1

Dr hab. n. med. Sylwia Kwiatkowska

Klinika Gru licy i Chorób P uc

ód 2003

Bakteriologia

Bakteriologia

gru

gru

licy

licy

Klasa - Schizomycetes

Rodzaj - Mycobacterium

Rz d - Actiomycetales

Rodzina - Mycobacteriacae

Klasyfikacja pr tków

M. tuberculosis

M. bovis

M. microti

M. africanum

M. canettii

atenuowana forma

M. bovis BCG

Mycobacterium tubeculosis complex

Pr tki szybko rosn ce

Pr tki niefotochromogenne

Pr tki skotochromogenne

Pr tki fotochromogenne

Grupa pr tków atypowych

M. fortuitum

M. phlei

M. smegmatis

M. vaccae

IV

M. avium

M. intracellulare

III

M. aquae

M. scrophulaceum

M. marinum
M. gordonae

II

M. kansasii

I

Przedstawiciele

Podzia pr tków atypowych

wg Runyona

Materia y, w których poszukujemy pr tków

u chorych na gru lic

uc

Plwocina spontaniczna

Plwocina indukowana

Pop uczyny

dkowe

Pop uczyny krtaniowe

Specimeny bronchoskopowe

Bronchoaspirat
materia z cewnikowania
materia ze szczoteczkowania
BALF

Metody wykrywania pr tków

Bakterioskopia

Met. Ziehl-Neelsena

Met. fluorescencyjna

- auramina
- rodamina
- oran akrydyny

Wynik

+ - pojedyncze pr tki w preparacie
++ - pojedyncze pr tki w poszczególnych polach widzenia
+++ - liczne pr tki w poszczególnych p.w.

1.

2

Bakterioskopia

Met. Bakterioskopii – szybka, tania,

o niskiej czu

ci i swoisto ci

Nie odró nia pr tków gru licy od pr tków

atypowych, w tym saprofitycznych

oty standard w diagnostyce bakteriologicznej gru licy

Czu

80-85% - wykrywa 10 pr tków w 1 ml badanego materia u

Swoisto

98-100%

Uzyskany t metod wzrost pr tków umo liwia ich dok adn identyfikacj

Wyhodowanie pr tków umo liwia przeprowadzenie testów lekowra liwo ci

Uzyskanie hodowli pr tków umo liwia za pomoc metod genetycznych
prze ledzenie

cucha epidemiologicznego

Metoda hodowli

2.

Metoda hodowli

Najcz

ciej u ywane pod

e

to pod

e Lowensteina-Jensena

Pr tki rosn wolno 3-8 tygodni

Ocena nasilenia pr tkowania

(+) - do 20 kolonii, wynik podawany jest liczb
+ - liczba kol. 20-100
++ - 100-200, wzrost policzalny
+++ - powy ej 200 kol., wzrost zlewny, niepoliczalny

Pr tki widoczne nierosn ce –
bacillus visibles non viables

widoczne w badaniu mikroskopowym,

ale nie rosn na odpowiednich pod

ach

Ich obecno

czy si ze skuteczn terapi

Liczba ich wzros a po wprowadzeniu rifampicyny

Metoda hodowli

Hodowla pr tków w systemie Bactec 460

Metoda Bactec 460

Metoda jest szczególnie u yteczna w wykrywaniu
pr tków w materia ach sk popr tkowych:

• p yn op ucnowy
• p yn mózgowo-rdzeniowy
• plwocina od chorych ze zmianami

minimalnymi w p ucach

Wzrost pr tków wyst puje pod koniec
pierwszego tygodnia, test lekowra liwo ci
trwa nast pny tydzie (dotyczy leków
pierwszej linii terapii)

3

Metoda MB/BacT

Pr tki rosn na pod

u Middlebrooka 7H9,

a wytwarzany dwutlenek w gla powoduje zmian
zabarwienia sensora umieszczonego w dnie butelki
z zielonej na

Sygna detekcyjny w sposób ci

y

przekazywany jest do komputera,
który rejestruje intensywno

wzrostu pr tków

MB/BacT

Bactec 460

L-J

Mycobacterium
tuberculosis
complex

84,5

91,2

70,9

Odsetek dodatnich wyników

w ró nych metodach hodowli

Metody serologiczne

Odpowied humoralna w gru licy nie ma charakteru
ochronnego.

Odpowied humoralna ro nie wraz ze wzrostem
zaawansowania zmian.

Badania serologiczne istotne w gru licy wieku
dzieci cego oraz pozap ucnej.

Stosowana jest metoda ELISA oceniaj ca obecno
przeciwcia w stosunku do antygenu 38kDa i A60.

Czu

tej metody 30-70% (w p ynie op ucnowym

50%)

Metody genetyczne

Oparta jest na zjawisku hybrydyzacji pojedynczej
nici kwasów nukleinowych
z komplementarnym

cuchem polinukleotydowym.

Sondy mog by ró nej d ugo ci, znakowane

izotopami i wykrywane przy pomocy licznika

scyntylacyjnego, lub fosfataz alkaliczn
i wykrywany w reakcjach barwnych,
lub za pomoc fluorescencji (oran akrydyny).

1. Sonda genetyczna

Warunkiem jej przeprowadzenia jest znajomo
sekwencji nukleotydowej otaczaj cej powielany
fragment tak, aby mo na uzyska jego
komplementarny odcinek – tzw. „starter” (primer).

