198

www.postepybiochemii.pl

Wiesław Wiktor Jędrzejczak

*

Katedra i Klinika Hematologii, Onkologii i

Chorób Wewnętrznych Warszawskiego Uni-

wersytetu Medycznego w Warszawie

*

Katedra i Klinika Hematologii, Onkologii

i Chorób Wewnętrznych Warszawskiego

Uniwersytetu Medycznego w Warszawie, ul.

Banacha 1a, 02-097 Warszawa; tel.: (22) 59 92

818, e-mail: [e-mail]

Artykuł otrzymano 26 marca 2013 r.

Artykuł zaakceptowano 15 kwietnia 2013 r.

Słowa kluczowe: komórki macierzyste, mode-

le zwierzęce, choroba popromienna

Wykaz skrótów: CFU-S (ang. colony forming

unit-spleen) — jednostka tworząca kolonie śle-

dzionowe: jeden z rodzajów krwiotwórczych

komórek macierzystych; GMP (ang. good ma-

nufacturing practice) — dobra praktyka wytwa-

rzania; HLA (ang. human leucocyte antigens)

— antygeny zgodności tkankowej; MD (ang.

medical doctor) — lekarz; PhD (ang. philosophy

doctor) — stopień doktora nadawany w Sta-

nach Zjednoczonych w różnych dziedzinach,

w tym w medycynie

Badania translacyjne w medycynie regeneracyjnej

na przykładzie przeszczepiania szpiku

StreSzczenie

n

auka służy wypracowaniu metod diagnostycznych i leczniczych, które następnie muszą

być w zorganizowany sposób wprowadzone do praktyki. Badania translacyjne służą

właśnie zaadoptowaniu metod opracowanych na różnych modelach zwierzęcych do kliniki

człowieka. Wymaga to z jednej strony uwzględnienia różnic biologicznych między organi-

zmami modelowymi (w przypadku przeszczepiania komórek krwiotwórczych głównie mysz

i pies) a człowiekiem oraz uwzględnienia różnic wielkości (zwykle zwiększenie skali działa-

nia). Sposoby, jakie wykorzystano we wdrażaniu metod wypracowanych na zwierzętach me-

tod przeszczepiania komórek krwiotwórczych można z powodzeniem wykorzystać podczas

wprowadzania do praktyki klinicznej innych rodzajów terapii komórkowych.

WproWadzenie

Badania translacyjne można zdefiniować jako badania naukowe polegające

na przeniesieniu osiągnięć uzyskanych w trakcie badań osobników jednego ga-

tunku na osobniki innych gatunków. Zwykle chodzi tu o przeniesienie wyników

badań doświadczalnych na zwierzętach do człowieka; zaadoptowanie metody

diagnostycznej lub leczniczej wypracowanej na takim modelu do kliniki, ale

oczywiście to odnosi się także do medycyny weterynaryjnej [1,2]. W zależności

od tego, jaka jest pierwotna inspiracja, badania te są wykonywane wahadłowo:

raz zaczyna się od zwierzęcia modelowego do człowieka i usiłuje wdrożyć meto-

dę leczniczą wypracowaną na tym modelu do kliniki, innym razem odwrotnie:

wraca się od człowieka do zwierzęcia modelowego, aby spróbować rozwiązać

problem kliniczny na modelu, który łatwiej badać. Celem w badaniu translacyj-

nym jest wdrożenie, poprawienie lub zrozumienie metody diagnostycznej lub

leczniczej o praktycznym zastosowaniu. Nie wyklucza to dokonania po drodze

odkrycia, ale nie jest ono celem. Inaczej mówiąc cel jest utylitarny, a nie poznaw-

czy. Inne rozumienie badań translacyjnych to przeniesienie wyników badań na-

ukowych do codziennej praktyki i ono nie jest tematem obecnego artykułu [1]

Podjęcie się wykonywania badań translacyjnych wymaga z jednej strony

szczególnych kwalifikacji od osób w to zaangażowanych, a z drugiej strony

spełnienia całego szeregu warunków prawnych i instytucjonalnych. Niezbędne

kwalifikacje to bardzo dobra znajomość biologii obydwu gatunków: modelowe-

go i docelowego, przy czym oprócz kwalifikacji faktycznych niezbędne są tu

również kwalifikacje formalne, tj. certyfikowane (zgodnie ze stanem prawnym

w danym kraju) uprawnienia takie, jak stopnie naukowe i specjalizacje lekarskie.

W niektórych krajach istnieją specjalne systemy kształcenia takich specjalistów.

