Ochratoksyny

– niebezpieczne metabolity grzybów

dr inż. Paweł Satora

Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Streszczenie
Ochratoksyna A (OTA) wraz z pochodnymi związkami (ochratoksy-
na B, C, α) jest produkowana przez grzyba Penicillium verrucosum
i kilka gatunków z rodzaju Aspergillus, głównie A. ochraceus,
P. verrucosum jest najważniejszym źródłem skażenia OTA maga-
zynowanej żywności w krajach strefy umiarkowanej, podczas gdy
Aspergillus spp. dominuje w klimacie ciepłym. OTA najczęściej
jest wykrywana w zbożach, jednakże znaczące poziomy skażenia
mogą pojawić się również w soku winogronowym i czerwonym
winie, a także w kawie, kakao, orzechach, przyprawach i su-
szonych owocach. Kontaminacja może również przenieść się
do wieprzowiny i produktów zawierających krew świń oraz piwo.
OTA jest związkiem o działaniu nefrotoksycznym i rakotwórczym,
a także teratogennym i immunotoksycznym.

Summary
Ochratoxin A (OTA), together with some related derivatives
(ochratoxins B,C, a) is produced by Penicillium verrucosum and
by several spp. of Aspergillus, most notably A. ochraceus. P. ver-
rucosum is the principal source of OTA contamination of stored
foods in temperate climates while Aspergillus spp. predominate
in warmer countries. The major dietary sources of OTA are cereals,
however significant levels of contamination may be found in grape
juice and red wine, coffee, cocoa, nuts, spices and dried fruits.
Contamination may also carry over into pork and pig blood prod-
ucts and into beer. OTA is potently nephrotoxic and carcinogenic;
it is also teratogenic and immunotoxic.

Słowa kluczowe
mykotoksyny, ochratoksyna A, Aspergillus, Penicillium

Key words
mycotoxins, ochratoxin A, Aspergillus, Penicillium

Ochratoksyny są grupą związków produkowanych przez kilka ga-
tunków grzybów strzępkowych należących do rodzajów Aspergillus
i Penicillium. Mikroorganizmy te są szeroko rozpowszechnione
w środowisku, dlatego możliwość kontaminacji produktów żywno-
ściowych i pasz dla zwierząt jest stosunkowo wysoka. Ochratoksy-
na A jest toksyną o największym zasięgu występowania, stwierdzana
była w produktach pochodzenia zarówno roślinnego, jak i zwierzę-
cego w różnych krajach Australazji, Europy i północnej Ameryki.
Szczepy Aspergillus tworzą ochratoksynę głównie przy wysokiej
wilgotności i temperaturze, podczas gdy gatunki z rodzaju Peni-
cillium mogą ją również produkować w warunkach chłodniczych
(w temperaturze 5°C).

Charakterystyka ochratoksyny A

Ochratoksyna typu A (OTA), najważniejsza toksyna z tej grupy
związków, została po raz pierwszy wyizolowana w 1965 r. z A. ochra-
ceus, od którego wzięła swoją nazwę. OTA jest związkiem zbudo-
wanym z aminokwasu α-fenyloalaniny, połączonej wiązaniem
peptydowym poprzez grupę aminową z chlorowcopochodną di-
hydroizokumaryny (rys. 1). Ochratoksyna B różni się w budowie
tylko brakiem atomu chloru i może występować naturalnie, nie
jest jednakże toksyczna.

