Enzymy proteolityczne

Ćwiczenie 8

Oznaczanie szybkości reakcji

trawienia żelatyny przez trypsynę

Biochemia

Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa

Centrum Bioimmobilizacji

i Innowacyjnych Materiałów

Opakowaniowych

ul. Klemensa Janickiego 35

71-270 Szczecin

2

Enzymy proteolityczne

Enzymy proteolityczne katalizują reakcje rozpadu wiązań peptydowych z udziałem wody.

Międzynarodowa Unia Enzymatyczna zalicza je do klasy hydrolaz. Peptydazy nie wykazują

najczęściej ścisłej specyficzności w stosunku do rozkładanego substratu, natomiast

charakteryzują się wybiórczością w stosunku do położenia rozkładanego wiązania wewnątrz

łańcucha polipeptydowego (endopeptydazy) i na jego skraju (egzopeptydazy).

Endopeptydazy, są enzymami, które hydrolizują wiązania peptydowe znajdujące się

wewnątrz cząsteczki białka czy peptydu rozkładając go na mniejsze fragmenty i należą do

nich pepsyna, trypsyna, chymotrypsyna. Do endopeptydaz roślinnych zaliczane są m.in.

papaina, bromelanina, aktynidyna czy ficyna.

Egzopeptydazy są enzymami, które hydrolizują wiązania peptydowe znajdujące się na C- lub

N-końcu białka, odszczepiające pojedyncze aminokwasy. Karboksypeptydazy są enzymami

odszczepiającymi aminokwas na C końcu peptydu (wykazują specyficzność w stosunku do

sąsiedniego wolnego ładunku ujemnego grupy karboksylowej), natomiast aminopeptydazy są

enzymami odszczepiającymi aminokwas na N końcu peptydu (wykazują specyficzność

w stosunku do sąsiedniego wolnego ładunku dodatniego grupy aminowej).

Znana jest także wybiórczość niektórych enzymów w stosunku do budowy reszt

aminokwasów tworzących rozkładane wiązanie peptydowe. Preparaty enzymów

proteolitycznych pozakomórkowych i wewnątrzkomórkowych są z reguły mieszaninami

enzymów o różnej specyficzności i dzięki temu białka rozkładają się z ich udziałem do

wolnych aminokwasów.

Szybkość hydrolizy poszczególnych białek nie jest jednakowa i zależy od liczby i układu

wiązań innych niż peptydowe, które mogą utrudniać dostęp peptydaz, a także od zwartości

cząsteczek białkowych. Dlatego białka zdenaturowane, a więc o częściowo rozerwanych

wiązaniach niepeptydowych, głównie disulfidowych i wodorowych, są trawione łatwiej.

Budowa centrum katalitycznego. Wśród enzymów proteolitycznych występuje kilka grup

o zróżnicowanej budowie centrum katalitycznego, a więc i mechanizmie działania, i na tym

polega inny rodzaj ich klasyfikacji; wyróżnia się:

- proteazy karboksylowe (proteazy kwasowe, aspartylowe) zawierające w centrum

aktywnym 2 grupy karboksylowe, zarówno w charakterze grupy nukleofilowej, jak i dawcy

protonu; działają one z reguły w środowisku o małym pH np. pepsyna, podpuszczka,

katepsyna IV, niektóre enzymy wewnątrzkomórkowe zwierzęce oraz grzybowe,

3

- proteazy serynowe – zawierają w centrum aktywnym serynę (często zestryfikowaną przez

fosforan) oraz histydynę, jako dawcę ładunku dodatniego; hamowane przez

diizopropylofluorofosforan (DIFP) np. trypsyna, chymotrypsyna, elastaza, trombina (enzym

układu krzepnięcia krwi),

- proteazy cysteinowe (zwane inaczej tiolowymi lub sulfhydrylowymi) – zawierające

