2.2,2 Mikulicz Natalia

Właściwości enzymów

- Przyspieszają reakcje, jednak same nie ulegają przekształceniom w inne związki i nie ulegają szybko zużyciu w przeprowadzanych przez siebie reakcjach (jednak długość ich działania jest ograniczona w czasie, one również po przeprowadzeniu bardzo wielu reakcji ulegają zestarzeniu i degradacji).

- Przeprowadzają reakcje z dużą szybkością w optymalnych dla siebie warunkach temperatury, pH i ciśnienia. Właściwości katalityczne większości z nich są zadziwiające, na przykład jedna cząsteczka enzymu katalazy wyizolowanej z wątroby wołu może spowodować w temperaturze 0°C rozkład 5 milionów cząsteczek nadtlenku wodoru H₂O₂ w ciągu minuty.

- Jako cząsteczki białkowe posiadają podobne właściwości jak białka: są labilne i podatne na wpływy różnych czynników środowiska. Optymalna temperatura to 37–40°C (wyjątek stanowią enzymy bakteryjne, bakterii żyjących w gorących źródłach – 80°C), optymalne pH dla większości z nich waha się w granicach 6,4–6,6. Niektóre enzymy wykazują zbliżony poziom aktywności w szerokim zakresie pH, np. papaina, inne z kolei działają w ściśle określonym pH: bardzo niskim 1,5 – pepsyna lub wysokim 7,7 – trypsyna.

- Charakteryzują się dużą specyficznością substratową, np. rozróżniają stereoizomery (nie posiadają tej właściwości enzymy nieorganiczne). Różnią się między sobą stopniem specyficzności: jedne są specyficzne tylko dla jednego substratu: jeden enzym – jedna reakcja, inne katalizują reakcje blisko spokrewnionych substratów lub związków podobnych strukturalnie.

- W czasie reakcji enzymatycznej nie tworzą się zbędne produkty uboczne.

- Mogą działać jako niezależne cząsteczki lub być zorganizowane w kompleksy katalizujące całe szlaki metaboliczne (produkt reakcji jednego enzymu jest substratem dla kolejnego enzymu).

- Mogą przeprowadzać tylko takie reakcje, które są możliwe termodynamicznie, czyli egzoergiczne, tzn. przebiegają ze spadkiem energii swobodnej układu, czasami mogą katalizować reakcje endoergiczne, jeżeli są one sprzężone z reakcjami egzoergicznymi.

- Nie wpływają na równowagę reakcji, ich obecność nie przesuwa stanu równowagi katalizowanej przemiany, ale dzięki nim reakcja znacznie szybciej osiąga stan równowagi. Nadają reakcjom kierunek.
Aktywność enzymów można regulować poprzez hamowanie kompetycyjne – substrat i inhibitor podobne chemicznie i fizycznie współzawodniczą o to samo centrum aktywne enzymu, oraz na drodze hamowania niekompetycyjnego, wtedy gdy enzym jest blokowany przez inhibitor niepodobny chemicznie do substratu, co powoduje spadek prędkości maksymalnej reakcji. Istnieje również możliwość tzw. regulacji alosterycznej, wtedy gdy określona cząsteczka regulatora (regulator alosteryczny) łączy się z enzymem nie w centrum aktywnym, ale centrum alosterycznym, co zmienia czasowo konformację całego biokatalizatora i aktywność enzymu ulega czasowemu zablokowaniu lub odwrotnie – uaktywnieniu. Wyróżniamy sześć głównych klas enzymów: oksydoreduktazy, transferazy, hydrolazy, liazy, izomerazy oraz ligazy (syntetazy).

Enzymy - informacje ogólne

Enzymy, biokatalizatory, dawniej fermenty to białka katalizujące reakcje zachodzące w żywych organizmach; działają w komórkach lub pozakomórkowo (np. w świetle przewodu pokarmowego); mają zdolność zwiększania szybkości reakcji chemicznych przebiegających w organizmie, czyli obniżają energię niezbędną do rozpoczęcia i przeprowadzenia reakcji chemicznej, tzw. energię aktywacji.



Rys. Obniżanie energii aktywacji przez enzym

Budowa i działanie enzymów

- Dzielimy je na proste, zbudowane wyłącznie z aminokwasów (część hydrolaz), oraz złożone zbudowane z części białkowej – apoenzymu i części niebiałkowej – koenzymu lub grupy prostetycznej. Część niebiałkowa może być silnie związana z apoenzymem za pomocą wiązań kowalencyjnych (grupa prostetyczna) lub luźno związana, może od apoenzymu oddysocjowywać i wówczas określa się ją jako koenzym. Sam apoenzym nie wykazuje aktywności enzymatycznej, uzyskuje ją dopiero po połączeniu z odpowiednim kofaktorem: koenzymem, grupą prostetyczną lub jonem metalu. Cały czynny kompleks nosi nazwę holoenzymu.