OTA jest produkowana przez liczne szczepy pleśni, które są w sta-

nie rozwijać się praktycznie w każdych warunkach klimatycznych.
Zbiory, które są szczególnie podatne na atak tych grzybów, to głównie
zboża, niektóre rośliny strączkowe i owoce. OTA może więc trafiać
do wielu powszechnie spożywanych produktów pochodzenia roślin-
nego, jak również niektórych produktów pochodzenia zwierzęcego,

jeżeli zwierzęta skarmiane były skażoną paszą. Badania eksperymen-
talne wykazały, że OTA jest absorbowana w znacznych ilościach
z przewodu pokarmowego per os i może ulegać recyrkulacji wątrobo-
wo-jelitowej. Po zaabsorbowaniu wiąże się szybko do białek osocza
i jest transportowana z krwią, przede wszystkim w formie związanej.
W organizmie najwyższe stężenia OTA są wykrywane we krwi i w ner-
kach. Ochratoksyna A może również przenikać do mleka i przez
łożysko do płodu. Metabolizm OTA jest prosty i polega głównie
na konwersji do ochratoksyny α (rys. 1), która następnie wydalana
jest z moczem. Ponieważ OTA zawiera w swojej strukturze amino-
kwas (fenyloalaninę), może wykazywać efekt inhibicyjny na liczne
enzymy, które wykorzystują go jako substrat (szczególnie syntetazę
fenyloalanina-tRNA), co może prowadzić do zahamowania syntezy
białek. OTA może również stymulować peroksydację lipidów. Nerki
są głównym organem atakowanym przez tę toksynę, czego efektem
może być powstawanie w nich nowotworów. Wątroba jest drugim
narządem szczególnie narażonym na toksyczne działanie ochratok-
syny A. Mechanizm kancerogenności nie jest do końca wyjaśniony.
Przypuszcza się, że OTA może stymulować oksydatywne uszkadza-
nie DNA, jednakże brak jest jednoznacznych danych na ten temat.
Uważa się również, że OTA jest czynnikiem powodującym nefro-
patie u ludzi (bałkańska endemiczna nefropatia) oraz nowotwory
przewodu moczowego – szczególnie w częściach świata, w których
stwierdzane są podwyższone poziomy OTA w żywności.

Obecność ochratoksyny A w żywności

Ochratoksyna A została wykryta w różnych produktach rolnych,
takich jak kukurydza, pszenica, żyto, mąka, kawa, ryż, owies, jęcz-

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

12

/2008

32

fot. Shutterstock

mień, groch, fasola i różne pasze, a także w winie, soku winogrono-
wym i suszonych winogronach (tabela 2, s. 34). Ochratoksyny mogą
również skażać produkty pochodzenia zwierzęcego, takie jak wie-
przowina, drób i mleko, stanowiąc poważny problem dla zdrowia
ludzkiego. Ponieważ ochratoksyny są bardzo stabilne, nie ulegają
rozkładowi podczas przetwarzania żywności, dlatego też stwierdza-
ne są w różnych produktach zbożowych, piwie oraz prażonych
ziarnach kawy. Dopuszczalne poziomy OTA w produktach spo-
żywczych podaje tabela 4 (s. 34).

Głównymi trzema gatunkami pleśni produkującymi OTA są Pe-

nicillium verrucosum, Aspergillus ochraceus i A. carbonarius. Wszystkie
trzy różnią się między sobą optymalnymi warunkami wymaganymi
do rozwoju oraz zasięgiem występowania, dlatego obecne są w róż-
nych surowcach rolnych i produktach żywnościowych. Wszystkie
rozwijają się najlepiej w środowisku o stosunkowo dużej ilości
wilgoci, toteż zbiór plonów i ich przechowywanie przy dużej wil-
gotności powietrza promują tworzenie OTA.

Głównym środowiskiem występowania P. verrucosum są zboża

uprawiane w krajach klimatu chłodnego i przejściowego Europy
Północnej i Kanady. W konsekwencji OTA wytwarzana przez ten
grzyb jest wykrywana przede wszystkim w produktach zbożowych,
zwłaszcza otrzymywanych z mąki. Toksyna może pojawić się rów-
nież w żywności, takiej jak sery i produkty mięsne, jeżeli zwierzęta
skarmiane były zbożem jako głównym składnikiem pożywienia. Dla
porównania, A. ochraceus jest najczęściej znajdowany w suszonej
i przechowywanej żywności, takiej jak wędzone i solone suszone
ryby, ziarna soi, groch, orzechy, pieprz i suszone owoce. Spora-
dycznie wykrywany był w zbożu i zielonej kawie. A. ochraceus jest

