ĆWICZENIE 204
WPŁYW pH NA ROZPUSZCZALNOŚĆ BIAŁEK
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest wyznaczenie punktu izoelektrycznego białka mleka, kazeiny,
poprzez wyznaczenie zależności rozpuszczalności białka od pH roztworu.
Białka są to naturalne związki wielkocząsteczkowe, zbudowane z reszt aminokwasowych,
połączonych wiązaniami peptydowymi. W roztworach wodnych makrocząsteczki białek są
hydratowane dzięki polarnym wiązaniom peptydowym i polarnym grupom aminowym,
karboksylowym i hydroksylowym, w łańcuchach bocznych. W zależności od pH roztworu
następuje dysocjacja kwasowych grup karboksylowych, -COOH, lub zasadowych grup
aminowych, -NH
2
. Dzięki obecności grup kwasowych i zasadowych Istotną cechą białek
jest ich amfoteryczność, czyli zdolność do tworzenia zarówno jonów dodatnich jak i
ujemnych w makrocząsteczce.
W środowisku zasadowym następuje dysocjacja grup karboksylowych białka, co powoduje
ujemne naładowanie cząsteczek, natomiast w środowisku kwaśnym zachodzi przyłączanie
protonów do grup aminowych, w wyniku czego cząsteczki białka stają się naładowane
dodatnio.
NH3
+ - CH - COO-
I
R
NH3
+ - CH - COOH
I
R
NH2
- CH - COO-
I
R
H+
OH-
jon amfoteryczny
kation
anion
Istnieje takie pH roztworu, dla którego jednakowa dysocjacja grup kwasowych i
zasadowych powoduje powstanie jonu obojnaczego, amfoterycznego i cząsteczki białek
zachowują się jak obojętne indywidua, nie wędrują w polu elektrycznym. pH roztworu, w
którym sumaryczny ładunek całej cząsteczki białka równy jest zeru gdyż ładunki dodatnie
równoważą ładunki ujemne, nosi nazwę punktu izoelektrycznego białka.
W tym stanie trwałość koloidu jest najmniejsza i białko ulega koagulacji.
2
Koagulacja jest to proces rozdzielania się faz rozproszonej i rozpraszającej układu
koloidalnego. Substancja wytrącająca się z roztworu (zolu) nosi nazwę żelu. Proces
odwrotny – przejście żelu w zol – jest nazywany peptyzacją. Dla hydrofilowych koloidów
białkowych przy pH mniejszym od punktu izoelektrycznego cząsteczki nabierają
charakteru coraz silniej zjonizowanego kwasu wielokationowego. W roztworach o pH
większym od punktu izoelektrycznego cząsteczka białka zachowuje się jak kwas, oddając
protony H
+
i stając się coraz silniej zjonizowaną zasadą wieloanionową. Przy wysokim pH
wszystkie grupy karboksylowe są zdysocjowane, a grupy aminowe są niesprotonowane,
przy niskim zaś pH sytuacja jest odwrotna, cofnięta jest dysocjacja grup kwasowych, a
grupy aminowe występują w postaci jonów NH
3
+
. Ładunek cząsteczki białka zależy więc
od pH roztworu.
Punkt izoelektryczny jest cecha charakterystyczna białka i wynosi przykładowo dla
pepsyny - 1,0; albuminy z jaj – 4,6; kazeiny – 4,7; globuliny mleka – 5,2; hemoglobiny –
6,8; trypsyny – 10,5.
Punkt izoelektryczny białka można wyznaczyć doświadczalnie. Jedna z metod
wykorzystuje zależność rozpuszczalności białka od pH roztworu.
W celu wyznaczenia punktu izoelektrycznego kazeiny przygotowuje się szereg probówek
z buforem octanowym o określonych wartościach pH i dodaje do nich jednakową ilość
roztworu kazeiny. Wartość pH roztworu buforowego w probówce, w której wystąpił
najobfitszy osad (najmniej białka pozostało w roztworze) odpowiada punktowi
izoelektrycznemu. Dla bardziej precyzyjnego wyznaczenia tego punktu zawartość białka
rozpuszczonego w poszczególnych probówkach oznacza się kolorymetrycznie
wykorzystując reakcję biuretową. Jest to jedno z najczęściej wykonywanych oznaczeń
ilościowych i jakościowych białek. Biuret powstaje przy ogrzewaniu mocznika w temp.
