1

Ć

WICZENIE I

Mikrobiologia środowiska glebowego

– wskaźniki aktywności biologicznej gleby:

I.

Aktywność mikrobiologiczna gleby –

ogólna liczebność drobnoustrojów w glebie

I.1 Metody pośrednie

1.1.A Płytkowa metoda rozcieńczeń

Zasada metody: Zawiesinę gleby o znanym rozcieńczeniu wysiewamy na odpowiednie podłoże i następnie
liczymy wyrosłe kolonie.
Znając rozcieńczenie i liczbę kolonii na płytce możemy obliczyć liczbę drobnoustrojów w 1 g gleby
wyrażaną w liczbie jednostek tworzących kolonie (JTK g

-1

gleby).

Metoda ta może być użyta do porównania liczby organizmów w różnych glebach.
Materiały:
sprzęt: waga analityczna, palnik gazowy, wytrząsarka; szkło: 18 płytek Petriego; ok. 20 pipet a’ 1ml;
gleba; sterylna H

2

O destylowana do wykonania rozcieńczeń; stałe podłoże z wyciągiem glebowym; stałe

podłoże Martina.
Wykonanie:
I etap: przygotowanie i wysiew rozcieńczeń gleby

•

Sterylnie odważyć 10 g gleby do sterylnej kolby Erlenmayera na 250 ml zawierającej 90 ml sterylnej
wody
i zamknąć korkiem.

•

Wstawić kolby na wytrząsarkę (120 obrotów/min) na 15 min.

•

Odczekać na opadnięcie grubszych ziaren gleby i wykonać rozcieńczenia.

•

Do jałowych pustych płytek Petriego wylać po 1 ml odpowiednich rozcieńczeń.

•

Zalać 9 płytek z rozcienczeniami odpowiednimi dla liczenia bakterii i promieniowców rozpuszczonym i
schłodzonym do 60

o

C podłożem z wyciągiem glebowym (po ok. 15 ml na płytkę)

•

Zalać 9 płytek z rozcienczeniami odpowiednimi dla liczenia grzybów rozpuszczonym i schłodzonym do
60

o

C podłożem Martina (po ok. 15 ml na płytkę)

•

Poddać płytki inkubacji przez 7 dni w temperaturze 28

o

C.

II etap: określenie liczebności drobnoustrojów

•

Określić ogólną liczebność bakterii i promieniowców w 1 g suchej masy gleby (jtk g

-1

sm gleby)

uwzględniając liczbę kolonii wyrosłych na płytkach z podłożem z wyciągiem glebowym, wysiane
rozcieńczenie i suchą masę gleby;

•

Określić ogólną liczebność drożdży i grzybów w 1 g gleby (jtk g

-1

sm gleby) uwzględniając liczbę

kolonii wyrosłych na płytkach z podłożem Martina zawierającym róż bengalski i streptomycynę,
.wysiane rozcieńczenie i suchą masę gleby.

•

Zapisać dane i formuły w arkuszu Excel.

I.1.B. Metoda rozcieńczeń i obliczania

najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL) wg Mc Crady’ego.

Gęstość populacji różnych grup bakterii może być szacowana metodą NPL bez obliczania liczby
pojedynczych komórek czy kolonii. Metoda opiera się na określeniu obecności lub nieobecności
drobnoustrojów z użyciem zmniejszających się rozcieńczeń materiału badanego. Zaleceniem tej metody jest,
by naliczane mikroorganizmy selektywnie wytwarzały charakterystyczne metabolity (np. gaz) czy produkty,
które łatwo zidentyfikować z użyciem specjalnego reagenta. Wzrost lub pozytywne testy na specyficzny
produkt są stwierdzane w probówkach po zakończeniu określonego czasu inkubacji (zwykle 7 –14 dni, 24-
30

o

C).

Ztabularyzowane rezultaty są odnoszone do tabel prawdopodobieństwa (Meynell i Meynell 1965, De Man
1975, 1983).
Zasada metody: Liczbę drobnoustrojów można określić metodą rozcieńczeń, zwaną inaczej metodą miana.
Miano jest to najmniejsza ilość badanej gleby lub wody, w której znajduje się przynajmniej jedna komórka
mikroorganizmów. Komórka ta, po zaszczepieniu podłoża odżywczego rozmnaża się, co staje się - po
odpowiednim czasie inkubacji - podstawą do obliczania wartości miana. Jest ono liczbą niemianowaną i jest
równe najwyższemu rozcieńczeniu, w którym po inkubacji stwierdza się wynik dodatni (zmętnienie
pożywki). Oznacza to, że jeżeli np. w szeregu rozcieńczeń od 10

-1

do 10

-6

ostatnią probówką z wynikiem

dodatnim była probówka z rozcieńczeniem 10

-2

, to miano wynosi 0,01.