zwykle obecny w małych ilościach i rzadko wywołuje zakażenia.
Jego obecność nie jest wskaźnikiem skażenia żywności ochratok-
syną A. Z kolei A. carbonarius rośnie optymalnie w temperaturze
32-35°C i jest odporny na promieniowanie słoneczne. Jego głównym
środowiskiem występowania są winogrona, dlatego też OTA wy-
tworzona przez ten gatunek grzybów jest obecna przede wszystkim
w winogronach i produktach z nich otrzymywanych – suszonych
winogronach i winie. Aspergillus niger często towarzyszy A. carbonarius,
a jest izolowany z orzechów, świeżych owoców i niektórych warzyw
ciepłego klimatu. Przyjmuje się jednakże, że jedynie 1-2% izolatów
A. niger wykazuje zdolność do produkcji OTA.

Ochratoksyna A występuje w produktach żywnościowych na nie-

mal wszystkich kontynentach. Wykrywano ją w kawie pochodzącej
z różnych krajów na świecie oraz europejskich i północnoamerykań-
skich zbożach. Jej obecność w próbkach mleka ludzkiego z Sierra
Leone dowodzi pośrednio, że OTA skażone są również produkty
żywnościowe pochodzenia afrykańskiego. Bardzo wysokie poziomy
OTA były wykrywane w pszenicy, jęczmieniu, mieszanym zbożu,
suszonych warzywach i oliwkach pochodzących od tunezyjskich
rolników. Ochratoksynę A wykrywano także w przyprawach, ta-
kich jak kurkuma, kolendra, imbir i chili pochodzących z Półwy-
spu Indyjskiego.

Poziom ochratoksyny A w produktach żywnościowych jest kształ-

towany przez zabiegi przetwarzania żywności. Uważa się, że fizycz-
ne procesy czyszczenia i mielenia ziarna mogą obniżyć poziom
OTA w otrzymywanej białej mące. Jednakże efekt tych zabiegów
jest dużo mniejszy w mące razowej, ponieważ OTA jest obecna
głównie w okrywie nasiennej ziarna. OTA jest relatywnie stabilna

COOH

N
H

O

OH

Cl

O

O

CH

3

ochratoksyna A

NH

2

HO

O

fenyloalanina

Cl

OH

O

O

CH

3

HO

O

ochratoksyna alfa

Rys. 1. Struktura chemiczna ochratoksyny A i produktów jej rozpadu

Tabela 1. Gotowe zestawy do analizowania ochratoksyny A w żywności

Firma

Nazwa zestawu

Produkt analiz

Editek/Diagnostix

EZ Screen

zboża, rośliny strączkowe,

kawa

EZ-QUANT

zboża, rośliny strączkowe,

kawa

Reidel-de Haen AG

ELIZA System do wykrywania

ochratoksyny A

zboża, karma dla

zwierząt

r-Biopharm GmbH

RIDASCREEN Ochratoxin A

zboża, karma dla

zwierząt

RIDA SCREEN Ochratoxin

A Column

kawa

Tepnel BioSystems

Ltd.

BioKits Ochratoxin A Assay

zboża, suszone owoce,

zielona kawa, białe wino

Viacam LP

Ochra Test

kawa

OTA jest produkowana przez liczne szczepy pleśni

33

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

12

/2008

33

Tabela 4. Ochratoksyna A – najwyższa dopuszczalna zawartość w środkach spożywczych. Źródło: Rozporządzenie Komisji (WE) nr 123/2005

Produkt

Najwyższy dopuszczalny poziom

(μg/kg lub ppb)

– zboża (włącznie z ryżem i gryką) oraz pochodne produkty zbożowe

– nieprzetworzone ziarna zbóż (włącznie z nieprzetworzonym ryżem i gryką)

