Bakteriologia gruźlicy

Adriana Vrba

Klinika Gruźlicy Chorób i Nowotworów Płuc

www.infectiousdiseasenews.com/200711/
genetics.asp

„ODDECH CHOREGO NA SUCHOTY MOŻE
NISZCZYĆ PŁUCA DRUGIEGO CZŁOWIEKA”

Beniamin Marten w 1722 r.

24 marca 1882 roku R. Koch poinformował świat

naukowy o tym, że udało mu się odkryć i wyizolować

bakterię wywołująca gruźlicę

Ponad 73% polskich lekarzy nie czuje się
odpowiednio przygotowanych do rozpoznawania i
leczenia gruźlicy - wynika z sondażu
przeprowadzonego przez największy portal
społeczności owy dla lekarzy

Stanowisko systematyczne Mycobacterium

Królestwo:

Procaryota

Klasa:

Actinobacteria

Rząd:

Actinomycetales

Podrząd:

Corynebacterineae

Rodzina:

Mycobacteriaceae

Rodzaj:

Mycobacterium

Mycobacteriaceae

– myces – bacterium

(grzyb) (bakteria)

http://fascinatinghistory.blogspot.com/2005_07_01_archive.html

Czas potrzebny do uzyskania hodowli prątków

Prątki wolno rosnące

– 4-8 tyg.

Prątki szybko rosnące

- 5-10 dni

Czas generacji E.coli ok. 27min

Czas generacji prątków zjadliwych- kilkadziesiąt godzin

Klasyfikacja prątków - Meissner

A. Prątki właściwe:

M. tuberculosis

complex

B. Prątki atypowe

wolno rosnące:

I. Foochromogenne

II. Skotochromogenne

III. Niefotochromogenne

C. Prątki szybko rosnące

M.smegmatis

M.phlei

M.fortuitum

Ze względu na rodzaj wywoływanej choroby prątki dzieli się na:

- Mycobacterium tuberculosis complex

-klasyczna postać gruźlicy,

- Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT)-

mykobakteriozy

Mycobacterium tuberculosis complex

M.tuberculosis

M.bovis

M.africanum

M.microti

M.canetti

Unikalne cechy Mycobacterium

tuberculosis complex :



Ściana komórkowa z dużą

ilością lipidów



Kwasooporne



Alkoholooporne



Przeżywają kilka miesięcy w stanie wysuszonym

Oporność prątków na działanie kwasów, zasad czy

wysychanie jest uwarunkowane posiadaniem

nietypowej ściany komórkowej

Ściana komórkowa Mycobacterium tuberculosis zasługuje

na specjalną uwagę ponieważ, jest strukturą unikalną u

Prokaryota i determinuje wirulencję prątków. Głównym jej

budulcem są lipidy stanowiące do 60% ściany

komórkowej. Do najważniejszych komponentów ściany

komórkowej odpowiedzialnych za nadawanie prątkom

wyżej wymienionych właściwości należą

:

1. kwasy mykolowe

2. Czynnik
wiązkowy

3.
Lipoarabinomannan

4. Powierzchniowe
sulfatydy

5. MDP - dipeptydy
muramylowe

kwasy mikolowe

- hydroksykwasy

podstawione w pozycji α dwoma łańcuchami

alifatycznymi o zróżnicowanej długości.

Mycobacterium tuberculosis syntetyzuje

trzy klasy kwasów mikolowych. Odpowiadają

one za utworzenie silnie hydrofobowej

powierzchni. Kwasy mikolowe są uważane za

bardzo ważny czynnik determinujący

wirulencję prątków. To one warunkują

oporność prątków na kwasy, zasady oraz

wysychanie.

Czynnik wiązkowy

- to dimikolan trehalozy

odkryty przez R. Kocha. Jest on

immunogenny i ma zdolność do

wzbudzania produkcji swoistych

przeciwciał (Ab). Odpowiada on za

zahamowanie migracji makrofagów (MØ) i

ich przeciwprątkowej aktywności. Jest

toksyczny dla komórek ssaków.

