenia
wykazującego brak wzrostu przez stężenie antybiotyku w analogicznym szeregu wzorcowym.

Stężenie
antybiotyku

1

0,5

0,25

0,125

0,0625

0,03125

0,016

0,0078

0,0039

0,00195

j/ml

Kontrola

jałowości

Kontrola

wzrostu

Roztwór
wzorcowy

Rozcieńczenie
antybiotyku

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

1:512

1:1024

Kontrola

jałowości

Kontrola

wzrostu

Roztwór
badany

„+” – wzrost „-„ – brak wzrostu
Największe rozcieńczenie nie wykazujące wzrostu w szeregu badanym = ?
Najmniejsze stężenie w szeregu wzorcowym nie wykazujące wzrostu odpowiada stężeniu = ?
Stężenie penicyliny wynosi………………………………

13