5
5

wszystkie produkty pochodzące ze zbóż (łącznie z przetworzonymi produktami zbożowymi i ziarnami zbóż

przeznaczonymi do bezpośredniej konsumpcji przez człowieka)

3

suszone owoce winogron (koryntki, rodzynki i sułtanki)

10

– palone ziarna kawy i mielona kawa palona z wyjątkiem kawy rozpuszczalnej

– kawa rozpuszczalna (kawa instant)

5

10

wina (czerwone, białe i różowe) oraz inne wina i/lub napoje oparte na moszczu gronowym

2

– sok winogronowy, sok winogronowy jako składnik innych napojów, łącznie z nektarem winogronowym oraz

zagęszczonym sokiem winogronowym w postaci odtworzonej

– moszcz gronowy i zagęszczony moszcz gronowy w postaci odtworzonej, przeznaczony do bezpośredniego

spożycia przez człowieka

2
2

– żywność dla niemowląt i przetworzona żywność na bazie zbóż dla niemowląt i małych dzieci

0,5

– żywność dietetyczna specjalnego przeznaczenia medycznego, przeznaczone specjalnie dla niemowląt

0,5

Produkt spożywczy

Kraj pochodzenia

Stężenie (średnie)

[μg/kg lub μl/l]

Limit detekcji

[μg/kg lub μl/l]

Liczba skażonych próbek

Zboża

pszenica
pszenica
pszenica

mąka

mączka kukurydziana

owies

Niemcy, 1997
Niemcy, 1998

Węgry
Węgry
Węgry

Norwegia

0,6-0,7
0,6-0,8

0,12-0,5

0,11-0,15

0,4

0-0,47

0,4
0,4
0,1
0,1
0,1

0,01

2/14
7/29
3/36
2/16

1/6

3/22

Piwo

warzone w domu

piwo

RPA

Europa

3-2340

0,025-0,121

1

0,004

10/32
40/40

Kawa

ziarno palone

produkty zawierające kawę

Węgry

Europa

0,17-1,3

0,9

0,1

0,2-1

33/50

299/633

Kakao i czekolada

czekolada

kakao w proszku

Wielka Brytania
Wielka Brytania

0,16
1,67

0,02

0,2

30/40
20/20

Wino

wino czerwone
wino czerwone

wino czerwone/różowe

wino białe

Maroko

Wielka Brytania

Maroko

Włochy

0,04-3,24

0,074

0,028-0,18

0,57

0,01
0,02
0,01
0,01

20/20
28/50
10/10

7/21

Suszone winogrona

rodzynki

koryntki

Wielka Brytania
Wielka Brytania

0,16
1,67

0,02

0,2

30/40
20/20

Mięso i podroby

świńskie nerki
świńskie nerki

wieprzowina
wieprzowina

świńskie wątróbki

Rumunia

Dania

Rumunia

Dania

Rumunia

0,54
0-15
0,15

0-2,9

0,16

0,01
0,09
0,01
0,06
0,01

41/52

284/300

9/52

228/300

39/52

Zioła, przyprawy i słodycze

chili

curry

lukrecja

Wielka Brytania
Wielka Brytania

Niemcy

maks. 50,4
maks. 21,3

słodka 0,4-3,0

korzeń 0,3-216,5

0,1
0,1
0,3

b.d./4

b.d./10

18/19

9/19

Tabela 2. Obecność ochratoksyny A w wybranych produktach spożywczych

Metoda

Żywność

Ekstrakcja/wymywanie

Limit detekcji [ppb]

Odzysk [%]