Odpowiada za serpentynowaty wzrost

prątków na podłożach sztucznych.

Lipoarabinomannan (LAM)

- to ważny czynnik

wirulencji prątków. Odpowiada on za

upośledzony killing tj. zabijanie prątków przez

MQ, gdyż hamuje powstawanie wolnych

rodników tlenkowych. Czynnik ten hamuje

odpowiedź MØ na IFN-γ, co jest równoznaczne z

hamowaniem aktywacji MØ

Powierzchniowe sulfatydy

ściany komórkowej

mikobakterii, które hamują fuzję fagosomów z

lizosomami. Fagosomy stają się wówczas

bezpiecznym miejscem bytowania prątków.

Ponadto hamują one wybuch tlenowy

MDP - dipeptydy muramylowe

-

nieswoiście nasilają

adaptacyjną odporność komórkową

.

Mycobacterium other than tuberculosis

Prątki zaliczane do tej grupy mogą wywoływać różne postacie chorób,

określanych wspólnym mianem mykobakterioz. Choroby te występują

znacznie rzadziej niż klasyczna gruźlica. Zwykle dotyczą osób

ze szczególnymi predyspozycjami – z zaburzonymi funkcjami układu

immunologicznego

Podział prątków atypowych (MOTT) wg Runyona:

Grupa prątków

Gatunek

Barwa hodowli

I

Fotochromogenne

M. kansasii
M. simiae

Brak zabarwienia

kolonii bez dostępu

światła. Żółte lub

pomarańczowe po

naświetleniu

II

Skotochromogenn

e

M.scrophulaceu

m
M. gordonae
M.xenopi

Żółtopomarańczowe

zabarwienie kolonii

bez względu na

światło

II
I

Niefotochromogen

ne

M.avium
M.intracellulare

Słabo zabarwione lub

bezbarwne kolonie

IV

Szybkorosnące

M.fortuitum
M.phlei

U większości

gatunków kolonie

bezbarwne

Mycobacterium leprae

(prątek trądu) nie jest

zaliczany

do żadnej z powyższych grup. Nie da się go

hodować na

pożywkach sztucznych ani hodowlach

komórkowych.

Specjalne podłoże

półsyntetyczne-półpłynne MY pozwala uzyskać

hodowlę po

23-43tyg.

Jedynym zwierzęciem wrażliwym na zakażenie

M.leprae

jest pancernik.

Według definicji Światowej Organizacji

Zdrowia

za przypadek gruźlicy uważa się

przypadek potwierdzony

bakteriologicznie,

a zatem badanie to zawsze musi

towarzyszyć innej diagnostyce klinicznej

Badaniu w kierunku gruźlicy należy

poddać co najmniej 3 różne materiały

pochodzące od pacjenta.

Czym kierować się przy wyborze

metody diagnostycznej:

Przypadek do wykluczenia

hodowla na

pożywce
Lewensteina-
Jensena

Przypadek do potwierdzenia

dorosły czy

dziecko

postać gruźlicy
wynik

bakterioskopii

wspólne

uzgodnienia
lekarza i laboratorium

Diagnostyka mikrobiologiczna gruźlicy

1. Wykrycie prątków w materiale badanym

2. Sklasyfikowanie patogenu

3.Określenie wrażliwości na stosowane w terapii leki

4. Badanie stopnia odprątkowania chorego w trakcie leczenia

Materiały do badań – podejrzenie gruźlicy płuc :



plwocina

:

- spontaniczna

- indukowana

 Popłuczyny żołądkowe



Popłuczyny oskrzelowe



Płyn uzyskany w trakcie płukania oskrzelowo-pęcherzykowy



Bronchoaspirat

Materiał ze szczotkowania

Materiał z oligobiopsji-wycinek

Plwocina

-

najodpowiedniejszy materiał w przypadku podejrzenia gruźlicy

układu oddechowego. Zaleca się pobranie 3 plwocin od jednego chorego.

Ślina jest materiałem nieprzydatnym!!!