Na przykład w Stanach Zjednoczonych jest to tak zwany system MD, PhD (ang.

medical doctor, philosophy doctor), przy czym MD odpowiada w Polsce tytułowi

lekarza, a PhD stopniowi doktora. Kandydaci przyjęci do tego programu są już

absolwentami czteroletnich studiów (tj. college). Pierwotnie zaczynają oni stu-

dia lekarskie, ale po pierwszych dwóch latach (studia lekarskie po college trwają

cztery lata) je przerywają i w zakładzie naukowym robią doktorat, a następnie

wracają na następne dwa lata na studia lekarskie i zostają MD. Dla odróżnienia

ich koledzy, którzy zostają „tylko” PhD po college robią bezpośrednio dokto-

rat (PhD) jako tzw. graduate students, czego w Polsce odpowiednikiem są studia

doktoranckie. Z kolei kształcenie MD ogranicza się do czteroletnich studiów

lekarskich po college. Polscy lekarze podejmujący się badań translacyjnych na

ogół nabywają kwalifikacji dotyczących wykorzystywania modeli doświadczal-

nych już po studiach, często na zagranicznych stażach podoktoralnych.

Na początku kariery „badacza translacyjnego” kluczowy jest wybór organi-

zmu modelowego, a w zależności od zainteresowań i możliwości w grę jako

model człowieka wchodzą tu zwłaszcza: wirusy (zwłaszcza retrowirusy), bakte-

rie (zwłaszcza Escherichia coli), drożdże (Sacchoromyces cerevisiae), pierwotniaki,

Postępy Biochemii 59 (2) 2013

199

robaki (zwłaszcza Caenorhabditis elegans), owady (zwłasz-

cza Drosophila melanogaster), rośliny (zwłaszcza Arabidop-

sis), ryby (Zebrafish), płazy (zwłaszcza Xenopus levis), ptaki

(zwłaszcza przepiórka), myszy i inne gryzonie, psy i małpy.

Skojarzenia niektórych z tych organizmów z człowiekiem

mogą się wydać zaskakujące, ale np. onkogen SRC odpo-

wiedzialny za powstanie wielu różnych nowotworów u

człowieka został pierwotnie odkryty u retrowirusa (Harald

Varmus, Michael Bishop, Nagroda Nobla w 1989 roku), a

sam retrowirus jako przyczyna białaczki został z kolei od-

kryty u ptaków (Payton Rous, Nagroda Nobla w 1966 roku).

Z kolei zjawisko apoptozy zostało rozpracowane na modelu

nicienia Caenorhabditis elegans (Sydney Brenner i inni, Na-

groda Nobla w 2002 roku). Badania, które legły u podstaw

opracowania indukowanych komórek macierzystych (John

B. Gurdon i Shinya Yamanaka, Nagroda Nobla w 2012

roku) zostały wykonane na żabach Xenopus levis. Przeszcze-

pianie szpiku zostało zaś opracowane dzięki wykorzysta-

niu dwóch głównych modeli zwierzęcych: myszy (a także w

mniejszym zakresie innych gryzoni) i psa (E. Donnall Tho-

mas, Nagroda Nobla 1990).

Zaletą myszy była (i jest): tania hodowla, najlepiej zna-

na genetyka, modele niemal wszystkich ludzkich chorób.

Wady tego modelu sprowadzały się do tego, że w odróż-

nieniu od człowieka jest to (w wersji dostępnej do doświad-

czeń) zwierzę wsobne oraz bardzo duża różnica wielkości.

Dla odmiany nieposiadanie tych właśnie wad to główne

zalety psa, dla którego utrzymania niezbędna jest jednak

bardzo kosztowna infrastruktura, a także hodowla. Istotą

wykorzystania modeli doświadczalnych jest przede wszyst-

kim to, że można je zabić na zakończenie doświadczenia,

aby móc lepiej ocenić wynik ale… tu już też pojawia się

etyka, której znaczenie jest tym większe z im bardziej zbli-

żonym do człowieka organizmem mamy do czynienia. Do-

świadczenia na zwierzętach mogą robić tylko ludzie, którzy

lubią zwierzęta. I tylko za zgodą odpowiednich Komisji

Etycznych ds. Badań na Zwierzętach. Najważniejsze to nie

zadawać im cierpień niepotrzebnie (to znaczy wtedy, kie-

dy inaczej wykonując daną czynność można ich uniknąć)

oraz nie zadawać cierpień niepotrzebnych (to jest takich,

które niczemu nie służą). Kolejną zaletą zwierząt doświad-

czalnych jest tu krótszy naturalny czas życia, co oznacza,

że wszystkie badane zjawiska biologiczne trwają krócej niż

u człowieka, a więc badający je człowiek w ciągu swojego

życia może obserwować kilka, a nawet kilkadziesiąt „żyć”

zwierząt doświadczalnych.

Dwa główne problemy związane z wykorzystaniem or-

ganizmów modelowych to różnice biologiczne pomiędzy

organizmem modelowym a człowiekiem oraz różnice wiel-

kości pomiędzy organizmem modelowym a człowiekiem.

Dla powodzenia działalności w zakresie badań translacyj-

nych niezbędna jest znajomość tych różnic i wykorzystanie

tej wiedzy podczas planowania doświadczeń zarówno u

ludzi, jak i zwierząt. Wbrew pozorom różnice biologiczne

pomiędzy układami krwiotwórczymi myszy i człowieka

są zastanawiająco małe. Przede wszystkim śledziona przez

całe życie jest nie tylko narządem odpornościowym, ale

także krwiotwórczym. Nie ma także szpiku żółtego. Myszy

mają ponadto np. dwukrotnie większą liczbę odpowiednio

mniejszych krwinek czerwonych i płytkowych w mikroli-

trze. Różnice są na tyle małe, że ludzki szpik przeszczepio-

ny myszy będzie u niej wytwarzał krwinki, jeśli nie zostanie

odrzucony przez układ odpornościowy [3].