w centrum aktywnym grupę tiolową cysteiny (-SH) w bezpośrednim sąsiedztwie pierścienia

imidazolowego His np. katepsyna II, enzymy roślinne: papaina, bromelaina, ficyna

i aktynidyna oraz niektóre proteinazy bakteryjne (klostripaina),

Endoproteinazy cysteinowe mają szczególne znaczenie w metabolizmie, np. wywołanej

stresem aktywacji białek (niska lub wysoka temperatura, deficyt wody, zasolenie). Również

istotne znaczenie mają w inicjowaniu kiełkowania nasion, ze względu na zdolność

redukcyjnego, wstępnego degradowania białek zapasowych.

- metaloproteazy – których aktywność zależna jest od obecności określonych jonów metali

(cynku, wapnia czy manganu) np. karboksypeptydaza A i B, bakteryjna termolizyna czy

kolagenaza.

Jak każde białko, peptydazy produkowane są w komórkach, ale jedne z nich działają

wewnątrz komórki, natomiast inne wykazują aktywność enzymatyczną poza komórką

i dlatego proteazy dzieli się również na:

l) enzymy pozakomórkowe (zewnątrzkomórkowe),

2) enzymy wewnątrzkomórkowe.

Enzymy pozakomórkowe są to enzymy, które występują we krwi i innych płynach

pozakomórkowych pełniąc tam różnorodne funkcje np. biorą udział w krzepnięciu krwi,

fibrynolizie, aktywacji czynników dopełniających. Proteazami tego typu są także enzymy

układu pokarmowego (enzymy trawienne); do grupy tej należą głównie typowe

endopeptydazy:

- enzymy soku żołądkowego - pepsyna i podpuszczka,

- enzymy soku trzustkowego - trypsyna, chymotrypsyna, karboksypeptydaza i elastaza.

Pepsyna jest wydzielana do soku żołądkowego z gruczołów błony śluzowej jako pepsynogen,

który jest formą nieaktywną, czyli proenzymem. Pepsynogen posiada odcinek prekursorowy

złożony z 44 reszt aminokwasowych (o masie cząsteczkowej ok. 5 kDa) usuwanych

proteolitycznie podczas tworzenia pepsyny. Proces ten, jednoznaczny z aktywacją

pepsynogenu zachodzi spontanicznie, poniżej pH 5. W cząsteczce pepsynogenu miejsce

4

aktywne jest całkowicie uformowane, jednakże w pH neutralnym dostęp do niego jest

zablokowany przez reszty aminokwasowe należące do odcinka prekursorowego. Aktywny

enzym ma masę cząsteczkową 34,5 kDa i optymalne pH działania między 1,6 i 2

,

0 (zależnie

od typu substratu), a przy pH 6 ulega denaturacji. Pepsyna w miejscu aktywnym zawiera dwie

reszty asparaginianu; jedną w postaci niezjonizowanej (COOH), drugą w postaci

zjonizowanej (COO

-

). Pepsyna

-

jako endopeptydaza - rozkłada większość białek i peptydów

do oligopeptydów; ma ponadto właściwość ścinania mleka.

Podpus

z

c

z

ka (chymozyna, rennina) jest wytwarzana w żołądku młodych ssaków i ma

właściwość ścinania mleka, a przez to dłuższego zatrzymywania tego pokarmu w żołądku.

Substratem dla niej jest kazeina, która ulega denaturacji i częściowej hydrolizie do

parakazeiny, a ta w obecności jonów Ca

2

+

tworzy nierozpuszczalny skrzep parakazeinianu

wapnia.

Działanie tego enzymu ma podstawowe znaczenie przy odżywianiu młodych ssaków, które

po przejściu na odżywianie inne niż mleko, nie potrzebują już tego enzymu. Jest on natomiast

stosowany do otrzymywania skrzepu podpuszczkowego w serowarstwie. Taki skrzep różni się

od kwasowego, uzyskiwanego przy ukwaszaniu mlek

a

, ponieważ zawiera znaczną ilość łatwo

przyswajanego Ca

2

+

.