Popłuczyny żołądkowe-

pobiera się od pacjentów nie wykrztuszających plwociny.

Trudny materiał diagnostyczny –enzymy soku żołądkowego działają na komórki

prątków (fałszywie ujemny wynik).

Wyższa wykrywalność u kobiet i dzieci-wrodzona tendencja do połykania

plwociny.

Płyn oskrzelowy-

pobierane podczas bronchoskopii. Pozwala często na

wykrycie prątków u chorych z negatywnym wynikiem popłuczyn żołądkowych.

Materiały do badań- podejrzenie gruźlicy

narządowej :

Mocz-

gruźlica nerek i dróg moczowych

Wyskrobiny z kości-

gruźlica kostno stawowa

Płyn mózgowo-rdzeniowy-

gruźlicze zapalenie

opon mózgowo rdzeniowych

Krew menstruacyjna-

gruźlica narządu rodnego

Materiały kliniczne badane w kierunku

obecności prątków

Rodzaj materiału

Minimalne ilości

Plwocina

10-15 ml

Popłuczyny pęcherzykowo-

oskrzelowe (BAL)

Ok.5-10 ml

Aspirat oskrzelowy

Ok.5-10 ml lub na szczoteczce

Popłuczyny żołądkowe

30-60 ml

Płyn z jamy opłucnej

10-15 ml lub bioptat z opłucnej

Płyn z worka osierdziowego

3-5 ml

Płyn mózgowo-rdzeniowy

2 ml

Mocz

200 ml

Krew

5-10 ml tylko od chorych na

AIDS i z niedoborami

immunologicznymi

1. Bakterioskopia

2. Metody hodowli

Metody wykrywania mykobakterii

3. Metody serologiczne

4. Metody genetyczne

Metody historyczne

• Barwienie Z-N
• Hodowla L-J
• Typowanie

biochemiczne

Metody nowoczesne

•

Obraz mikroskopowy
prątków w rozmazie

•

Hodowle płynne

•

Typowanie w metodzie
radioizotopowej, HPLC

•

Wykrywanie DNA, RNA

•

Badanie
pokrewieństwa
genetycznego

1. Bakterioskopia

Stwierdzenie obecności prątków w rozmazach wykonanych

z materiału klinicznego barwionego i oglądanego w mikroskopie

świetlnym lub fluorescencyjnym.

Metoda Ziehla Neelsena (Z-N)-

potwierdzenie kwasooporności

prątków

Metoda fluorescencyjna:

- Auramina

- Rodamina

- Oranż akrydyny

http://pathtalk.org/archives/22

www.lung.ca/tb/images/

Interpretacja badania bakterioskopowego

Liczba
prątków w

preparacie

BK (AFB)

Interpretacja
wyniku

1-9 w 100
polach
widzenia

+

Skąpe
prątkowane

1-9 w 10
polach
widzenia

++

Obfite
prątkowanie

1-9 w każdym

polu widzenia

+++

Bardzo obfite

prątkowanie

Badanie mikroskopowe to jedno z najważniejszych badań

w diagnostyce gruźlicy......

•

proste w wykonaniu

•

tanie

•

szybkie (ok.2h)

•

mało swoiste

•

mała czułość

•

10 000 komórek prątków w 1 ml

•

nie można odróżni prątków saprofitycznych

od chorobotwórczych

2. Wyhodowanie prątków

-

Złoty standard

-metoda bardziej czuła niż bakterioskopia

- umożliwia wykrycie małej ilości prątków
(ok. 10 kom/ml)

- typowanie wyhodowanego gatunku

-testy lekowrażliwości

- genetyczne prześledzenie łańcucha
epidemiologicznego

Przed posianiem materiał musi być poddany upłynnieniu,
dekontaminacji i zagęszczeniu

Opracowaną próbkę posiewa się na specjalne pożywki których skład jest

optymalny dla rozwoju prątków oraz hamuje rozwój innych bakterii.

Najczęściej używa się podłoża Lewensteina-Jensena

oraz Middlebrooka.