- Koenzymy ulegają zużyciu i ich zapas w organizmie musi być stale uzupełniany; w skład koenzymów wchodzą witaminy, np. witamina K, B₁, B₂, B₆, B₁₂, H, kwas foliowy, kwas pantotenowy.

- Częścią enzymu uczestniczącą w wiązaniu substratu i przeprowadzaniu reakcji jest centrum aktywne; znajduje się ono w szczelinach i bruzdach apoenzymu biokatalizatora i zajmuje stosunkowo niewielki fragment jego cząsteczki. Do centrum aktywnego enzymu przyłącza się substrat bądź substraty, tu również znajduje się miejsce wiązania kofaktora. Centrum aktywne to przestrzenny układ kilku reszt aminokwasowych charakterystycznych dla danego enzymu. Konformacja substratu musi być przestrzennie dopasowana do konformacji centrum aktywnego enzymu. Dopasowanie strukturalne substratu i enzymu (jego centrum aktywnego) porównuje się do zależności, jaka zachodzi między kluczem i zamkiem lub ręką i rękawiczką. Jest to bardzo precyzyjne, a zarazem elastyczne dopasowanie strukturalne dwóch oddziałujących składników.

- W niektórych enzymach oprócz centrum aktywnego w apoenzymie znajduje się centrum allosteryczne, do którego przyłączają się drobnocząsteczkowe związki, tzw. efektory, wpływające na aktywność enzymów.
Niektóre enzymy syntetyzowane są w komórkach w postaci nieczynnych proenzymów (zymogenów). Te nieaktywne formy ulegają aktywacji dopiero po wydzieleniu do miejsca działania danego enzymu, by nie doszło do strawienia komórki, np. enzymy katalizujące hydrolizę białek – trypsynogen, pepsynogen.

- Działanie biokatalizatorów polega na tworzeniu przez enzym przejściowego kompleksu z substratem lub substratami; powoduje to przesuwanie się określonych elektronów między reagującymi substratami i powstanie nowych wiązań bądź rozrywanie istniejących; w ten sposób powstaje określony produkt, a enzym wychodzi z reakcji niezmieniony i może wiązać kolejne substraty:

SUBSTRAT + ENZYM a KOMPLEKS

ENZYM-SUBSTRAT >PRODUKT + ENZYM.



Rys. Mechanizm działania enzymu

- Obecność enzymów towarzyszących przemianom metabolicznym powoduje: zwiększenie prawdopodobieństwa zderzeń między reagującymi cząsteczkami, ustawienie substratów względem siebie tak, by miejsca tworzących się wiązań znalazły się naprzeciw siebie oraz naprężanie wiązań w reagujących cząsteczkach, co obniża energię aktywacji i pozwala na powstanie nowych wiązań i konformacji.

- Naprężanie wiązań w kompleksie enzym – substrat wyjaśnia teoria indukcyjnego dopasowania, według której substrat dopasowuje się przestrzennie do centrum aktywnego enzymu, co powoduje niewielkie odkształcenie substratu i centrum, a tym samym naruszenie (naprężenie) wiązań chemicznych i inicjację procesu (teoria Koshlanda).

- Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od aktywności enzymu. Parametry określające aktywność enzymatyczną to: międzynarodowa jednostka enzymatyczna (U lub katal), aktywność właściwa i liczba obrotów. Jednostką aktywności enzymu jest katal. Jeden katal w określonych warunkach powoduje przemianę 1 mola substancji w ciągu 1 sekundy. Efektywność działania enzymów określa liczba obrotów. Jest to liczba cząsteczek substratu, które w jednostce czasu ulegają przekształceniu przy udziale jednej cząsteczki enzymu; liczba ta waha się w szerokich granicach, może osiągać wartość ponad 10⁷.

- Aktywność enzymów jest regulowana przez takie czynniki, jak: temperatura, pH roztworu, stężenie enzymu i substratu, inhibitory i aktywatory. Inhibitorami enzymów są m.in. cyjanek, kwas jodooctowy, fluorek, luizyt; same enzymy mogą także oddziaływać jak trucizny, jeśli znajdą się w nieodpowiednim miejscu, np. trypsyna wstrzyknięta do krwi lub jad węży, pszczół, skorpionów.