HPLC-fluorescencja

pszenica, kukurydza, czerwona papryka, ser, wino

chloroform

8

80

HPLC-fluorescencja

jęczmień

kolumna immunopowinowactwa

0,2

93

HPLC-fluorescencja

jedzenie dla niemowląt

kolumna immunopowinowactwa

0,1

108

HPLC-fluorescencja

szynka

kolumna immunopowinowactwa

0,7

83

HPLC-fluorescencja

pasztet z wątróbek

acetonitryl

0,6

86

ELISA

przyprawy

metanol

0,035

>90

HPLC-fluorescencja

pasza dla zwierząt

kolumna immunopowinowactwa

10

95

HPLC-fluorescencja

kawa

kolumna immunopowinowactwa

0,2

85

ELISA

kawa

metanol

4

73-87

TLC

zielona kawa

kolumna immunopowinowactwa

0,5

98-104

HPLC-fluorescencja

wino, piwo, soki owocowe

toluen

0,01

80-90

HPLC-fluorescencja

wino

kolumna immunopowinowactwa

0,01

98

HPLC-fluorescencja

wino

kolumna immunopowinowactwa

20-45

90

GC-fotodiodowy detektor

wino, piwo

SPE

0,1

83-94

Tabela 3. Przykłady metod analitycznych do wykrywania ochratoksyny A w żywności

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

12

/2008

34

podczas podgrzewania i jest w stanie przetrwać w niezmienionej
postaci większość zabiegów termicznych. Uważa się, że w środowisku
suchym w temperaturze 210°C degradacji ulega 60-80% toksyny.
Prażenie ziarna może obniżyć poziom OTA w kawie o 69-96%.
Do podobnego zjawiska może prowadzić zabieg usuwania kofeiny.
Badania prowadzone przez MAFF wykazały, że ilość OTA ulegała
redukcji podczas produkcji płatków śniadaniowych i biszkoptów,
a jej poziom nie ulegał zmianie w procesie wytwórczym klusek
i makaronów jajecznych.

Wykrywanie ochratoksyny A w żywności

Zostały opracowane liczne metody analityczne do wykrywania
i pomiaru poziomu OTA w produktach żywnościowych. Reprezen-
tatywne metody przeznaczone do różnych matryc żywnościowych
przedstawiono w tabeli 3. Różnorodność produktów, zarówno sta-
łych, jak i płynnych, w których OTA może być obecna, utrudniła
opracowanie jednej metody odpowiedniej dla wszystkich. Dlatego
też rozwinięto metody do pomiaru OTA w pojedynczej matrycy
lub grupie podobnych produktów. Większość metod oznaczania
OTA rozpoczyna się od ekstrakcji przy użyciu rozpuszczalnika
organicznego, z kolei ekstrakt w kolejnym etapie może być pod-
dawany dalszemu oczyszczaniu, np. przy użyciu chromatografii
immunopowinowactwa. Rozdzielenie komponentów ekstraktu jest
uzyskiwane w większości przypadków przy użyciu wysoko sprawnej
chromatografii cieczowej (HPLC). W celu dalszej detekcji i określe-
nia ilościowego większość metod wykorzystuje właściwości fluore-
scencyjne OTA. Złożona natura matryc żywności, z których OTA
jest ekstrahowana, powoduje wszakże, że niektóre z nich mogą za-
kłócać sygnał fluorescencyjny. Dlatego wiele laboratoriów używa

drugiej techniki analitycznej, takiej jak chromatografia cieczowa
ze spektrometrem masowym (LC-MS), do potwierdzenia wyników
analiz uzyskanych przy użyciu pierwszej metody. Niektóre metody
do określenia OTA wykorzystują spektrometrię masową (MS) lub
analizy immunologiczne zamiast fluorescencji. W większości me-
tod notowany odzysk OTA wynosi ponad 80% lub 90%, a granice
detekcji sięgają kilku ppb.