W trakcie prowadzenia hodowli (do 10 tyg.) prowadzone są

co tygodniowe odczyty.

Septi-Chek AFB

3 płytki do hodowania M.tuberculosis, MOTT i zanieczyszczeń

umieszczone są w jednej butelce.Dodatkowo, prowadzi się hodowlę

na podłożu płynnym. Wzrost prątków odczytywany jest wizualnie

już po 7 dniach.

www.bd.com/ds/productCenter/MT-Ma
nual.asp

MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube)

www.bd.com/ds/productCenter/BactecMgit9
60Myco...

Płynny system hodowli na pożywce

Middlebrooka 7H9 z odczynnikiem

fluorescencyjnym który reaguje

na stężenie O

2

w pożywce. Wzrost

odczytywany jest po 7-8 dn. jako

pomiar reakcji fluorescencyjnej (UV).

MB Redox

Płynny system hodowli na podłożu wzbogaconym w surowicę

z dodatkiem soli tereazolowych, które w wyniku aktywnego

metabolizmu prątków ulegają redukcji do barwnego formazanu.

Wzrost mykobakterii oceniany jest wizualnie,

na podstawie barwnego produktu (od żółtego do czerwonego).

Bactec 460-Tb

www.bd.com/scripts/philippines/products
drilld...

Hodowla w pożywce 7H9 zawierającej jako substrat

wzrostowy kwas palmitynowy znakowany

izotopem węgla

14

C. W czasie wzrostu prątki

zużywają substrat i wydalają

14

CO

2

. Mierzona

radioaktywność to tzw. indeks wzrostu.

Odczyt 2-3 razy w tyg. wyniki już po 6 dn.

Diagnostyka materiałów skąpoprątkowych.

Kolorymetryczny system MB/BacT

Prątki hodowane są na pożywce 7H9 a wytwarzany CO

2

powoduje zmianę zabarwienia sensora umieszczonego

na dnie butelki z zielonej na żółtą. Sygnał detekcyjny

w sposób ciągły przekazywany jest do komputera który

rejestruje intensywność wzrostu prątków

Odsetek dodatnich wyników w różnych

metodach hodowli

MB/BacT

Bactec

460

L-J

Mycobacteri

um

tuberculosis

complex

84,5

91,2

70,9

3. Metody serologiczne

Badania serologiczne istotne w gruźlicy wieku dziecięcego oraz

pozapłucnej.

Stosowana jest metoda ELISA oceniająca obecność

Ab przeciwko Ag 38kDa oraz A60.

Czułość tej metody to 30-70 %

Odporność przeciwko prątkom ma charakter
komórkowy a nie humoralny. Odporność
humoralna rośnie wraz ze wzrostem
zaawansowania zmian.

4. Metody genetyczne:

Sondy genetyczne

Polimerazowa reakcja łańcuchowa PCR

Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych RFLP

Chromatografia

W 1998r S.T. Cole i wsp. opublikowali

w swej pracy pełną sekwencję genomu prątka gruźlicy

należącego do szczepu H37Rv

Sondy genetyczne

Poprzez wykorzystanie naturalnej zdolność kwasów nukleinowych do tworzenia

hybryd pomiędzy komplementarnymi łańcuchami polinukleotydowymi,

konstruuje się sondy genetyczne złożone z różnej liczby nukleotydów.

Zastosowanie sondy wymaga wcześniejszego namnożenia bakterii

do odpowiedniej gęstości 10

8

-10

9

komórek.

Wyznakowane radioaktywnie lub fluorescencyjnie fragmenty

RNA lub jednoniciowego DNA o sekwencji komplementarnej do

jednej z nici poszukiwanego genu.