Co deCyduJe o poWodzeniu

przeSzCzepienia Szpiku?

Badania zmierzające do odpowiedzi na to pytanie

doprowadziły do sformułowania koncepcji komórek

macierzystych, określenia ich definicji, praktycznego

wykorzystania w hematologii oraz w innych dziedzi-

nach medycyny. Historycznie punktem zwrotnym były

wybuchy bomb jądrowych w Hiroshimie i Nagasaki i

skonfrontowanie medycyny z nową jednostką chorobo-

wą: ostrą chorobą popromienną. Analiza ofiar tych bomb

i ofiar wypadków radiacyjnych doprowadziła do ustale-

nia, że zależnie od otrzymanej dawki promieniowania

jonizującego występują u nich trzy główne zespoły obja-

wów: tzw. hematologiczny, w którym dominują objawy

uszkodzenia układu krwiotwórczego (dawka do około

1000 cGy), jelitowy, w którym dominują objawy uszko-

dzenia przewodu pokarmowego (dawka do około 5000

cGy) oraz neurologiczny, w którym dominują objawy

uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego (dawka

powyżej 5000 cGy) [4]. Dwa ostatnie zespoły chorobowe

były bezwarunkowo śmiertelne i w związku z tym uwa-

ga została skoncentrowana na zespole hematologicznym.

Dwa amerykańskie zespoły: jeden w Chicago kierowany

przez Leona Jacobsona [5], a drugi w Betesda pod Wa-

szyngtonem kierowany przez Egona Lorenza we właśnie

utworzonych Narodowych Instytutach Zdrowia [6] od-

kryły, że śmiertelnie napromienionym zwierzętom, które

otrzymały dawkę około 1000 cGy można uratować życie

albo osłaniając w trakcie napromieniania śledzionę albo

przeszczepiając szpik. Na tym etapie nie było wiadomo,

czy efekt ten ma charakter komórkowy, tzn. że odbywa

się to dzięki dostarczeniu lub ochronieniu komórek od-

powiedzialnych za regenerację, czy też humoralny pole-

gający na dostarczeniu lub ochronieniu źródeł substancji

(hormonów) przyspieszających taką regenerację. Odkry-

cie anomalii chromosomowej T6 u myszy [7] dostarczyło

znacznika genetycznego, dzięki któremu udowodniono,

że za obserwowane zjawisko odpowiadają komórki.

Z kolei również pracujący w Stanach Zjednoczonych

George Brecher zauważył, że podczas regeneracji myszy

napromienionych dawką około połowę mniejszą na po-

wierzchni śledzion tworzą się białawe guzki złożone z

komórek krwiotwórczych: erytroblastów, mieloblastów

i megakarioblastów [8]. Rozpracowanie tego zjawiska

przez Jamesa Tilla i Ernesta McCullocha [9-11] stworzy-

ło podstawy wiedzy o komórkach macierzystych. Bada-

cze ci najpierw wprowadzili nazwę kolonii śledzionowej

(ang. spleen colony) dla takiego pojedynczego guzka, a dla

komórek wyjściowych dla niego wprowadzili nazwę jed-

nostki tworzącej kolonie śledzionowe (CFU-S, ang. spleen

colony forming unit) i stwierdzili, że liczba CFU-S przeży-

wających napromienienie jest odwrotnie proporcjonalna

do dawki promieniowania, a przy dawce 1000 cGy jest

zerowa i dawka ta jest śmiertelna. Jednakże, jeśli zwie-

rzętom napromienionym tą dawką wstrzyknąć dożylnie

szpik myszy napromienionych to najpierw na powierzch-

200

www.postepybiochemii.pl

ni ich śledzion pojawią się kolonie śledzionowe, a następ-

nie dojdzie do pełnej regeneracji krwiotworzenia i myszy

przeżyją.

Następnie zadano kluczowe pytania: ile komórek wyj-

ściowych potrzeba, aby wytworzyć pojedynczą kolonię śle-

dzionową, czyli ile komórek tworzy jedną CFU-S? Okazało

się, że jedna, czyli, że każda kolonia śledzionowa jest klo-

nem komórkowym powstałym z jednej komórki wyjścio-

wej. Kolejne kluczowe pytanie brzmiało: czy wśród potom-

stwa pojedynczej CFU-S znajdują się kolejne CFU-S? W tym

celu wycinano ze śledzion pojedyncze kolonie śledzionowe

i ich zawartość podawano dożylnie śmiertelnie napromie-

nionym myszom. Okazało się, że rzeczywiście takie zjawi-

sko ma miejsce. Odpowiedzi na te pytania pozwoliły po raz

pierwszy zdefiniować komórkę macierzystą jako komórkę

posiadającą następujące cechy [12]:

