Dr hab. n. med. Sylwia Kwiatkowska

Klinika Gruźlicy i Chorób Płuc

Dr hab. n. med. Sylwia Kwiatkowska

Klinika Gruźlicy i Chorób Płuc

Łódź 2003

Bakteriologia 

Bakteriologia 

gruźlicy

gruźlicy

Bakteriologia 

Bakteriologia 

gruźlicy

gruźlicy

 

 

Klasa - Schizomycetes

Rodzaj - Mycobacterium

Rząd - Actiomycetales

Rodzina - Mycobacteriacae

Klasyfikacja prątków

 

 

M. tuberculosis

M. bovis

M. microti

M. africanum

M. canettii

atenuowana forma

 M. bovis BCG

Mycobacterium tubeculosis complex

 

 

Grupa prątków atypowych

Przedstawiciele

I

Prątki 
fotochromogenne

M. kansasii

II

Prątki 
skotochromogenne

M. aquae

M. scrophulaceum

M. marinum

M. gordonae

III

Prątki 
niefotochromogenne

M. avium

M. intracellulare

IV

Prątki szybko rosnące

M. fortuitum

M. phlei

M. smegmatis

M. vaccae

Podział prątków atypowych

wg Runyona

 

 

Materiały, w których poszukujemy 

prątków

u chorych na gruźlicę płuc

Plwocina spontaniczna 

Plwocina indukowana 

Popłuczyny żołądkowe

Popłuczyny krtaniowe

Specimeny bronchoskopowe

Bronchoaspirat
materiał z cewnikowania
materiał ze 
szczoteczkowania
BALF

 

 

Metody wykrywania prątków

Bakterioskopia

Met. Ziehl-Neelsena

Met. fluorescencyjna
     

- auramina

     - rodamina
     - oranż akrydyny

Wynik

+      - pojedyncze prątki w preparacie
++    - pojedyncze prątki w poszczególnych polach widzenia
+++  - liczne prątki w poszczególnych p.w.

1.

 

 

Bakterioskopia 

Met. Bakterioskopii – szybka, tania, 
o niskiej czułości i swoistości

Nie odróżnia prątków gruźlicy od 
prątków atypowych, w tym 
saprofitycznych

 

 

Złoty standard w diagnostyce bakteriologicznej gruźlicy

Czułość 80-85% - wykrywa 10 prątków w 1 ml badanego materiału 

Swoistość 98-100%

Uzyskany tą metodą wzrost prątków umożliwia ich dokładną identyfikację

Wyhodowanie prątków umożliwia przeprowadzenie testów lekowrażliwości

Uzyskanie hodowli prątków umożliwia za pomocą metod 
genetycznych prześledzenie łańcucha epidemiologicznego

Metoda hodowli

2.

 

 

Metoda hodowli

Najczęściej używane podłoże 
to podłoże Lowensteina-Jensena

Prątki rosną wolno 3-8 tygodni

Ocena nasilenia prątkowania

(+)      - do 20 kolonii, wynik podawany jest 
liczbą
+        - liczba kol. 20-100
++      - 100-200, wzrost policzalny
+++    - powyżej 200 kol., wzrost zlewny, 
niepoliczalny

 

 

Prątki widoczne nierosnące – 
bacillus visibles non viables

Są widoczne w badaniu mikroskopowym, 
ale nie rosną na odpowiednich podłożach

Ich obecność łączy się ze skuteczną terapią
Liczba ich wzrosła po wprowadzeniu rifampicyny

Metoda hodowli

 

 

Hodowla prątków w systemie Bactec 460

 

 

Metoda Bactec 460

Metoda jest szczególnie użyteczna w 
wykrywaniu prątków w materiałach 
skąpoprątkowych:

• płyn opłucnowy

• płyn mózgowo-rdzeniowy

• plwocina od chorych ze zmianami 

minimalnymi w płucach

Wzrost prątków występuje pod koniec 
pierwszego tygodnia, test 
lekowrażliwości trwa następny tydzień 
(dotyczy leków pierwszej linii terapii)

 

 

Metoda MB/BacT

Prątki rosną na podłożu Middlebrooka 7H9, 
a wytwarzany dwutlenek węgla powoduje 
zmianę zabarwienia sensora umieszczonego w 
dnie butelki 
z zielonej na żółtą

Sygnał detekcyjny w sposób ciągły 
przekazywany jest do komputera, 
który rejestruje intensywność wzrostu 
prątków

 

 

 

MB/BacT

Bactec 

460

L-J

Mycobacte
rium 
tuberculosi
s complex

84,5

91,2

70,9

Odsetek dodatnich wyników 

w różnych metodach hodowli

 

 

Metody serologiczne

Odpowiedź humoralna w gruźlicy nie ma 

charakteru ochronnego.

 
Odpowiedź humoralna rośnie wraz ze 
wzrostem zaawansowania zmian.

Badania serologiczne istotne w gruźlicy wieku 
dziecięcego oraz pozapłucnej.

Stosowana jest metoda ELISA oceniająca 
obecność przeciwciał w stosunku do antygenu 
38kDa i A60.

Czułość tej metody 30-70% (w płynie 
opłucnowym 50%)

 

 

Metody genetyczne

Oparta jest na zjawisku hybrydyzacji 

pojedynczej nici kwasów nukleinowych 

z komplementarnym łańcuchem 

polinukleotydowym.

 

Sondy mogą być różnej długości, znakowane 
są izotopami i wykrywane przy pomocy 
licznika scyntylacyjnego, lub fosfatazą 
alkaliczną 
i wykrywany w reakcjach barwnych, 
lub za pomocą fluorescencji (oranż akrydyny).