Schemat wykonywania badania z użyciem

sondy genetycznej

I. Liza komórek prątków,

oczyszczenie kw. nukleinowych

II. Reakcja z sondami związanymi z

chemicznym znacznikiem

(estry akrydyny, alkaliczna fosfataza)

III. Włączenie znacznika po rozpoznaniu sekwencji

komplementarnej do sondy- powstanie

dwuniciowej hybrydy

IV. Oddzielenie dwuniciowych cząsteczek od jednoniciowych.

Obecność hybrydy wykrywa się metodą chemiluminescencj lub

dodając substrat dla alkalicznej fosfatazy-reakcja barwna.

PCR – polimerazowa reakcja łańcuchowa

Umożliwia wykrycie kwasów nukleinowych prątków

bezpośrednio w materiałach klinicznych. Polega na wielokrotnej

amplifikacji wybranych odcinków genomu prątka. Najczęściej

amplifikowanymi sekwencjami są wstawki insercyjne IS 6110,

IS 986, antygeny HPB 70 i HPB 64.

Zamplifikowany produkt wykrywa się przy pomocy

znakowanych sond.

Sekwencje insercyjne to krótkie fragmenty DNA (500-3000 pz.),

będące rodzajem elementów transpozycyjnych.

W przypadku M. tuberculosis wykazano wysoką stabilność tych elementów

co umożliwiło prowadzenie badań bez ryzyka wpływu transpozycji

na uzyskiwane wzory prążków.

Przebieg

reakcji PCR

http://www.wiw.pl/Biologia/Genetyka/JezykGenow/BigImage.asp?ce=28&cp=1

Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych

RFLP

Metoda ta służy do wykrywania różnic w budowie

DNA u różnych szczepów M.tuberculosis głównie

w celach epidemiologicznych.

Oceniana jest ilość oraz umiejscowienie w genomie

prątka sekwencji insercyjnej IS 6110. Wcześniej pocięte

enzymami restrykcyjnymi fragmenty DNA bakterii

ulegają hybrydyzacji ze znakowanymi sondami.

Układ fragmentów restrykcyjnych (prążków) jest

charakterystyczny dla danego gatunku,

można więc go użyć do identyfikacji

gatunku, lub nawet szczepu bakterii.

Etapy reakcji RFLP:

1.Ekstrahowanie DNA z komórek prątków

2. Poddanie go działaniu enzymów restrykcyjnych

3.Rozdzielenie fragmentów restrykcyjnych na żelu agarozowym

4. Przeniesienie rozdzielonego materiału na nylonową membranę

5.Hybrydyzacja ze znakowanymi sondami komplementarnymi do

fragmentu insercyjnego IS6110

6. Odczyt komputerowy układu i ilości linii odpowiada

wielkość poszczególnych fragmentów

www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0325
-754120...

Epidemiologia molekularna gruźlicy lek. Michał Krawczyk, prof. dr hab. n med.
Sylwia Kwiatkowska

Analiza RFLP 20 szczepów klinicznych M. tuberculosis od pacjentów z gruźlicą
płuc z terenu Łodzi

Metody chromatograficzne- cieczowa

chromatografia wysokociśnieniowa

Ocenia się różnice w składzie ilościowym i jakościowym kwasów

mykolowych u prątków.

Rozdział wyekstrahowanych kwasów mykolowych zachodzi na

specjalnych kolumnach a uzyskane wzory elucyjne są swoiste

dla danego gatunku prątka.

Wykorzystanie metod biologii

molekularnej gruźlicy

Porównując poszczególne genotypy można odnaleźć szczepy,

które charakteryzują się identycznymi wzorami. Świadczyć to

może o transmisji danego szczepu w środowisku.Różne genotypy

stanowią o różnych źródłach zakażenia. Można tym samy śledzić

ewentualne ogniska epidemii gruźlicy lub też wykazać dużą liczbę

jednocześnie występujących, niezwiązanych ze sobą przypadków choroby.

Analiza szczepów wyizolowanych od jednego pacjenta w różnych

punktach czasowych, w przypadku kolejnego zachorowania na gruźlicę.

Ponowne wyizolowanie szczepu o tym samym genotypie stanowi dowód

na reaktywację endogenną. Wówczas możemy kierować się pierwotnie

uzyskanym wzorem lekowrażliwości. Uzyskanie szczepu

odmiennego wskazuję na infekcję egzogenną.