— zdolność do samoodnawiania, czyli zdolność do wy-

twarzania następnych komórek macierzystych (CFU-S była

zdolna wytworzyć następne CFU-S);

— zdolność różnicowania się w te wszystkie rodzaje ko-

mórek, dla których jest ona macierzysta (CFU-S była zdolna

wytworzyć erytroblasty, mieloblasty i megakarioblasty);

— zdolność do wytworzenia wystarczającej liczby ko-

mórek, aby pokryć straty związane z ich zużywaniem oraz

umożliwić regenerację po urazie (pojedyncza kolonia śle-

dzionowa była złożona z około miliona komórek, ale zakła-

dano, że wtórne kolonie powstałe z komórek powstałych w

koloniach pierwotnych przekształcają tę liczbę w setki mi-

lionów niezbędne dla regeneracji układu krwiotwórczego

myszy).

Odpowiedzi te następnie zostały zuniwersalizowane,

tzn. rozszerzone na wszystkie rodzaje komórek macierzy-

stych, w tym na komórki rozrodcze, gdzie zygota jest swo-

istą komórką macierzystą organizmu.

Co ciekawe, jak się później okazało CFU-S nie były

krwiotwórczymi komórkami macierzystymi. Tutaj klu-

czowe było opracowanie przez Elizabeth Russell modelu

myszy [13], którym można z powodzeniem przeszczepiać

szpik bez żadnego napromienienia. Były to myszy W/W

v

,

o których dzisiaj wiemy, że mają defekt genu receptora c-

-kit [14]. McCulloch i Till udowodnili, że u tych myszy po

podaniu szpiku od ich zdrowego rodzeństwa bez napro-

mienienia tworzą się kolonie śledzionowe [15]. Z kolei

Abramson i wsp [16] stwierdzili, że układ krwiotwórczy

tych myszy może zostać zastąpiony przez potomstwo

jednej komórki macierzystej. To stworzyło możliwość

uzyskania odpowiedzi na fundamentalne pytania: (1):

czy rzeczywiście komórki tworzące kolonie śledzionowe

są tymi komórkami, które ostatecznie odtwarzają układ

krwiotwórczy? i (2) z jaką częstością występują w szpiku

te komórki, które ten układ mogą odtworzyć? Pomysł jak

na nie odpowiedzieć polegał na przeszczepianiu grupom

myszy W/W

v

coraz mniejszych liczb komórek szpiku po

to, aby określić granicę, poniżej której nie u wszystkich

myszy dojdzie do ustanowienia krwiotworzenia. Tam,

gdzie do tego dojdzie, wśród różnych komórek musiała

być chociaż jedna komórka macierzysta, a tam, gdzie do

tego nie dojdzie, jej po prostu nie było. Było to więc po-

dejście do badania krwiotwórczych komórek macierzy-

stych metodą rozcieńczeń granicznych.

Okazało się [17,18], że komórki zdolne pojedynczo od-

tworzyć układ krwiotwórczy występują w szpiku z często-

ścią 1 na około 25000 komórek szpiku i około 10 razy rza-

dziej niż komórki tworzące kolonie śledzionowe.

O ile wykorzystanie myszy pozwoliło poznać biologię

krwiotwórczych komórek macierzystych, w tym określić

niektóre mechanizmy regulacyjne [19], to przez pewien

czas nie było pomocne w zrozumieniu podstawowego

problemu przeszczepiania szpiku u człowieka, czyli tzw.

choroby wtórnej [20], obecnie określanej nazwą choroby

przeszczep przeciwko gospodarzowi [21]. Okazało się, że

u człowieka przy wykorzystaniu przypadkowego dawcy

po pierwotnym powodzeniu przeszczepu rozwija się cięż-

ki zespół objawów złożony ze zmian skórnych, biegunki i

żółtaczki, który prowadzi do śmierci. Szybko stwierdzono,

że jest to spowodowane reakcją odpornościową komórek

dawcy przeszczepu na antygeny tkankowe biorcy. Reak-

cja ta nie występowała przy przeszczepach u myszy z tego

samego szczepu wsobnego, ale człowiek (poza bliźniętami

jednojajowymi) nie dysponuje innym wsobnym dawcą. Tu

pomocny okazał się pies kundel, który do badań był wyko-

rzystywany przez E. Donnell Thomasa (Nagroda Nobla za

opracowanie metod przeszczepiania szpiku w roku 1990).

Okazało się, że jeśli jako dawcę wykorzystywać psa potom-

ka tej samej pary rodziców, to w co czwartym przypadku

choroba wtórna nie występuje lub ma łagodny przebieg.

Zbiegło to się z odkryciem antygenów HLA (Jean Dausset,

Nagroda Nobla w roku 1980), co umożliwiło potwierdzenie,

że podobne zjawisko ma miejsce u ludzi, a co więcej, że ba-

dając antygeny HLA można wytypować, kto z rodzeństwa

odziedziczył te same cechy HLA od obojga rodziców i tym

samym może być dawcą szpiku.