180
o
C. Barwną reakcję biuretową dają wszystkie peptydy i białka zawierające co najmniej
dwa połączone ze sobą wiązania peptydowe w cząsteczce. Wolne aminokwasy nie dają
zabarwienia w reakcji biuretowej.
Literatura dodatkowa
1. A. Basiński – Zarys fizykochemii koloidów.
2. L. Kłyszejko-Stefanowicz – Ćwiczenia z biochemii.
3. J. Perkowski, W . Świątkowski, S. Tilk – Ćwiczenia laboratoryjne z chemii
fizycznej.
3
Wykonanie ćwiczenia
1. Do 10 suchych probówek odmierzyć (stosując pipety o pojemności 2 ml) podane
w tabeli ilości mianowanych roztworów kwasu octowego i octanu sodu. Roztwory
octanu sodu przechowywane są w lodówce.
Nr probówki
Kwas octowy 1 M
ml
Octan sodowy 1 M
ml
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2. Do
każdej probówki dodać po 2 ml roztworu kazeiny rozpuszczonej w 0,1 M roztworze
octanu sodowego. Roztwór dobrze wymieszać i pozostawić na okres 5 min.
3. Przenieść roztwory do probówek wirówkowych i odwirować wytrącony osad białka.
Wirowanie prowadzić przez 5 min przy 12 tys. obrotów. Ułożenie probówek w wirówce
musi być symetryczne, a obroty należy zwiększać stopniowo poprzez obrót pokrętła
transformatora. Przed rozpoczęciem wirowania pokrętło musi być w pozycji zerowej
(maksymalnie w lewo). W czasie pracy wirówki nie wolno otwierać pokrywy.
4. Po odwirowaniu z każdej probówki pobrać znad osadu 2 ml roztworu i dodać go do
wcześniej przygotowanych probówek zawierających po 4 ml odczynnika biuretowego.
Roztwory wymieszać i pozostawić na 30 min.
5. Przygotować odnośnik do pomiarów kolorymetrycznych (ślepa próba) poprzez
zmieszanie 2 ml wody i 4 ml odczynnika biuretowego (wspólny dla wszystkich osób
wykonujących ćwiczenie).
6. Włączyć fotokolorymetr na 10 min przed wykonaniem pomiarów.
7. Zmierzyć absorbancję dla poszczególnych roztworów, A, przy długości fali 530 nm
względem odnośnika przygotowanego wcześniej (pkt 5), dla którego wartość
absorbancji nastawić na zero.
4
8. Wyniki wszystkich pomiarów absorbancji, A, zapisać w tabeli.
Nr próby
Absorbancja
A
pH roztworu
buforowego
Stężenie białka
c
g/dm
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Opracowanie wyników
1. Obliczyć pH roztworu buforowego w poszczególnych probówkach z równania
Hendersona-Hasellbacha:
[ CH
3
COO
-
]
pH = pK
a
+ log
____________________
[CH
3
COOH]
stała dysocjacji kwasu octowego w temperaturze 25
o
C K
a
=1,753 x 10
-5
, pK
a
= 4,76.
Uwaga! W obliczeniach należy również uwzględnić stężenie octanu sodu w roztworze
kazeiny.
2. Zawartość białka w roztworze obliczyć z wzorcowej zależności pomiędzy stężeniem
białka, c, wyrażonym w g/l, i zmierzoną absorbancją, A:
,
30
,
0
A
2
,
32
c
−
⋅
=
Uwaga! Jeśli zmierzona absorbancja roztworu była niższa od 0,01 przyjąć stężenie
białka c= 0.
3. Sporządzić wykres funkcji: stężenie białka
)
pH
(
f
c
=
.
4. Z wykresu wyznaczyć punkt izoelektryczny kazeiny.