2

W metodzie tej można uzyskać większą dokładność, jeżeli każde rozcieńczenie badanego materiału

posiewa się na podłoże odżywcze w kilku powtórzeniach, a wyniki końcowe oblicza i podaje, jako tzw.
najbardziej prawdopodobną liczbę żywych drobnoustrojów, posługując się tablicami Mc Crady’ego. Każde
rozcieńczenie badanego materiału posiewa się najczęściej w trzech lub pięciu powtórzeniach, a następnie po
inkubacji ocenia się, czy w każdym powtórzeniu danego rozcieńczenia otrzymano wynik dodatni.

Dla określenia NPL należy najpierw oznaczyć tzw. liczbę charakterystyczną, która składa się z

trzech cyfr. Pierwsza cyfra oznacza liczbę probówek ostatniego rozcieńczenia, w którym stwierdzono we
wszystkich powtórzeniach wynik dodatni; druga i trzecia cyfra jest liczbą probówek z wynikiem dodatnim z
dwóch kolejnych rozcieńczeń. W przypadku, gdy wzrost wystąpił w następnych, większych rozcieńczeniach,
liczbę probówek dodaje się do ostatniej cyfry.
Materiały: sprzęt: waga analityczna, palnik gazowy, wytrząsarka; szkło: 48 probówek i ok. 20 pipet a’ 1ml;
gleba; sterylna H

2

O destylowana do wykonania rozcieńczeń; płynne podłoże Martina (po 4,5 ml) w

probówkach; płynne podłoże z wyciągiem glebowym (po 4,5 ml) w probówkach
Wykonanie:
I etap: przygotowanie i wysiew rozcieńczeń gleby

•

Do sterylnych probówek z płynnym podłożem Matrina przenieść po 0,5 ml rozcieńczeń gleby od 10

-1

do 10

-8

•

Do sterylnych probówek z płynnym podłożem z wyciągiem glebowym przenieść po 0,5 ml rozcieńczeń
gleby od 10

-1

do 10

-8

•

Poddać probówki inkubacji przez 7 dni w temperaturze 28

o

C.

II etap: określenie liczebności drobnoustrojów

•

Analogicznie jak w punkcie 1.1a na podłożu Martina zawierającym róż bengalski i streptomycynę
określić ogólną liczebność drożdży i grzybów w 1 g gleby;

•

Analogicznie jak w punkcie 1.1a na podłożu z wyciągiem glebowym określić ogólną liczebność bakterii
i promieniowców w 1 g gleby

Porównać wyniki (liczebności mikroorganizmów) uzyskane dwiema metodami

Przykład określania liczby charakterystycznej wg Mc Crady’ego.

ROZCIEŃCZENIA

(log)

ZESTAW

1

2

3

4

5

6

7

8

LICZBA

CHARAKTERYSTYCZNA

TRÓJPROBÓWKOWY

3

3

3

3

1

0

0

0

310

PIĘCIOPROBÓWKOWY

5

5

5

5

5

2

1

0

521

Po ustaleniu liczby charakterystycznej ustala się najbardziej prawdopodobną liczbę żywych komórek stosując
odpowiednie tablice.
Wartość odczytaną z tabeli NPL należy pomnożyć przez ostatnie rozcieńczenie z trzema dodatnimi
wynikami.
Stanowi to ilość żywych komórek w 1g gleby lub 1ml wody w zależności od badanego materiału

Najbardziej prawdopodobna liczba żywych komórek wg Mc Crady’ego

(zestaw trójprobówkowy)

