ĆWICZENIE 204

WPŁYW pH NA ROZPUSZCZALNOŚĆ BIAŁEK

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest wyznaczenie punktu izoelektrycznego białka mleka, kazeiny,

poprzez wyznaczenie zależności rozpuszczalności białka od pH roztworu.

Białka są to naturalne związki wielkocząsteczkowe, zbudowane z reszt aminokwasowych,

połączonych wiązaniami peptydowymi. W roztworach wodnych makrocząsteczki białek są

hydratowane dzięki polarnym wiązaniom peptydowym i polarnym grupom aminowym,

karboksylowym i hydroksylowym, w łańcuchach bocznych. W zależności od pH roztworu

następuje dysocjacja kwasowych grup karboksylowych, -COOH, lub zasadowych grup

aminowych, -NH

2

. Dzięki obecności grup kwasowych i zasadowych Istotną cechą białek

jest ich amfoteryczność, czyli zdolność do tworzenia zarówno jonów dodatnich jak i

ujemnych w makrocząsteczce.

W środowisku zasadowym następuje dysocjacja grup karboksylowych białka, co powoduje

ujemne naładowanie cząsteczek, natomiast w środowisku kwaśnym zachodzi przyłączanie

protonów do grup aminowych, w wyniku czego cząsteczki białka stają się naładowane

dodatnio.

NH3

+ - CH - COO-

I

R

NH3

+ - CH - COOH

I

R

NH2

- CH - COO-

I

R

H+

OH-

jon amfoteryczny

kation

anion

Istnieje takie pH roztworu, dla którego jednakowa dysocjacja grup kwasowych i

zasadowych powoduje powstanie jonu obojnaczego, amfoterycznego i cząsteczki białek

zachowują się jak obojętne indywidua, nie wędrują w polu elektrycznym. pH roztworu, w

którym sumaryczny ładunek całej cząsteczki białka równy jest zeru gdyż ładunki dodatnie

równoważą ładunki ujemne, nosi nazwę punktu izoelektrycznego białka.

W tym stanie trwałość koloidu jest najmniejsza i białko ulega koagulacji.

2

Koagulacja jest to proces rozdzielania się faz rozproszonej i rozpraszającej układu

koloidalnego. Substancja wytrącająca się z roztworu (zolu) nosi nazwę żelu. Proces

odwrotny – przejście żelu w zol – jest nazywany peptyzacją. Dla hydrofilowych koloidów

białkowych przy pH mniejszym od punktu izoelektrycznego cząsteczki nabierają

charakteru coraz silniej zjonizowanego kwasu wielokationowego. W roztworach o pH

większym od punktu izoelektrycznego cząsteczka białka zachowuje się jak kwas, oddając

protony H

+

i stając się coraz silniej zjonizowaną zasadą wieloanionową. Przy wysokim pH

wszystkie grupy karboksylowe są zdysocjowane, a grupy aminowe są niesprotonowane,

przy niskim zaś pH sytuacja jest odwrotna, cofnięta jest dysocjacja grup kwasowych, a

grupy aminowe występują w postaci jonów NH

3

+

. Ładunek cząsteczki białka zależy więc

od pH roztworu.

Punkt izoelektryczny jest cecha charakterystyczna białka i wynosi przykładowo dla

pepsyny - 1,0; albuminy z jaj – 4,6; kazeiny – 4,7; globuliny mleka – 5,2; hemoglobiny –

6,8; trypsyny – 10,5.

Punkt izoelektryczny białka można wyznaczyć doświadczalnie. Jedna z metod

wykorzystuje zależność rozpuszczalności białka od pH roztworu.

W celu wyznaczenia punktu izoelektrycznego kazeiny przygotowuje się szereg probówek

z buforem octanowym o określonych wartościach pH i dodaje do nich jednakową ilość

roztworu kazeiny. Wartość pH roztworu buforowego w probówce, w której wystąpił

najobfitszy osad (najmniej białka pozostało w roztworze) odpowiada punktowi

izoelektrycznemu. Dla bardziej precyzyjnego wyznaczenia tego punktu zawartość białka

rozpuszczonego w poszczególnych probówkach oznacza się kolorymetrycznie

wykorzystując reakcję biuretową. Jest to jedno z najczęściej wykonywanych oznaczeń

ilościowych i jakościowych białek. Biuret powstaje przy ogrzewaniu mocznika w temp.