DNA:

Odkrycie struktury DNA w 1953 roku, a także wykazanie istnienia RNA (co zasugerowało odkrycie rybozy w 1909 roku), stały się przełomem w nauce. Dzisiejsze spektakularne odkrycia, coraz to lepsze możliwości badawcze, a także wszystkie perspektywy związane z  istnieniem kwasów nukleinowych potwierdzają, że eksperymenty wykonane na przestrzeni ostatnich 100 lat  były kluczowymi dla nauki i dzisiejszego stanu wiedzy. Mowa tu nie tylko o wyodrębnieniu DNA (nukleiny) w 1869 roku przez Friedricha Miescher’a , ale także o poznaniu struktury genomu człowieka na początku XX wieku

Specyficzne właściwości kwasów nukleinowych

Według przeprowadzonych badań, jedną z cech charakterystycznych kwasów nukleinowych jest to, że wykazują one różną wrażliwość na środowisko zasadowe i kwasowe. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) jest odporny na działanie mocnych zasad. W przeprowadzonym w tym celu doświadczeniu, zastosowano 1M NaOH, w którym pozostawiono wyizolowane wcześniej DNA (na okres 20-40h, w temp. 37 ˚C). W tych warunkach kwas RNA rozpada się  całkowicie do mieszaniny 2- i 3-monofosfonukleozydów. Spowodowane jest to obecnością grupy –OH przy atomie C-2’rybozy. Brak tej grupy w kwasie DNA jest podstawą jego oporności na działanie zasad [9].  Ponadto hydroliza kwasów nukleinowych jest przyczyną powstawania różnych jej produktów, które zależą zarówno od stężenia zastosowanych kwasów, czasu trwania procesu hydrolizy, jak i zastosowanej temperatury w przeprowadzanym doświadczeniu.  

W doświadczeniu, w którym krótkotrwale ogrzewa się kwasy DNA i RNA (w 100˚C) z kwasami , np. HCl o niskim stężeniu (np. 1M), początkowo powstały kwasy apurynowe (tj. kwasy pozbawione łańcuchów purynowych), a następnie po dłuższej hydrolizie kwasowej (po  ogrzewaniu przez 1h), powstały mononukleotydy pirymidynowe, pentozy oraz kwas fosforowy [9].


W doświadczeniu, w którym na DNA i RNA podziałano mocnymi kwasami mineralnymi (72% roztwór HClO4) , a także podwyższoną temperaturą, tj. 100˚C przez 1h, spowodowało, że z DNA i RNA zostały uwolnione zasady purynowe i pirymidynowe, oraz pentozy i kwas fosforowy. Kwasy w tym doświadczeniu uległy całkowitej hydrolizie [9].

Denaturacja i renaturacja kwasów nukleinowych
Podczas procesu denaturacji, w kwasach nukleinowych zostaje zniszczona II- i III-rzędowa struktura. Wśród czynników, które denaturują DNA wymienia się: wysokie pH, alkohole, fenole, a także wysoką temperaturę, ultradźwięki i promieniowanie. 
W warunkach doświadczalnych, do indukcji procesu denaturacji używa się formamidu (HCONH2) i mocznika (H2NCONH2). Związki te odpowiedzialne są za rozrywanie wiązań wodorowych cząsteczek wody przez co uniemożliwiają umiejscowianie się wody pomiędzy zasocjowanymi warstwowo hydrofobowymi zasadami azotowymi, doprowadzając tym samym do denaturacji kwasów nukleinowych [9].  Proces denaturacji jest odwracalny. W tym celu należy usunąć czynnik denaturujący. Wtedy też ma miejsce odtworzenie komplementarnej struktury podwójnej helisy DNA. Zjawisko to określa się mianem renaturacji [9].

Badania kwasów nukleinowych w Polsce

W połowie ubiegłego wieku, w Warszawie zostały zainicjowane przez David’a Shugar’a badania nad uszkodzeniami kwasów nukleinowych przez promieniowanie ultrafioletowe i promieniowanie gamma. Zespół badawczy  D. Shugar’a w latach 1950-1970 był jednym z wiodących na świecie, pod względem tematyki wpływu promieniowania na uszkodzenie DNA.  Przeprowadzone przez ten zespół badania nad termodynamiczną stabilnością dwuniciowych, a także syntetycznych polirybonukleotydów, potwierdziły budowę modelu DNA przedstawionego  przez Watsona i Cricka [5].

Choć kwasów nukleinowe badane są od ponad 100 lat, to nadal prowadzone są doświadczenia, które mają na celu zgłębienie struktury i właściwości tych małych, a jakże niezwykłych i niezbędnych cząsteczek.  

Literatura :

1 ''Biochemia'' P. Tadeusz Kąkol Świat Książki Wa-wa 2000r

2 http://laboratoria.net/artykul/12068.html

3 ''Biochemia Harpera”