LICZBA

CHARAKTERYSTYCZNA

LICZBA

ś

YWYCH KOMÓREK

LICZBA

CHARAKTERYSTYCZNA

LICZBA

ś

YWYCH KOMÓREK

LICZBA

CHARAKTERYSTYCZNA

LICZBA

ś

YWYCH KOMÓREK

000

0,0

201

1,4

301

4,0

001

0,3

202

2,0

302

4,5

010

0,3

210

1,5

310

6,5

011

0,6

211

2,0

311

7,5

020

0,6

212

3,0

312

11,5

100

0,4

220

2,0

313

16,0

101

0,7

221

3,0

320

9,5

102

1,1

222

3,5

321

15,0

110

0,7

223

4,0

322

20,0

111

1,1

230

3,0

323

30,0

120

1,1

231

3,5

330

25,0

121

1,5

232

4,0

331

45,0

130

1,6

300

2,5

332

110,0

200

0,9

333

140,0

3

1.2. Metody bezpośrednie

Omówienie

Bezpośrednia metoda szkiełkowa wg Cholodneg’o i Rossi (1938)

Metoda ta została opracowana do przygotowania preparatów służących do bezpośredniego – mikroskopowego obliczania

liczby mikroorganizmów w glebie. Jednak ze względu na czasochłonność obliczania liczebności mikroorganizmów pod
mikroskopem zwykle zalecana jest jedynie do obserwacji rozmieszczenia mikroorganizmów w glebie.
I etap: Przygotowanie szkiełek
Materiały:
300 g każdej z badanych gleb, 1% glukoza, NH

4

NO

3

, po 2 kubki plastikowe dla każdego typu gleby,

4 szkiełka mikroskopowe dla każdego typu gleby, H

2

O dejonizowana, waga analityczna.

1.

odważyć do naczyń plastikowych 2 x 150g (100g bogatej w materię organiczną) gleby tego samego typu w celu przygotowania
próby kontrolnej i właściwej;

2.

uzupełnić próbę właściwą roztworem glukozy do uzyskania końcowego stężenia 1% (w/w) w przeliczeniu na suchą masę gleby
oraz 200 mg NH

4

NO

3

, wymieszać glebę w celu rozpuszczenia odczynników;

3.

uzupełnić próby H

2

O dejonizowaną w ilości koniecznej do uzyskania odpowiedniej wilgotności po przeliczeniu z

uwzględnieniem stałej wilgotności grawimetrycznej

m - d

Θ

g =

-------

d

m. – masa wilgotnej gleby przed suszeniem; d – masa tej samej gleby po suszeniu;
4. włożyć po 2 szkiełka do każdego naczynia z glebą prostopadle do powierzchni gleby
5. okryć naczynia plastikową folią, nakłuć folie w celu zapewnienia dopływu powietrza
6. inkubować w temp. 28

o

C przez 7 (14) dni

II etap: Utrwalanie i barwienie szkiełek
1.

ostrożnie usunąć szkiełka z gleby

2.

oczyścić spodnią stronę szkiełka

3.

utrwalić odcisk gleby poprzez naniesienie na szkiełko 40% (v/v) kwasu octowego (pod wyciągiem) przez 1-3 min

4.

delikatnie usunąć nadmiar kwasu strumieniem wody i pokryć powierzchnie szkiełka fenolowym roztworem

1

różu bengalskiego

5.

barwić 5-10 min nie dopuszczając do wyschnięcia

6.

delikatnie odmyć nadmiar barwnika, wysuszyć szkiełko i oglądać pod mikroskopem z użyciem olejku imersyjnego

7.

oglądać obraz mikroskopowy:

1

Fenolowy roztwór różu bengalskiego – do 100ml 5% wodnego roztworu fenolu dodać 1,0g różu bengalskiego i 0,03 g CaCl

2

.

Wykonanie

Modyfikacja metody szkiełkowej wg. Cholodneg’o i Rossi - Preparaty odciskowe

I etap: Do płytki Petriego nałożyć glebę zmieszaną z 1% (wagowo) peptonu lub glukozy. Kontrolę stanowi gleba bez
dodatków. Płytki należy pozostawić do inkubacji na 14 dni w temperaturze 28

o

C.

II etap: Po okresie inkubacji położyć na powierzchnię gleby odtłuszczone szkiełko podstawowe i przycisnąć.
Utrwalić odciśnięty materiał glebowy - delikatnie nanieść 95% etanol na szkiełko całkowicie pokrywając odcisk
i pozostawić na 3 – 5min. do całkowitego odparowania.
Barwić – nanieść delikatnie roztwór erytrozyny fenolowej całkowicie pokrywając i pozostawić barwnik przez 15 min.
Odpłukać nadmiar barwnika H

2

O destylowaną.