Podpuszczka jest wytwarzana w śluzówce żołądka w postaci

nieaktywnego proenzymu (

prochymozyny)

, który ulega aktywacji, podobnie jak pepsyna,

przy udziale wyższego stężenia jonów wodorowych.

Trypsyna, chymotrypsyna, karboksypeptydaza i elastaza są wydzielane w soku trzustkowym

do jelita cienkiego. Należą one do endopeptydaz i są wydzielane z gruczołu trzustkowego

w postaci proenzymów, np. jako trypsynogen i chymotrypsynogen. Proenzymy te zawierają

w stosunku do enzymów aktywnych, dodatkowy peptyd(y), maskujący ich centra aktywne.

Aktywacja odbywa się przez odmaskowanie (ograniczoną proteolizę), czyli odłączenie

przeszkadzającego peptydu (ów); u trypsyny przy udziale towarzyszącej enteropeptydazy,

występującej w soku jelitowym, lub samej trypsyny (autoaktywacja), a u chymotrypsyny i

pozostałych przy udziale trypsyny. Mechanizm aktywacji trypsynogenu do trypsyny przed-

stawiono na rys. 1

.

5

Rys.

1.

Mec

h

a

ni

zm

aktywa

c

j

i

trypsynoge

n

u

wydzie

l

o

n

ego

do

dw

un

ast

n

icy;

1

-

n

i

e

uk

szta

ł

towane ce

ntrum

kata

l

ityczne enzym

u,

2 - gotowe cen

tru

m, 3 - od

ł

ączo

n

y

heksapeptyd

Produktami rozkładu przy udziale enzymów soku trzustkowego są krótkie peptydy oraz, ze

względu na obecność karboksypeptydazy, wolne aminokwasy. Optimum pH działania

trypsyny i chymotrypsyny wynosi ok. 7-9.

Obecna również w soku trzustkowym elastaza jest enzymem bardzo specyficznym i ma

zdolność degradacji elastyny - drugiego obok kolagenu składnika tkanki łącznej.

Wewnątrzkomórkowymi protezami są zwierzęce katepsyny (umiejscowione głównie

w lizosomach).

Katepsyny w szczególnie dużych ilościach występują w lizosomach komórek

nerek, śledziony i tkanek nowotworowych, a także tkanki mięśniowej

.

Enzymy te biorą udział

w katabolizmie białek komórki i największą aktywność proteolityczną przejawiają w pH 4-5.

Wyróżniamy kilka rodzajów katepsyn – katepsynę I, II, II, IV. Katepsyny I i II są typowymi

endopeptydazami. Katepsyna III jest aminopeptydazą, a katepsyna IV karboksypeptydazą, są

one typowymi egzopeptydazami. Nie potrzebują aktywacji przez odmaskowanie, natomiast są

aktywowane przez grupy CN

-

i -SH oraz kwas askorbinowy, a hamowane przez jony metali.

Optymalne pH katepsyn wynosi 4-6, a ich rola polega na utrzymywaniu w komórce

równowagi między białkami i produktami rozkładu, m.in. na hydrolizie enzymów komór-

kowych, co w powiązaniu z regulowaną syntezą stanowi jeden z mechanizmów regulacji

przemiany materii

.

Uczestniczą też w autolizie (samotrawieniu) komórki po jej śmierci.

Katepsyny (podobnie jak kalpainy umiejscowione w cytozolu komórek mięśniowych

cisteinoproteazy) mają znaczenie w dojrzewaniu mięsa po uboju przez udział w częściowym

rozkładzie makrocząsteczek białka włókna mięśniowego. Dzięki ich działaniu znacznie

zwiększa się strawność białek (dostępność dla proteolitycznych enzymów trawiennych),

6

zawartość białek rozpuszczalnych oraz wolnych aminokwasów i niewielkich peptydów

(polepsza się kruchość, miękkość i smak mięsa).

