Dr hab. n. med. Sylwia Kwiatkowska

Klinika Gruźlicy i Chorób Płuc

Dr hab. n. med. Sylwia Kwiatkowska

Klinika Gruźlicy i Chorób Płuc

Łódź 2003

Bakteriologia

Bakteriologia

gruźlicy

gruźlicy

Bakteriologia

Bakteriologia

gruźlicy

gruźlicy

Klasa - Schizomycetes

Rodzaj - Mycobacterium

Rząd - Actiomycetales

Rodzina - Mycobacteriacae

Klasyfikacja prątków

M. tuberculosis

M. bovis

M. microti

M. africanum

M. canettii

atenuowana forma

M. bovis BCG

Mycobacterium tubeculosis complex

Grupa prątków atypowych

Przedstawiciele

I

Prątki
fotochromogenne

M. kansasii

II

Prątki
skotochromogenne

M. aquae

M. scrophulaceum

M. marinum

M. gordonae

III

Prątki
niefotochromogenne

M. avium

M. intracellulare

IV

Prątki szybko rosnące

M. fortuitum

M. phlei

M. smegmatis

M. vaccae

Podział prątków atypowych

wg Runyona

Materiały, w których poszukujemy

prątków

u chorych na gruźlicę płuc

Plwocina spontaniczna

Plwocina indukowana

Popłuczyny żołądkowe

Popłuczyny krtaniowe

Specimeny bronchoskopowe

Bronchoaspirat
materiał z cewnikowania
materiał ze
szczoteczkowania
BALF

Metody wykrywania prątków

Bakterioskopia

Met. Ziehl-Neelsena

Met. fluorescencyjna

- auramina

- rodamina
- oranż akrydyny

Wynik

+ - pojedyncze prątki w preparacie
++ - pojedyncze prątki w poszczególnych polach widzenia
+++ - liczne prątki w poszczególnych p.w.

1.

Bakterioskopia

Met. Bakterioskopii – szybka, tania,
o niskiej czułości i swoistości

Nie odróżnia prątków gruźlicy od
prątków atypowych, w tym
saprofitycznych

Złoty standard w diagnostyce bakteriologicznej gruźlicy

Czułość 80-85% - wykrywa 10 prątków w 1 ml badanego materiału

Swoistość 98-100%

Uzyskany tą metodą wzrost prątków umożliwia ich dokładną identyfikację

Wyhodowanie prątków umożliwia przeprowadzenie testów lekowrażliwości

Uzyskanie hodowli prątków umożliwia za pomocą metod
genetycznych prześledzenie łańcucha epidemiologicznego

Metoda hodowli

2.

Metoda hodowli

Najczęściej używane podłoże
to podłoże Lowensteina-Jensena

Prątki rosną wolno 3-8 tygodni

Ocena nasilenia prątkowania

(+) - do 20 kolonii, wynik podawany jest
liczbą
+ - liczba kol. 20-100
++ - 100-200, wzrost policzalny
+++ - powyżej 200 kol., wzrost zlewny,
niepoliczalny

Prątki widoczne nierosnące –
bacillus visibles non viables

Są widoczne w badaniu mikroskopowym,
ale nie rosną na odpowiednich podłożach

Ich obecność łączy się ze skuteczną terapią
Liczba ich wzrosła po wprowadzeniu rifampicyny

Metoda hodowli

Hodowla prątków w systemie Bactec 460

Metoda Bactec 460

Metoda jest szczególnie użyteczna w
wykrywaniu prątków w materiałach
skąpoprątkowych:

• płyn opłucnowy

• płyn mózgowo-rdzeniowy

• plwocina od chorych ze zmianami

minimalnymi w płucach

Wzrost prątków występuje pod koniec
pierwszego tygodnia, test
lekowrażliwości trwa następny tydzień
(dotyczy leków pierwszej linii terapii)

Metoda MB/BacT

Prątki rosną na podłożu Middlebrooka 7H9,
a wytwarzany dwutlenek węgla powoduje
zmianę zabarwienia sensora umieszczonego w
dnie butelki
z zielonej na żółtą

Sygnał detekcyjny w sposób ciągły
przekazywany jest do komputera,
który rejestruje intensywność wzrostu
prątków

 

MB/BacT

Bactec

460

L-J

Mycobacte
rium
tuberculosi
s complex

84,5

91,2

70,9

Odsetek dodatnich wyników

w różnych metodach hodowli

Metody serologiczne

Odpowiedź humoralna w gruźlicy nie ma

charakteru ochronnego.

Odpowiedź humoralna rośnie wraz ze
wzrostem zaawansowania zmian.

Badania serologiczne istotne w gruźlicy wieku
dziecięcego oraz pozapłucnej.

Stosowana jest metoda ELISA oceniająca
obecność przeciwciał w stosunku do antygenu
38kDa i A60.

Czułość tej metody 30-70% (w płynie
opłucnowym 50%)

Metody genetyczne

Oparta jest na zjawisku hybrydyzacji

pojedynczej nici kwasów nukleinowych

z komplementarnym łańcuchem

polinukleotydowym.

Sondy mogą być różnej długości, znakowane
są izotopami i wykrywane przy pomocy
licznika scyntylacyjnego, lub fosfatazą
alkaliczną
i wykrywany w reakcjach barwnych,
lub za pomocą fluorescencji (oranż akrydyny).