Oglądać obraz mikroskopowy pod imersją i na podstawie obserwacji:

-

opisać kształt komórek bakteryjnych, strzępek oraz spor grzybów i promieniowców;

-

zauważyć relacje pomiędzy mikroorganizmami oraz mikroorganizmami i cząstkami gleby;

-

opisać różnice ilościowe względnie jakościowe między populacją różnych gleb oraz pomiędzy glebą kontrolną a uzupełnioną
składnikami odżywczymi;

-

wyjaśnić, czy istnieje konkurencja o przestrzeń między mikroorganizmami?;

-

wyjaśnić, czy większe różnice w populacjach drobnoustrojów zaznaczają się pomiędzy glebami różnego typu czy też glebami
kontrolnymi i uzupełnionymi składnikami odżywczymi?

Określenie suchej masy gleby
I etap: zważyć naczynka wagowe. Do każdego naczynka przenieść dokładnie 2 g przesianej gleby.
Poddać naczynka z glebą procesowi suszenia w 105

o

C przez 8 godzin. Przenieść naczynka z wysuszoną glebą do

eksykatora. Sprawdzić stałość masy. W przypadku wahania masy próbki należy poddać dalszemu procesowi suszenia.
II etap: Zważyć naczynką z suchą glebą. Określić średnią suchą masę 1 g gleby.

Literatura podstawowa:
Paul E.A., Clark F.E. 2000. Mikrobiologia i biochemia gleb. Rozdział II-V.

Literatura pomocnicza:

Maier R.M., Pepper I L., Gerba C. P. 2000 Environmental Microbiology. Academic Press.
Pepper I.L., Gerba C.P., Brendecke J.W. 1995. Environmental Microbiology. A laboratory manual. Academic Press, strony 3 – 35.
Alef K., Nannipieri P. 1995. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press Limited.
Whalen J.K., Sampedro L. 2010. Soil Ecology and Management. CAB International
Van Elsas J.D., Jansson J.K., Trevors J.T. 2007. Modern soil microbiology. CRC Press.
Libudzisz Z., Kowal K., śakowska Z. 2007. Mikrobiologia techniczna t.1. Mikroorganizmy i środowiska ich występowania. Wydawnictwo PWN,
Warszawa
Błaszczyk M.K. 2010. Mikrobiologia środowisk. Wydawnictwo PWN, Warszawa
Błaszczyk M.K. 2007. Mikroorganizmy w ochronie środowiska. Wydawnictwo PWN, Warszawa
Bednarek R., Dziadowiec H., Pokojska U., Prusinkiewicz Z. 2005. Badania ekologiczno-gleboznawcze. Wydawnictwo PWN, Warszawa
Klimiuk E., Łebkowska M. 2003. Biotechnologia w ochronie środowiska. Wydawnictwo PWN, Warszawa

4

Charakterystyka gleb poddawanych analizie mikrobiologicznej i biochemicznej

pod względem właściwości granulometrycznych i zawartości kationów

Mada (ang. alluvial soil, fluvisol) wytworzona z aluwialnego utworu pylastego

grupa granulometryczna glina pylasta (gpł) /zwykła/ (loam)*

pobrana z warstwy 10-30 cm nad Wisłą w Lisewie Malborskim k. Tczewa (spod uprawy żyta)

Kationy

Skład granulometryczny (%)*

Parametry:

Ca Mg K

Na

Całkowita

pojemność

wodna

*

(100 g
gleby)

pH

KCl

*

pH

H

2

O

*

C

ogólny

(%)

N

ogólny

(%)

Stosunek

C:N

Piasek
2-0,05

Pył

0,05-

0,002

Ił

„części

spławiane”

<0,002

Wartości:

3.82 0.21 0.21 0.02

25

50

25

Gleba bielicowa (ang. podzol, podzolic soil),

grupa granulometryczna piasek gliniasty (pg) (loamy sand)*

pobrana z warstwy 10-30 cm w miejscowości Nasutów k. Lublina (spod uprawy żyta)

Kationy

Skład granulometryczny (%)*

Parametry:

Ca Mg K

Na

Całkowita

pojemność

wodna

*

(100 g
gleby)

pH

KCl

*

pH

H

2

O

*

C

ogólny

(%)

N

ogólny

(%)

Stosunek

C:N

Piasek
2-0,05

Pył

0,05-

0,002

Ił

„części

spławiane”

<0,002

Wartości:

2.24 0.12 0.31 0.01

69

27

4

*Klasyfikacja gleb wg. Polskiej Normy PN-R 04033