Wewnątrzkomórkowymi protezami roślinnymi są: papaina (z soku mlecznego drzewa

melonowego), bromelaina (z łodyg ananasa i soku ananasa), aktynidyna (z owocu kiwi) czy

ficyna (z soku fig). Ich optimum działania przypada na pH 5-7.

Peptydazy bakteryjne i grzybowe. Główne znaczenie mają enzymy produkowane przez

grzyby Aspergillus oryzae oraz bakterie Bacillus subtilis. Otrzymywane preparaty stanowią

mieszaniny endo- i egzopeptydaz o różnej specyficzności. Enzymy bakteryjne odznaczają się

wyższym pH działania i wyższą temperaturą optymalną (ponad 40-50

°

C) niż enzymy

grzybowe.

Kolagena

z

a jest enzymem bakteryjnym o znacznej specyficzności substratowej,

produkowanym przez bakterie rodzaju Clostridium

.

Inne enzymy proteolityczne nie są zdolne

do rozkładania kolagenu ze względu na jego szczególną strukturę pierwotną (obecność

tripeptydowych sekwencji Gly-Pro

-

Hyp), chroniącą wiązania peptydowe przed działaniem

peptydaz.

Zastosowania przemysłowe.

W s

ero

wa

r

s

t

w

i

e o

d

se

t

e

k l

a

t j

e

st

wy

kor

zystywa

n

a

k

a

z

e

olit

y

czna właściwość ch

y

moz

y

n

y

(r

e

nnin

y), s

to

s

o

wa

nej prakt

y

c

z

ni

e

p

o

d n

az

w

ą

podpu

s

zczki, mającej zdolność ścinania mleka „na

s

łodko

”

w wyniku b

a

rd

zo sz

ybko

pr

z

eb

i

egających hydrolitycznych zmian w jedn

e

j z frakcj

i

kaz

e

inowych.

W wyniku hydrolizy

wiązania peptydowego w



-kazeinie (pomiędzy Phe105 i Met106) z cząsteczek



-kazeiny

odszczepiony

zostaje

C-końcowy

fragment

łańcucha

polipeptydowego,

tzw.

glikomakropeptyd w wyniku czego powstaje para-



-kazeina. Glikomakropeptyd zawierający

64 reszty aminokwasowe przechodzi do roztworu (jest on łatwo rozpuszczalny w wodzie)

.

W w

y

niku

usunięcia hydrofilowego C-końca



-kazeiny

jony wapnia są

w

i

ąza

n

e

pr

zez

z

mi

e

nion

y

k

o

mpl

e

ks ka

ze

ino

wy

,

s

t

rą

c

a s

i

ę

r

e

s

z

ta



-kazeiny

i frakcja



, c

o z

kol

e

i p

ow

odu

je

s

t

rą

c

e

ni

e s

i

ę

frakcji



i



,

w

ob

ec

kt

óry

ch frakcja



odgrywa

r

ol

ę k

oloidu o

c

hronn

ego.

W wyniku odłączenia glikomakropeptydu następuje utrata otoczki hydratacyjnej, powodująca

wzrost hydrofobowych oddziaływań pomiędzy micelami oraz obniżenie elektrostatycznych

sił odpychania między micelami. Rozpoczyna się agregacja micel i tworzy się skrzep para-

kazeiny (dokładniej para-kazeinianu wapnia).