Podobnie, mysz nie była przydatna do opracowania me-

tody napromieniania człowieka na całe ciało. Jednakże, to

u myszy po raz pierwszy Barnes i Loutit [22] stwierdzili, że

możliwe jest wyleczenie białaczki po napromienieniu całe-

go ciała i przeszczepieniu szpiku. Ze względu na rozmiary

mysz jest bardzo łatwo napromienić — wystarczy wstawić

ją w pudełku na kilka minut w pobliże źródła promienio-

wania. Napromienienie na całe ciało człowieka (poza oczy-

wiście sytuacją wybuchu jądrowego) przy użyciu klinicznie

wykorzystywanych urządzeń do napromieniania jest du-

żym wyzwaniem fizycznym, które rodzi nieprzewidziane

problemy wynikające np. z wielkości bunkra, w którym

znajduje się aparat do napromienienia. Jeśli bunkier jest

zbyt mały to osoby napromienianej nie można odsunąć od

źródła napromienienia na wystarczającą odległość, aby całe

ciało było objęte wiązką promieniowania. Ponadto jest pro-

blem jednorodności rozkładu dawki w polu. Te problemy

również rozwiązał Thomas wykorzystując psa [23, 24].

Jak Wdrażano na śWieCie

przeSzCzepianie Szpiku?

W rzeczywistości rozwój metody przeszczepiania szpi-

ku w klinice odbywał się równolegle, a nie sekwencyjnie

do rozwoju wiedzy o biologii komórek macierzystych —

Postępy Biochemii 59 (2) 2013

201

właśnie dokładnie wahadłowo. Zanim odpowiem na posta-

wione pytanie przypomnę, że milowe kroki sprowadzały

się tu do opracowania na początku lat 50-tych XX wieku

przez Thomasa metody napromieniania ludzi na całe ciało

[23,24], metody pobierania szpiku i jego przechowywania

w zamrożeniu [25]. W latach 1956–1959 Thomas wykonał

pierwsze przeszczepienia po napromienieniu całego ciała u

dzieci z ostrą białaczką od dawców bliźniaków jednojajo-

wych, które po pierwotnym przyjęciu przeszczepu zakoń-

czyły się nawrotem białaczki i zgonem chorych [23,26]. W

tym samym czasie we Francji podobne próby podjął Geor-

ges Mathe, który wykonał przeszczepienie szpiku od innej

osoby, które chory przeżył [27]. Metoda pobierania szpiku

została udoskonalona w 1970 roku przez Thomasa i Stor-

ba [28], ale nie ten zespół wykonał pierwsze udane prze-

szczepienia alogeniczne u ludzi. Jak wspomniano, najpierw

w 1962 roku Jean Dausset we Francji i niezależnie Jon Van

Rood w Holandii [30] odkryli antygeny HLA [29], a później

wypracowano metody doboru dawców i biorców w tym

układzie. W 1968 roku trzy zespoły: Roberta A. Gooda [31],

Fritza Bacha [32] i Dirka Van Bekkuma [33] wykonały takie

zabiegi u dzieci z niedoborami odporności. Szpik pochodził

w każdym przypadku od rodzeństwa, które było zgodne w

HLA. Pierwsze przeszczepienie od dawcy częściowo zgod-

nego w HLA wykonał Thomas w 1969 roku, ale chory zmarł

w 52 dniu po zabiegu z powodu albo infekcji albo choro-

by przeszczep przeciw gospodarzowi [34]. Był to chory w

kryzie blastycznej przewlekłej białaczki szpikowej. Spośród

kolejnych 7 chorych dłuższe przeżycie uzyskano u jednego

chorego [35,36]. W tym czasie George W. Santos najpierw w

badaniach na myszach dowodzi korzystnej roli cyklofosfa-

midu dla wszczepienia szpiku, a następnie wprowadza to

do kliniki człowieka [37,38]. Okazuje się, że aby wyleczyć

białaczkę u człowieka trzeba do napromienienia na całe cia-

ło dodać cytostatyk — cyklofosfamid w megadawkach.

W1977 roku Thomas i współpracownicy opublikowali w

czasopiśmie Blood wyniki leczenia pierwszych 100 chorych

na ostre białaczki, którzy otrzymali przeszczep szpiku po

napromienieniu całego ciała i podaniu cyklofosfamidu [39].

Ponad rok przeżyło 13 chorych. Stopniowo przeszczepie-

nie szpiku jest wprowadzane do leczenia nowych chorób,

a nadto dopracowywana jest technika zmniejszając śmier-

telność. Przeszczepianie szpiku staje się metodą z wyboru

w leczeniu licznych nowotworowych i nienowotworowych

chorób krwi wprowadzając w nich nową wcześniej nieosią-

galną kategorię skutku leczenia: wyleczenie [40]. W 1982

roku George W. Santos skutecznie zastępuje napromienie-

nie całego ciała podaniem innego cytostatyku busulfanu w

megadawkach [41]. Ta ostatnia metoda do dzisiaj pozostaje

podstawową, ale napromienienie całego ciała nadal pozo-

staje w użyciu, zwłaszcza w leczeniu ostrej białaczki limfo-

blastycznej.