1. Sonda genetyczna

 

 

Warunkiem jej przeprowadzenia jest 

znajomość sekwencji nukleotydowej 

otaczającej powielany fragment tak, aby 

można uzyskać jego komplementarny odcinek 

– tzw. „starter” (primer).

 

Najczęściej powielanym fragmentem genomu 
prątka jest sekwencja insercyjna IS 6110, 
a w następnej kolejności IS 986, 
gen kodujący HSP 65 kDa

2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Metody genetyczne

PCR polega na wielokrotnej amplifikacji 
wybranych odcinków genomu prątka

 

 

Etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

Metody genetyczne

denaturacja w temp 95

o

C 1-3 min z  uzyskaniem 

pojedynczej nici DNA 

dołączenie w temp 50-72

o

C starterów (0,5 – 3 

min) 
synteza DNA przy pomocy termostabilnej 
polimerazy Taq w temp 72

o

C (0,5 – 3 min) 

Liczba cykli 30-40.
Zamplifikowany produkt wykrywa się przy pomocy 
znakowanych sond.

 

 

Przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy

 

 

Metody genetyczne

Również swoista dla M. tuberculosis complex.

Amplifikuje się sekwencją kwasu 

nukleinowego kodującą antygen b (PAB).

Dwie pary oligonukleotydowych 
znakowannych sond hybrydyzują z 
komplementarną nicią DNA.

Termostabilna polimeraza wypełnia brakujący 
odcinek pojedynczej nici DNA.

3. Reakcja łańcuchowa ligazy

 

 

Metody genetyczne

Ligaza kowalencyjnie łączy dwie sąsiadujące 
sondy.

Zamplifikowany produkt absorbowany jest na 

mikrocząsteczkach.

Detekcja odbywa się w oparciu o reakcję 

fluorescencji w  specjalnym analizatorze.

 

 

Reakcja łańcuchowa ligazy

 

 

Metody genetyczne

Wykrywa prątki M. tuberculosis complex żywe 

i martwe.

Średnia czułość 70-100%.

W materiałach skąpoprątkowych waha się 
pomiędzy 46 a 70%.

Dolna granica wykrywalności 10 prątków 
w badanym materiale.

Reakcja łańcuchowa polimerazy i ligazy

 

 

Metody genetyczne

Identyfikuje poszczególne szczepy prątków, 

wykorzystywana zwłaszcza w badaniach 

epidemiologicznych.

Ocenia ona ilość oraz umiejscowienie w 

genomie prątka sekwencji insercyjnej IS 6110 

(1355 par zasad).

4. Polimorfizm długości 

fragmentów restrykcyjnych (RFLP)

 

 

• ekstrahowanie DNA z komórek prątków

• poddanie go działaniu enzymów 

restrykcyjnych

• rozdzielenie fragmentów 

restrykcyjnych 
na żelu agarozowym

• przeniesienie rozdzielonego materiału 

na nylonowe membrany

• hybrydyzacja ze znakowanymi 

sondami komplementarnymi do 245 
par zasad fragmentu IS 6110 

• odczyt komputerowy – układ i ilość linii 

• odpowiada wielkości poszczególnych 

fragmentów. 

Etapy RFLP

Metody genetyczne

 

 

Warunkiem zastosowania w badaniach 
epidemiologicznych określonego markera 
genetycznego (np. IS 6110) jest - z jednej 
strony - jego zmienność, występująca 
wystarczająco szybko, aby szczepy 
niezwiązane łańcuchem epidemiologicznym 
były różne. Natomiast - z drugiej strony – 
powinien on być na tyle stały, aby szczepy 
połączone ze sobą były identyczne. Okres 
półtrwania dla IS 6110 wynosi 3-4 lata i 
wydaje się spełniać te wymogi.

Metody genetyczne

 

 

Wynik metody RFLP

Gran Canaria

1991-1996 rok 

960 chorych

      56%

Reactivatio 
endogenes
nie zakończyli 
leczenia opornośc na 
leki

            44%

Reinfectio egzogenes
zakończyli prawidłowo 
leczenie

18 chorych 2× zachorowało

w okresie co najmniej 12 m-cy

Wsk. zap. 
30

Am. J. Respir. Crit. 
Care Med.. 1994 r.

 

 

Metody chromatogaficzne

Liczba i rodzaj kwasów mykolowych są 

charakterystyczne dla każdego gatunku.

Rozdział wyekstrahowanych kwasów 

mykolowych na specjalnych kolumnach 

a uzyskane wzory elucyjne są swoiste dla 

danego gatunku prątka

Chromatografia płynna wysokociśnieniowa
HPLC (High Preassure Liquid Chromatography)

pierwotn

a

lekooporność

wtórna

1987-1991 rok 

17 chorych HIV+ prątkujących w posiewie co najmniej 1 rok

I grupa 
(ten sam 
szczep) 
zachowana 
wrażliwość 
na leki 
p. prątkowe

(ten sam 
szczep) 
lekooporność 
pierwotna
 i wtórna

4 chorych
I-szy szczep – zachowana 
wrażliwość na leki
II nowy szczep 
wielolekooporny 

(lekooporność pierwotna 
wtórnie nabyta)

New York

N Engl. J. Med. 
1999 r.

 

 

Lekowrażliwość prątków

W Polsce badanie lekowrażliwości przeprowadza 

się:

1. Metodą wskaźnika RR (Resistance Ratio) = 

minimalne stężenie leku hamujące wzrost 

szczepu badanego / minimalne stężenie leku 

hamujące wzrost szczepu H37Rv

RR > 4 dla hydrazydu i strepromycyny

RR > 8 dla PAS

2. Metodą proporcji z oceną krytycznego odsetka 

oporności

szczepy oporne