P

o

n

a

dt

o

podpus

z

c

z

k

a

d

a

l

e

j h

y

dr

o

li

z

uj

e

f

r

akcje kazeinowe

w

c

zas

ie do

j

rz

ewa

ni

a sera,

7

p

ow

oduj

ą

c ich

częś

cio

we

dopro

wa

dzenie do stadium pept

y

dó

w

. D

a

l

sza

h

y

dr

o

li

za

p

e

pt

y

dó

w

do aminok

wasów i

i

c

h

ewe

ntu

alna dezaminacja

lub de

k

arbok

sy

l

a

c

ja jes

t pr

zy

pis

yw

an

a

(w se

r

ac

h podpuszc

z

ko

wych twardych)

dzi

ała

lno

ś

ci

e

nz

y

m

ów

b

a

kt

e

r

y

jn

y

ch

.

Wobec stale zwiększającego się zapotrzebowania na podpuszczkę cielęcą zastępuje się ją

częściowo lub całkowicie innymi enzymami proteolitycznymi o zbliżonym działaniu, jak

pepsyną wołową lub wieprzową oraz enzymami pochodzenia mikrobiologicznego głównie

pleśniowego np. z rodzaju Mucor.

E

n

zy

m

y

pro

te

olit

ycz

n

e z

nal

az

ł

y za

sto

s

o

wa

ni

e w

pi

w

o

w

ar

s

t

w

i

e. Używa się ich w celu

ro

z

pu

sz

c

ze

ni

a

bi

a

ł

e

k i

za

pobi

eż

en

i

u

z

m

ę

tni

e

n

i

om pi

wa

pr

zy

j

ego chłodzeniu. Wa

rto tu

jedn

o

c

ześ

ni

e

dod

ać

,

że a

kt

y

wność rod

z

im

yc

h prote

az

ujawnia się w proce

s

i

e s

łodo

wa

nia

z

i

a

ren

(zwy

kl

e

j

ę

c

z

mienia)

,

pr

zy

c

zy

ni

a

j

ą

c

s

i

ę

j

e

dnoc

ześnie do sklaro

w

a

n

ia

br

z

eczki

i p

o

dni

es

i

e

n

i

a

j

ej wa

rtości

, z

ar

ów

n

o

j

a

ko sub

s

tr

a

tu dla drożdży; jak i końcowego produktu

s

po

ży

w

czeg

o

.

Peptydazy pochodzenia roślinnego oraz uzyskiwane z udziałem drobnoustrojów

w biotechnologii, mają duże znaczenie w przetwórstwie żywności i innych gałęziach

przemysłu. Najważniejszymi peptydazami pochodzenia roślinnego, stosowanymi w

przemyśle są: papaina, ficyna i bromelaina. Enzymy roślinne, podobnie jak enzymy

pochodzenia mikrobiologicznego stosowane są do zwiększania kruchości mięsa. Podstawową

różnicą między tymi enzymami jest to, że enzymy roślinne atakują przede wszystkim białka

tkanki łącznej – kolagen i elastynę, a tylko w nieznacznym stopniu działają na włókna

mięśniowe, wpływając na tkankę łączną tylko w pewnych warunkach. Papaina

wykorzystywana jest także w browarnictwie do klarowania piwa.

Peptydazy bakteryjne i

grzybowe mają ponadto zastosowanie np.: przemyśle hydrolizatów białkowych, piekarskim,

piwowarskim oraz w pralnictwie i przemyśle skórzanym.

W produkcji hydrolizatów mięsnych i rybnych preparaty peptydaz zastępują hydrolizę

kwasową, wskutek czego uzyskuje się mniej niekorzystnych produktów ubocznych. W

przemyśle piekarskim dodatek tych enzymów bywa konieczny przy stosowaniu pszenicy

stepowej w celu rozluźnienia zbyt „mocnego” białka glutenowego. Dodatek peptydaz

zapobiega mętnieniu chłodzonego piwa, powstającemu wskutek wytrącania się

nierozłożonych białek. W pralnictwie stosuje się enzymy bakteryjne o wysokim pH

optymalnym, jako dodatek do proszków enzymatycznych. Opracowano także wiele procesów

polegających na sterowanej proteolizie białek żywnościowych w celu polepszenia ich

właściwości funkcjonalnych i smakowych.