Najcz

ciej powielanym fragmentem genomu pr tka

jest sekwencja insercyjna IS 6110,
a w nast pnej kolejno ci IS 986,
gen koduj cy HSP 65 kDa

2. Reakcja

cuchowa polimerazy (PCR)

Metody genetyczne

PCR polega na wielokrotnej amplifikacji wybranych
odcinków genomu pr tka

Etapy reakcji

cuchowej polimerazy (PCR)

Metody genetyczne

denaturacja w temp 95

o

C 1-3 min z uzyskaniem

pojedynczej nici DNA

do czenie w temp 50-72

o

C starterów (0,5 – 3 min)

synteza DNA przy pomocy termostabilnej polimerazy
Taq w temp 72

o

C (0,5 – 3 min)

Liczba cykli 30-40.
Zamplifikowany produkt wykrywa si przy pomocy
znakowanych sond.

4

Przebieg reakcji

cuchowej polimerazy

Metody genetyczne

Równie swoista dla M. tuberculosis complex.

Amplifikuje si sekwencj kwasu nukleinowego
koduj

antygen b (PAB).

Dwie pary oligonukleotydowych znakowannych
sond hybrydyzuj z komplementarn nici DNA.

Termostabilna polimeraza wype nia brakuj cy
odcinek pojedynczej nici DNA.

3. Reakcja

cuchowa ligazy

Metody genetyczne

Ligaza kowalencyjnie czy dwie s siaduj ce sondy.

Zamplifikowany produkt absorbowany jest na
mikrocz steczkach.

Detekcja odbywa si w oparciu o reakcj
fluorescencji w specjalnym analizatorze.

Reakcja

cuchowa ligazy

Metody genetyczne

Wykrywa pr tki M. tuberculosis complex ywe
i martwe.

rednia czu

70-100%.

W materia ach sk popr tkowych waha si pomi dzy
46 a 70%.

Dolna granica wykrywalno ci 10 pr tków
w badanym materiale.

Reakcja

cuchowa polimerazy i ligazy

Metody genetyczne

Identyfikuje poszczególne szczepy pr tków,
wykorzystywana zw aszcza w badaniach
epidemiologicznych.

Ocenia ona ilo

oraz umiejscowienie w genomie

pr tka sekwencji insercyjnej IS 6110 (1355 par
zasad).

4. Polimorfizm d ugo ci

fragmentów restrykcyjnych (RFLP)

5

• ekstrahowanie DNA z komórek pr tków
• poddanie go dzia aniu enzymów

restrykcyjnych

• rozdzielenie fragmentów restrykcyjnych

na elu agarozowym

• przeniesienie rozdzielonego materia u

na nylonowe membrany

• hybrydyzacja ze znakowanymi sondami

komplementarnymi do 245 par zasad
fragmentu IS 6110

• odczyt komputerowy – uk ad i ilo

linii

• odpowiada wielko ci poszczególnych

fragmentów.

Etapy RFLP

Metody genetyczne

Warunkiem zastosowania w badaniach
epidemiologicznych okre lonego markera
genetycznego (np. IS 6110) jest - z jednej strony -
jego zmienno

, wyst puj ca wystarczaj co szybko,

aby szczepy niezwi zane

cuchem

epidemiologicznym by y ró ne. Natomiast - z drugiej
strony – powinien on by na tyle sta y, aby szczepy
po czone ze sob by y identyczne. Okres
pó trwania dla IS 6110 wynosi 3-4 lata i wydaje si
spe nia te wymogi.

Metody genetyczne

Wynik metody RFLP

Gran Canaria

1991-1996 rok

960 chorych

56%

Reactivatio endogenes
nie zako czyli leczenia
oporno c na leki

44%

Reinfectio egzogenes
zako czyli prawid owo
leczenie

18 chorych 2× zachorowa o

w okresie co najmniej 12 m-cy

Wsk. zap. 30

Am. J. Respir. Crit. Care
Med.. 1994 r.

Metody chromatogaficzne

Liczba i rodzaj kwasów mykolowych s
charakterystyczne dla ka dego gatunku.

Rozdzia wyekstrahowanych kwasów mykolowych
na specjalnych kolumnach
a uzyskane wzory elucyjne s swoiste dla danego
gatunku pr tka

Chromatografia p ynna wysokoci nieniowa
HPLC (High Preassure Liquid Chromatography)

pierwotna

lekooporno

wtórna

1987-1991 rok

17 chorych HIV+ pr tkuj cych w posiewie co najmniej 1 rok

I grupa
(ten sam szczep)
zachowana
wra liwo
na leki
p. pr tkowe

(ten sam
szczep)
lekooporno
pierwotna

i wtórna

4 chorych
I-szy szczep – zachowana
wra liwo

na leki

II nowy szczep
wielolekooporny

(lekooporno

pierwotna wtórnie nabyta)

New York

N Engl. J. Med. 1999 r.

6

Lekowra liwo

pr tków

W Polsce badanie lekowra liwo ci przeprowadza si :

1. Metod wska nika RR (Resistance Ratio) =

minimalne st

enie leku hamuj ce wzrost szczepu

badanego / minimalne st

enie leku hamuj ce

wzrost szczepu H37Rv
RR > 4 dla hydrazydu i strepromycyny
RR > 8 dla PAS

2. Metod proporcji z ocen krytycznego odsetka

oporno ci

szczepy oporne