Metody genotypowania są pomocne w udokumentowaniu krzyżowego

zakażenia próbek laboratoryjnych co jest szczególnie istotne w przypadkach

wątpliwego obrazu klinicznego i radiologicznego w kontekście rozpoznania gruźlicy

Porównanie zalet (+) i wad (-) tradycyjnych i nowoczesnych metod wykrywania prątków gruźlicy i

atypowych

Bakterioskopia bezpośrednia

(+) (-)

Czas wykonania ok. 2h

Nie różnicuje prątków

żywych i martwych

Nie różnicuje gatunków

prątków (gruźlica, mykobakteriozy,

zanieczyszczenie saprofitem

Metody biologii molekularnej- sondy genetyczne, PCR

(+) (-)

Czas wykonania badania- kilkanaście

godzin

Czułość 70%-90 %

Swoistość 100 %

Nie różnicuje gatunków żywych

i martwych

Konieczność wyszkolenia personelu

Specjalistyczna aparatura

Wysoka cena badania

Kliniczny materiał diagnostyczny

Hodowle na pożywkach

Typowanie gatunku

Posiew na pożywce L-J

(+) (-)

Potwierdzenie obecności żywych

prątków

Pozyskanie szczepu do typowania

gatunku i badania lekowrażliwości

Czułość ok. 70%

Niska cena

Czas oczekiwania na wynik

ok. 6 – 8 tyg.

Posiew na pożywce 7H9- badanie w systemie Bactec 460TB, MB Redox, MGIT

(+) (-)

Potwierdzenie obecności żywych prątków

Pozyskanie szczepu do typowania gatunku

i badania lekowrażliwości

Czułość 70 %

Skrócony czas oczekiwania na wynik

Specjalistyczny sprzęt

Wyszkolenie personelu

Wysokie ceny badania

Typowanie tradycyjnymi metodami mikrobiologiczno-bioche-

micznymi

(+) (-)

Spopularyzowane metody

podręcznikowe

Czas wykonania 28-42 dn.

Typowanie metodami analizy kwasów mykolowych- HPLC

(+) (-)

Czas wykonania-kilkanaście godzin

 swoistość 90%

Możliwość rozróżnienia ponad

30 gatunków Mycobacterium

Specjalistyczna aparatura

 wyszkolony personel

1. Do jakich 2 grup należą prątki mogące być patogenami człowieka?

Mycobacterium tuberculosis complex, MOTT

2. Twórcą jakiej klasyfikacji był Runyon i w oparciu o jaką cechę drobnoustrojów ją stworzył?

Sklasyfikował prątki atypowe w oparciu o barwę kolonii

3. Jaki materiał pobieramy od pacjenta przy podejrzeniu gruźlicy płuc?

Plwocina, popłuczyny żołądkowe, popłuczyny oskrzelowe, wycinek,

płyn oskrzelowo-pęcherzykowy, bronchoaspirat, materiał ze szczotkowania

4. Co stanowi złoty standard w diagnostyce mikrobiologicznej gruźlicy?

Wyhodowanie prątków

5. Dlaczego stosowanie diagnostyki serologicznej jest ograniczone?

Odpowiedź przeciwko prątkom gruźlicy ma charakter komórkowy

6. Jaki jest cel reakcji PCR?

Amplifikacja wybranego odcinka DNA

7. Czemu w badaniach genetycznych wykorzystuje się IS6110?

Przez wzgląd na jej stabilność- brak ryzyka transpozycji

8. W jakich celach wykorzystuje się analizę fragmentów restrykcyjnych DNA prątków?

Głównie w celach epidemiologicznych

9. Co poddaje się analizie w metodzie cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej

Kwasy mykolowe prątków

10. Główny składnik ściany komórkowej Mycobacterium tuberculosis

Lipidy

Unikalne cechy Mycobacterium tuberculosis

Kwaso-, zasado-, alkoholo-oporne