Jak przyStąpić do podeJmoWania próB

kliniCznyCh metody leCzniCzeJ WCześnieJ

opraCoWaneJ na zWierzętaCh?

Po pierwsze, trzeba mieć dowody „słuszności zasady”

(ang. proof of principle), czyli dowody z doświadczeń na

zwierzętach, że dane zjawisko rzeczywiście zachodzi. Po

drugie, musi istnieć dokładnie opisany plan doświadcze-

nia i sposób wybierania ludzi do tego doświadczenia. Po

trzecie, lekarze wykonujący doświadczenie muszą mieć

odpowiednie kwalifikacje. Po czwarte, musi być spełniona

zasada, że potencjalne korzyści dla osoby uczestniczącej w

doświadczeniu przewyższają ryzyko z nim związane. Po

piąte, musi to wszystko pozytywnie zaopiniować niezależ-

ne gremium (Komisja Bioetyczna). Po szóste, osoba podda-

wana doświadczeniu musi wyrazić na to zgodę po pełnym

poinformowaniu jej zarówno o ryzyku, jak i ewentualnych

korzyściach wynikających z doświadczenia i znajdując się

w sytuacji zdolności do wyrażenia wolnej i nieskrępowanej

zgody (np. nie może być więźniem).

Dla zobrazowania sposobu rozwiązania tych problemów

krótko opiszę, jak doprowadzono do wykonania pierwsze-

go przeszczepiania szpiku w Polsce. Pierwsze przygotowa-

nia zaczęły się w latach 1974–1977 od opracowania metod

prowadzenia chorych z uszkodzonym układem krwiotwór-

czym, w tym opanowywania powikłań związanych z takim

uszkodzeniem [42-44]. Badania te wykonywano wykorzy-

stując uszkodzenie układu krwiotwórczego powstałe w

trakcie leczenia nowotworów złośliwych dużymi dawkami

cytostatyków [45]. Największym problemem było jednak

zorganizowanie od podstaw zaplecza laboratoryjnego z

własną hodowlą myszy, co udało się zrobić w roku 1980.

Następnie, kontynuując badania kliniczne rozpoczęto testo-

wanie poszczególnych elementów przeszczepiania na my-

szach i wreszcie adaptację opracowanych metod z myszy

na człowieka. Tutaj podstawowym problemem była różnica

skali: przeszczepienie szpiku u myszy to 1-10 mln komórek

w 0,5 ml, a przeszczepienie szpiku u człowieka to 100-400

mln komórek na kg (czyli dla dorosłego 8-32 mld komórek)

w 500–1000 ml.

Warto zaznaczyć, że nikt z zespołu wdrażającego tę me-

todę nigdy zabiegu przeszczepienia szpiku u człowieka nie

widział, ani (ze względu na stan wojenny) nie mógł wyje-

chać go zobaczyć. Posługiwano się dostępnymi publikacja-

mi, z tym, że np. konieczne było opracowanie własnej meto-

dy pobierania szpiku (tzw. zamkniętej [46], w odróżnieniu

od metody otwartej Thomasa i Storba), w tym konstrukcja

własnych igieł do pobierania szpiku itp. Wreszcie na po-

czątku 1984 roku uzyskano zgodę Komisji ds. Eksperymen-

tów na Ludziach Rady Naukowej Centralnego Szpitala Kli-

nicznego Wojskowej Akademii Medycznej w Warszawie.

Ostatecznie pierwszy zabieg został wykonany w 1984 roku

u chorej z rzadką, genetycznie uwarunkowaną chorobą

anemią Diamonda-Blackfana po uzyskaniu zgody obojga

rodziców (chora miała wtedy 6 lat). Był to drugi zabieg w

tej chorobie na świecie i pierwszy udany [47]. W przygoto-

waniu do przeszczepienia podano polski busulfan (nigdy

wcześniej niewykorzystywany do tego celu) w megadaw-

kach oraz cyklofosfamid [48].

naJnoWSze WykorzyStanie Badań

tranSlaCyJnyCh do zaStoSoWania

przeSzCzepiania komórek

krWiotWórCzyCh W noWym WSkazaniu

Najnowszym przykładem zastosowania strategii badań

translacyjnych jest podjęcie prób leczenia cukrzycy typu 1

za pomocą zresetowania układu odpornościowego. Kon-

202

www.postepybiochemii.pl

cepcja tego leczenia bierze się stąd, że u myszy NOD (non-

-obese, diabetic), u których rozwija się choroba zbliżona do

cukrzycy typu 1 możliwe jest wyleczenie (a ściślej zapo-

bieżenie rozwojowi cukrzycy) za pomocą immunoablacji i

przeszczepienia szpiku [49].

U człowieka nie wiemy z wyprzedzeniem u kogo roz-

winie się cukrzyca typu 1, ale w chwili rozpoznania nie

wszystkie komórki beta są zniszczone. Gdyby udało się w

tym momencie zablokować dalsze ich niszczenie, to być

może pozostałe komórki beta wytwarzałyby wystarczającą

ilość insuliny, aby chorego uniezależnić od insuliny egzo-

gennej. U człowieka w większości przypadków nie dyspo-

nujemy zdrowym bliźniakiem jednojajowym, którego ko-

mórki mogłyby zostać wykorzystane do przeszczepienia,

ale wiemy, że ta sama choroba z autoagresji rozwija się tyl-

ko u około 20% bliźniąt jednojajowych [50], co oznacza, że

taki jest wpływ czynników genetycznych na jej powstanie.