180

o

C. Barwną reakcję biuretową dają wszystkie peptydy i białka zawierające co najmniej

dwa połączone ze sobą wiązania peptydowe w cząsteczce. Wolne aminokwasy nie dają

zabarwienia w reakcji biuretowej.

Literatura dodatkowa

1. A. Basiński – Zarys fizykochemii koloidów.

2. L. Kłyszejko-Stefanowicz – Ćwiczenia z biochemii.

3. J. Perkowski, W . Świątkowski, S. Tilk – Ćwiczenia laboratoryjne z chemii
fizycznej.

3

Wykonanie ćwiczenia

1. Do 10 suchych probówek odmierzyć (stosując pipety o pojemności 2 ml) podane

w tabeli ilości mianowanych roztworów kwasu octowego i octanu sodu. Roztwory

octanu sodu przechowywane są w lodówce.

Nr probówki

Kwas octowy 1 M

ml

Octan sodowy 1 M

ml

1
2
3
4
5
6
7
8
9

10

2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2

0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8

2. Do

każdej probówki dodać po 2 ml roztworu kazeiny rozpuszczonej w 0,1 M roztworze

octanu sodowego. Roztwór dobrze wymieszać i pozostawić na okres 5 min.

3. Przenieść roztwory do probówek wirówkowych i odwirować wytrącony osad białka.

Wirowanie prowadzić przez 5 min przy 12 tys. obrotów. Ułożenie probówek w wirówce

musi być symetryczne, a obroty należy zwiększać stopniowo poprzez obrót pokrętła

transformatora. Przed rozpoczęciem wirowania pokrętło musi być w pozycji zerowej

(maksymalnie w lewo). W czasie pracy wirówki nie wolno otwierać pokrywy.

4. Po odwirowaniu z każdej probówki pobrać znad osadu 2 ml roztworu i dodać go do

wcześniej przygotowanych probówek zawierających po 4 ml odczynnika biuretowego.

Roztwory wymieszać i pozostawić na 30 min.

5. Przygotować odnośnik do pomiarów kolorymetrycznych (ślepa próba) poprzez

zmieszanie 2 ml wody i 4 ml odczynnika biuretowego (wspólny dla wszystkich osób

wykonujących ćwiczenie).

6. Włączyć fotokolorymetr na 10 min przed wykonaniem pomiarów.

7. Zmierzyć absorbancję dla poszczególnych roztworów, A, przy długości fali 530 nm

względem odnośnika przygotowanego wcześniej (pkt 5), dla którego wartość

absorbancji nastawić na zero.

4

8. Wyniki wszystkich pomiarów absorbancji, A, zapisać w tabeli.

Nr próby

Absorbancja

A

pH roztworu

buforowego

Stężenie białka

c

g/dm

3

1
2
3
4
5
6
7
8
9

10

Opracowanie wyników

1. Obliczyć pH roztworu buforowego w poszczególnych probówkach z równania

Hendersona-Hasellbacha:

[ CH

3

COO

-

]

pH = pK

a

+ log

____________________

[CH

3

COOH]

stała dysocjacji kwasu octowego w temperaturze 25

o

C K

a

=1,753 x 10

-5

, pK

a

= 4,76.

Uwaga! W obliczeniach należy również uwzględnić stężenie octanu sodu w roztworze

kazeiny.

2. Zawartość białka w roztworze obliczyć z wzorcowej zależności pomiędzy stężeniem

białka, c, wyrażonym w g/l, i zmierzoną absorbancją, A:

,

30

,

0

A

2

,

32

c

−

⋅

=

Uwaga! Jeśli zmierzona absorbancja roztworu była niższa od 0,01 przyjąć stężenie

białka c= 0.

3. Sporządzić wykres funkcji: stężenie białka

)

pH

(

f

c

=

.

4. Z wykresu wyznaczyć punkt izoelektryczny kazeiny.