8

W prod

u

kcji autoli

za

tów dro

ż

d

żowych, m

n

i

e

j lu

b

więcej skoncentrowanych produktów,

podobnych do hydro

l

i

z

a

t

ów białkow

y

ch j

a

ko pr

zy

praw t

ypu bulionoweg

o

wy

kor

zy

stuj

e

si

ę

wł

as

ny komp

l

e

ks enzym

ó

w prot

e

ol

i

t

y

c

z

nych komórek drożdżowych

(

t

zw

.

e

nd

o

tr

y

p

sy

ny

).

W

w

y

n

i

ku

e

n

zy

mat

y

c

z

n

e

j h

y

droli

zy

kwasów rybonukleinowych

w

dr

oż

d

żac

h uz

ys

kuj

e

si

ę z

nukleot

y

d

ów só

l dwu

so

do

wą kwasu 5’-inozynowego

or

az a

n

a

l

og

i

cz

n

ą só

l

kwas

u 5’-

g

u

an

il

owego

,

kt

óre

pod n

azwą rybotydów

lu

b w s

kr

ó

ci

e IMP

i

GM

P

z

n

a

jdu

ją

c

o

r

az sze

r

sze

zas

t

osowa

ni

e w przemyśle spoż

y

wcz

y

m

jako śro

d

ki

popraw

i

a

j

ące s

m

a

k

.

Lista zastosowań enzymów proteolitycznych w technologii ciągle się powiększa.

Przykładowo można tu wymienić użycie tych enzymów w celu polepszenia rozpuszczalności

żywności sproszkowanej, przyspieszenia dojrzewania solonych i marynowanych śledzi czy

modyfikowania białek.

Do jednych z nowszych zastosowań endopeptydaz, nie tylko do hydrolizy, ale i do tworzenia

wiązań peptydowych, zaliczyć należy wykorzystanie tych enzymów w produkcji plastein.

W produkcji tej koncentrat lub izolat białkowy poddaje się łagodnej hydrolizie za pomocą

peptydaz i usuwa ze zmodyfikowanego białka zanieczyszczenia i niepożądane aminokwasy

przez wymywanie organicznymi rozpuszczalnikami. Do oczyszczonego hydrolizatu

o stężeniu 30-50% białka pH 4-7, zawierającego w dalszym ciągu endopeptydazy, dodaje

się estry etylowe wybranych aminokwasów, ogrzewa do temp. ok. 37°C i przetrzymuje

kilka

dni.

W

tych

warunkach

zachodzi

reakcja

plasteinowa,

polegająca

na enzymatycznym wiązaniu peptydowym pożądanych reszt aminokwasowych

do peptydów hydrolizatu białkowego. Produktem tej reakcji są plasteiny.

9

Część doświadczalna

Oznaczanie szybkości reakcji trawienia żelatyny przez trypsynę
(miareczkowanie formolowe)

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest poznanie metody oznaczania aktywności enzymów proteolitycznych na

przykładzie trypsyny.

Zasada metody:

W miarę postępowania hydrolizy białka przez trypsynę pojawia się w roztworze coraz więcej

grup karboksylowych, które po uprzednim zablokowaniu grup aminowych przez formaldehyd

można oznaczyć ilościowo, miareczkując wodorotlenkiem sodowym wobec fenoloftaleiny

(miareczkowanie metodą Sörensena, miareczkowanie formolowe). Ilość zasady zużytej do

miareczkowania jest więc miarą stopnia zhydrolizowania białka. Liczba uwolnionych grup

karboksylowych jest równa liczbie związanych z formaldehydem grup aminowych.

Wykonanie

1. Pastylkę aptecznego preparatu trzustki dokładnie utrzeć w moździerzu z 7 ml 0.1%

węglanu wapnia. .

2. Przygotować 6 kolbek o obj. 50 cm

3

i nalać do nich po 4 ml formaliny.