To oznacza, że wystąpienie chorób tego typu (w tym cu-

krzycy typu 1) w 80 % jest zależne od bliżej nieokreślonego

zewnętrznego zdarzenia, które wystąpiło już po urodzeniu.

Gdyby w tej sytuacji zniszczyć dotychczasowy układ od-

pornościowy chorego to zniszczyłoby się jednocześnie klon

(klony) autoreaktywny, który powoduje chorobę. Ponieważ

chory nie może żyć bez układu odpornościowego, to prze-

szczepienie jego własnych, wcześniej pobranych komórek

macierzystych powinno umożliwić jego ponowne wytwo-

rzenie, przy czym istnieje około 80% szansa, że w tak wy-

tworzonym układzie odpornościowym nie zostanie odtwo-

rzony klon chorobotwórczy.

W oparciu o tak sformułowaną hipotezę Voltarelli i wsp.

rozpoczęli w 2003 roku pierwsze próby wykorzystania

przeszczepiania własnych komórek krwiotwórczych po

kondycjonowaniu immunoablacyjnym w leczeniu cukrzy-

cy typu I. Pierwsza publikacja [51] obejmowała wyniki le-

czenia 15 pacjentów, z których 14 uzyskało przynajmniej

przejściową niezależność od insuliny. Nowsze dane tej

grupy (informacja własna) obejmują 19 pacjentów, spośród

których 14 pozostaje niezależnych od insuliny przez od 0,5

do 44 miesięcy, 4 było przejściowo niezależnych od insuliny

(przez 7 do 12 miesięcy) a losy jednego są nieznane. Ta pu-

blikacja zwróciła naszą uwagę i został przygotowany pro-

tokół badawczy, w oparciu o który wystąpiliśmy o zgodę

do Komisji Bioetycznej Warszawskiego Uniwersytetu Me-

dycznego na rozpoczęcie wykonywania tych zabiegów u

polskich pacjentów z cukrzycą typu I. Zgodę otrzymaliśmy

w styczniu 2008 roku i zwróciliśmy się do kilku ośrodków

diabetologicznych z propozycją współpracy polegającej z

jednej strony na zidentyfikowaniu odpowiednich pacjen-

tów, a z drugiej na fachowym monitorowaniu ich choroby

po przeszczepieniu. Pierwszy pacjent spełniający kryteria

włączenia został zidentyfikowany w kwietniu 2008 i został

poddany przeszczepieniu 6 maja 2008 według protokołu

wzbogaconego (w stosunku do protokołu Voltarellego) o

zabiegi plazmaferezy zmierzające do ochronienia jak naj-

większej liczby komórek β przed zniszczeniem, zanim zo-

stanie wykonany zabieg przeszczepienia [52].

W końcu czerwca 2008 (osiem tygodni po zabiegu) u pa-

cjenta odstawiono zewnątrzpochodną insulinę, przy czym

zapotrzebowanie na nią zmniejszało się począwszy od pro-

cedury mobilizacji i w miarę kolejnych plazmaferez. Pacjent

nadal (marzec 2013) nie wymaga insuliny, ma normalne stę-

żenie peptydu C oraz glikozylowanej hemoglobiny. Wyniki

leczenia pierwszych ośmiu chorych zostały opublikowane

[53]. Czternastu dalszych pacjentów zostało poddanych po-

dobnym zabiegom. Jedenastu uzyskało niezależność od eg-

zogennej insuliny. Pozostali wymagają niewielkich dawek

w czasie posiłku. Jedenastu innym chorym zaproponowano

to leczenie, ale nie wyrazili zgody. Wszyscy wymagają po-

dawania insuliny, żaden nie uzyskał samoistnej remisji.

praWne uWarunkoWania Badań

tranSlaCyJnyCh W dziedzinie medyCyny

regeneraCyJneJ W polSCe

Pod względem prawnym w Polsce zgodnie z zapisami

Dyrektywy Unii Europejskiej nr EC 23/2004 [54] wpro-

wadzonych do Ustawy o pobieraniu, przechowywaniu i

przeszczepianiu komórek, tkanek i narządów dla rozpo-

częcia praktycznych działań polegających na przeszcze-

pianiu komórek dowolnego rodzaju u człowieka nie-

zbędne jest spełnienie warunków dotyczących zarówno

kwalifikacji personelu, jak i instytucji [55]. Lekarze bez-

pośrednio wykonujący zabiegi powinni posiadać specja-

lizację z transplantologii klinicznej oprócz swojej podsta-

wowej specjalności, którą w przypadku przeszczepiania

komórek krwiotwórczych u osób dorosłych jest specjali-

zacja z hematologii, a w przypadku dzieci specjalizacja z

onkologii i hematologii dziecięcej. Personel laboratoryjny

powinien legitymować się stażem pracy w odpowied-

nim laboratorium, ale wskazane jest również posiada-

nie specjalizacji z laboratoryjnej hematologii medycznej.