1. Sonda genetyczna

Warunkiem jej przeprowadzenia jest

znajomość sekwencji nukleotydowej

otaczającej powielany fragment tak, aby

można uzyskać jego komplementarny odcinek

– tzw. „starter” (primer).

Najczęściej powielanym fragmentem genomu
prątka jest sekwencja insercyjna IS 6110,
a w następnej kolejności IS 986,
gen kodujący HSP 65 kDa

2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Metody genetyczne

PCR polega na wielokrotnej amplifikacji
wybranych odcinków genomu prątka

Etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

Metody genetyczne

denaturacja w temp 95

o

C 1-3 min z uzyskaniem

pojedynczej nici DNA

dołączenie w temp 50-72

o

C starterów (0,5 – 3

min)
synteza DNA przy pomocy termostabilnej
polimerazy Taq w temp 72

o

C (0,5 – 3 min)

Liczba cykli 30-40.
Zamplifikowany produkt wykrywa się przy pomocy
znakowanych sond.

Przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy

Metody genetyczne

Również swoista dla M. tuberculosis complex.

Amplifikuje się sekwencją kwasu

nukleinowego kodującą antygen b (PAB).

Dwie pary oligonukleotydowych
znakowannych sond hybrydyzują z
komplementarną nicią DNA.

Termostabilna polimeraza wypełnia brakujący
odcinek pojedynczej nici DNA.

3. Reakcja łańcuchowa ligazy

Metody genetyczne

Ligaza kowalencyjnie łączy dwie sąsiadujące
sondy.

Zamplifikowany produkt absorbowany jest na

mikrocząsteczkach.

Detekcja odbywa się w oparciu o reakcję

fluorescencji w specjalnym analizatorze.

Reakcja łańcuchowa ligazy

Metody genetyczne

Wykrywa prątki M. tuberculosis complex żywe

i martwe.

Średnia czułość 70-100%.

W materiałach skąpoprątkowych waha się
pomiędzy 46 a 70%.

Dolna granica wykrywalności 10 prątków
w badanym materiale.

Reakcja łańcuchowa polimerazy i ligazy

Metody genetyczne

Identyfikuje poszczególne szczepy prątków,

wykorzystywana zwłaszcza w badaniach

epidemiologicznych.

Ocenia ona ilość oraz umiejscowienie w

genomie prątka sekwencji insercyjnej IS 6110

(1355 par zasad).

4. Polimorfizm długości

fragmentów restrykcyjnych (RFLP)

• ekstrahowanie DNA z komórek prątków

• poddanie go działaniu enzymów

restrykcyjnych

• rozdzielenie fragmentów

restrykcyjnych
na żelu agarozowym

• przeniesienie rozdzielonego materiału

na nylonowe membrany

• hybrydyzacja ze znakowanymi

sondami komplementarnymi do 245
par zasad fragmentu IS 6110

• odczyt komputerowy – układ i ilość linii

• odpowiada wielkości poszczególnych

fragmentów.

Etapy RFLP

Metody genetyczne

Warunkiem zastosowania w badaniach
epidemiologicznych określonego markera
genetycznego (np. IS 6110) jest - z jednej
strony - jego zmienność, występująca
wystarczająco szybko, aby szczepy
niezwiązane łańcuchem epidemiologicznym
były różne. Natomiast - z drugiej strony –
powinien on być na tyle stały, aby szczepy
połączone ze sobą były identyczne. Okres
półtrwania dla IS 6110 wynosi 3-4 lata i
wydaje się spełniać te wymogi.

Metody genetyczne

Wynik metody RFLP

Gran Canaria

1991-1996 rok

960 chorych

56%

Reactivatio
endogenes
nie zakończyli
leczenia opornośc na
leki

44%

Reinfectio egzogenes
zakończyli prawidłowo
leczenie

18 chorych 2× zachorowało

w okresie co najmniej 12 m-cy

Wsk. zap.
30

Am. J. Respir. Crit.
Care Med.. 1994 r.

Metody chromatogaficzne

Liczba i rodzaj kwasów mykolowych są

charakterystyczne dla każdego gatunku.

Rozdział wyekstrahowanych kwasów

mykolowych na specjalnych kolumnach

a uzyskane wzory elucyjne są swoiste dla

danego gatunku prątka

Chromatografia płynna wysokociśnieniowa
HPLC (High Preassure Liquid Chromatography)

pierwotn

a

lekooporność

wtórna

1987-1991 rok

17 chorych HIV+ prątkujących w posiewie co najmniej 1 rok

I grupa
(ten sam
szczep)
zachowana
wrażliwość
na leki
p. prątkowe

(ten sam
szczep)
lekooporność
pierwotna
i wtórna

4 chorych
I-szy szczep – zachowana
wrażliwość na leki
II nowy szczep
wielolekooporny

(lekooporność pierwotna
wtórnie nabyta)

New York

N Engl. J. Med.
1999 r.

Lekowrażliwość prątków

W Polsce badanie lekowrażliwości przeprowadza

się:

1. Metodą wskaźnika RR (Resistance Ratio) =

minimalne stężenie leku hamujące wzrost

szczepu badanego / minimalne stężenie leku

hamujące wzrost szczepu H37Rv

RR > 4 dla hydrazydu i strepromycyny

RR > 8 dla PAS

2. Metodą proporcji z oceną krytycznego odsetka

oporności

szczepy oporne