3. Przygotować 20ml 4% roztworu żelatyny (wodę lekko podgrzać, tak aby temperatura nie

przekroczyła 40°C, ułatwi to rozpuszczenie żelatyny).

4. Do probówki typu falkon o obj. 50 ml odmierzyć 16 ml 4% roztworu żelatyny i 4 ml

przygotowanego roztworu preparatu trzustki. Natychmiast po zmieszaniu pobrać 2 ml

mieszaniny i przenieść do przygotowanej w punkcie 2 kolbki nr1 o obj. 50 cm

3

zawierającej 4 ml formaliny (próbka kontrolna).

5. Falkon zawierający mieszaninę żelatyny z preparatem trzustki wstawić do łaźni wodnej

o temperaturze 37

o

C i rozpocząć pomiar czasu. Uwaga! Zawartość kolbki należy

intensywnie mieszać co ok. 3 min.

6. Do próby kontrolnej dodać 5 kropel fenoloftaleiny i miareczkować 0,02 M roztworem

NaOH, do uzyskania lekko różowego zabarwienia utrzymującego się przez minutę.

7. Kolejne próbki (po 2 ml) z inkubowanej kolbki zawierającej mieszaninę żelatyny i

preparatu trzustki pobierać po 10, 20, 30, 40 i 50 minutach. Po pobraniu poszczególnych

10

próbek postępować jak w przypadku próbki kontrolnej, czyli miareczkować 0,02 M

roztworem NaOH w obecności 5 kropel fenoloftaleiny.

Opracowanie wyników

1. Ilość zużytego do miareczkowania 0,02 M roztworu NaOH przeliczyć na ilość

mikromoli wiązanych protonów grup karboksylowych:

1 ml 0,02 M roztworu NaOH odpowiada 20 μmol grup karboksylowych (-COOH).

2. Po odjęciu ilości μmol grup karboksylowych (ilości ml 0,02 M roztworu NaOH)

przypadających na próbę kontrolną, wyniki przedstawić w postaci wykresu zależności

między ilością uwalnianych grup karboksylowych, a czasem inkubacji (na osi

odciętych – czas w minutach, na osi rzędnych μmole uwalnianych grup

karboksylowych).

3. Z wykresu należy wyznaczyć szybkość początkową (v

0

) reakcji enzymatycznej. W

tym celu należy przeprowadzić styczną do krzywej w punkcie t = 0. Styczna z osią

odciętych utworzy kąt α, którego tangens jest miarą szybkości początkowej (v

0

).

Wartości tg α nie wolno odczytywać z tablic na podstawie wartości kąta w stopniach,

ponieważ nanoszone na osi odciętych i rzędnych wartości nie są tej samej wielkości.

Oblicza się go ze stosunku wielkości przyprostokątnej przeciwległej do kąta α,

podanej w wartościach odkładanych na osi rzędnych (w μmolach uwalnianych grup

karboksylowych), do przyprostokątnej przyległej do kąta α, podanej w wartościach

odkładanych na osi odciętych (czas w minutach).

11

Literatura:

1) Podstawy biochemii. J. Kączkowski. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 2005.

2) Ogólna technologia żywności. Pijanowski E., Dłużewski M., Dłużewska A., Jarczyk A.

Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 2004.

3) Praktikum z biochemii. Praca zbiorowa pod red. A. Dubina i B. Turyny. Instytut Biologii

Molekularnej Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 1999.

4) Przepisy do ćwiczeń z biochemii. Praca zbiorowa pod red. M. Stryjeckiej-Zimmer. Akademia

Medyczna im

.

prof

.

F

.

Skubiszewskiego w Lublinie, Lublin, 2004.

5) Ćwiczenia z biochemii. Praca zbiorowa pod red. L. Kłyszejko-Stefanowicz. Wydawnictwo

Naukowe PWN, Warszawa, 2003.