W handlu dostępne są trzy kolumny powinowactwa immuno-

logicznego do oczyszczania ochratoksyny A: Easi-Extract z Rho-
ne-Poulen Diagnostic (Biocode), OchraTest z firmy Vicam i Rida
Ochratoxin A z R-Biopharme (Darmstadt, Niemcy). Poza tym
w badaniach żywności różne laboratoria wykorzystują wytwarzane
przez siebie kolumny. Szczególnie dużo uwagi poświęcono na opra-
cowanie metod oznaczania ochratoksyny A w kawie surowej i pa-
lonej oraz produktach zawierających kawę. Obecna w ekstrakcie
kofeina wpływa na działanie kolumny, zatem konieczne jest dodat-
kowe oczyszczanie przed nałożeniem na kolumnę. Do ekstrakcji
ochratoksyny A z ziaren kawy surowej lub rozpuszczalnej stosuje
się najczęściej mieszaniny metanolu z 1-3% wodnym roztworem
wodorowęglanu sodu, 1% wodny roztwór wodorowęglanu sodu
i wrzącą wodę. Po rozcieńczeniu buforem PBS lub roztworem
Tweenu 20 w PBS podaje się je bezpośrednio na kolumnę (w tem-
peraturze pokojowej). Ilościowo wymywa się ochratoksynę A z ko-
lumny metanolem. W badaniach kawy stosuje się też elucję kwa-
śnym buforem, składającym się z 0,1 M glicyny z kwasem solnym
o pH 2,5, zawierającym 30% metanol. Kolumny powinowactwa
immunologicznego stosowano też do oznaczania ochratoksy-
ny A w innych rodzajach żywności i płynach ustrojowych. Piwo
można podawać bezpośrednio na kolumnę, po odgazowaniu lub
wymieszaniu z wodorowęglanem sodu i chlorkiem sodu. Mleko
należy przygotować przez trawienie enzymami proteolitycznymi
lub oczyścić metodą ekstrakcji ciecz – ciecz. Również surowica
wymaga ekstrakcji chloroformem. Proces oczyszczania ochratoksy-
ny A na kolumnach powinowactwa został już zautomatyzowany, ale
procedura ta nie jest jeszcze tak obszernie zbadana, jak w przypadku
aflatoksyn. Systemu ASPEC używano w badaniach zbóż, produk-
tów zbożowych i mięsa, natomiast automatycznej stacji roboczej
BenchMate w badaniach ekstraktów kawy. Kolumny powinowactwa
w tym systemie nie są regenerowane do ponownego użytku.

Do analizy ochratoksyny A i kilku innych mykotoksyn (cytry-

nina i zearalenon) została zaprojektowana metoda wykorzystująca
ekstrakcję kwasowo-metanolową ze zboża, z wymywaniem ekstraktu
przy użyciu kolumienek Oasis HLB™ SPE. Metoda ta wykorzy-
stuje wysoko sprawną chromatografię cieczową (HPLC) z detek-
cją fluorescencji. Odzysk dla ochratoksyny A z prób jęczmienia,
do którego wprowadzono 6 μg/kg, wynosił 60-70%. Metoda
ta została wykorzystana do różnych produktów zbożowych. ‰

Piśmiennictwo

1 . An Z. Handbook of Industrial Mycology. Marcel Dekker, Nowy Jork 2005,

USA.

2. Blackburn C.W., McClure P.J.: Foodborne pathogens. Hazards, risk analysis

and control. Woodhead Publishing Ltd., Cambridge 2002, UK.

3. Commission Regulation (EC) No 123/2005 of 26 January 2005

amending Regulation (EC) No 466/2001 as regards ochratoxin A.

4. EFSA: Opinion of the scientific panel on contaminants in the food chain

on a request from the Commission related to ochrotoxin A in food.
„EFSA J.”, 2006, 365, 1-56.

5. Magan N., Olsen M.: Mycotoxins in food. Detection and control. Woodhe-

ad Publishing Ltd., Cambridge 2004, UK.

fot. Shutterstock

W celu dalszej detekcji i określenia ilościowego większość metod wykorzy-
stuje właściwości fluorescencyjne OTA

35

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

12

/2008

35