Niezbędne jest dysponowanie akredytowanym bankiem

komórek posiadającym pozwolenie Ministra Zdrowia

na działalność w odniesieniu do określonego rodzaju

komórek i podobnie akredytowanym ośrodkiem trans-

plantacyjnym również posiadającym pozwolenie Mini-

stra Zdrowia. Wyjątkiem od tego są zabiegi, w których

w trakcie jednej procedury komórki są pobierane i po-

dawane tej samej osobie. Natomiast wtedy, kiedy przed-

miotem transplantacji mają być komórki przetworzone, a

więc np. hodowane, wtedy niezbędne jest dysponowanie

warunkami dobrej praktyki wytwórczej, czyli GMP. W

Polsce za akredytację banków komórek odpowiada Kra-

jowe Centrum Bankowania Tkanek i Komórek, a za akre-

dytację ośrodków transplantacyjnych Krajowe Centrum

ds. Transplantacji „Poltransplant”, odpowiedni konsul-

tanci krajowi oraz Krajowa Rada Transplantacyjna.

piśmienniCtWo

1. Rubio DM, Schoenbaum EE, Lee LS, Schteingart DE, Marantz PR, An-

derson KE, Platt LD, Baez A, Esposito K (2010) Defining translational

research: implications for training. Acad Med 85: 470-475

2. Wu J (2013) Insights into complex diseases through translational re-

search. J Mol Cell Biol 5: 71-72

3. Dick JE (1996) Human stem cell assays in immune-deficient mice. Curr

Opin Hematol 3: 405-409

4. Wald N, Thoma GE Jr (1961) Radiation accidents: medical aspects of

neutron and gamma-ray exposures. ORNL PtB: 1-177

5. Jacobson LO, Simmons EL, Bethard WF (1950) Studies on hematopoi-

etic recovery from radiation injury. J Clin Invest 29: 825

Postępy Biochemii 59 (2) 2013

203

6. Lorenz E, Uphoff D, Reid TR, Shelton E (1951) Modification of irradia-

tion injury in mice and guinea pigs by bone marrow injections. J Natl

Cancer Inst 1: 197-201

7. Ford CE, Hamerton JL, Barnes DW, Loutit JF (1956) Cytological iden-

tification of radiation-chimaeras. Nature 177: 452-454

8. Brecher G, Endicott KM, et al. (1948) Effects of X-ray on lymphoid and

hemopoietic tissues of albino mice. Blood 3: 1259-1274

9. Till JE, McCulloch EA (1961) A direct measurement of the radiation

sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res 14: 213-222

10. McCulloch EA, Till JE (1960) The radiation sensitivity of normal mouse

bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplanta-

tion into irradiated mice. Radiat Res 13: 115-125

11. Wu AM, Till JE, Siminovitch L, McCulloch EA (1967) A cytological

study of the capacity for differentiation of normal hemopoietic colony-

forming cells. J Cell Physiol 69: 177-184

12. Till JE, McCulloch EA, Siminovitch L (1964) A stochastic model of

stem cell proliferation, based on the growth of spleen colony-forming

cells. Proc Natl Acad Sci USA 51: 29-36

13. Russell ES (1949) Analysis of pleiotropism at the W-locus in the mouse;

relationship between the effects of W and Wv substitution on hair pig-

mentation and on erythrocytes. Genetics 34: 708-723

14. Chabot B, Stephenson DA, Chapman VM, Besmer P, Bernstein A

(1988) The proto-oncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosine

kinase receptor maps to the mouse W locus. Nature 335: 88-89

15. McCulloch EA, Siminovitch L, Till JE (1964) Spleen colony formation

in anemic mice of genotype W/W. Science. 144: 844-846

16. Abramson S, Miller RG, Phillips RA (1977) The identification in adult

bone marrow of pluripotent and restricted stem cells of the myeloid

and lymphoid systems. J Exp Med 145: 1567-1579

17. Wiktor-Jedrzejczak W, Szczylik C, Górnaś P, Sharkis SJ, Ahmed A

(1979) Different marrow cell number requirements for the haemopoi-

etic colony formation and the cure of the W/Wv anemia. Experientia

35: 546-547

18. Boggs DR, Boggs SS, Saxe DF, Gress LA, Canfield DR (1982) Hemato-

poietic stem cells with high proliferative potential. Assay of their con-

centration in marrow by the frequency and duration of cure of W/Wv

mice. J Clin Invest 70: 242-253

19. Wiktor-Jedrzejczak W, Sharkis S, Ahmed A, Sell KW, Santos GW

(1977) Theta-sensitive cell and erythropoiesis: identification of a defect

in W/Wv anemic mice. Science 196: 313-315

20. Chomette G, Mathe G, Auriol M, Brocheriou C, Pinaudeau Y (1970)

Secondary disease in man. Anatomical study on six cases of leukemia

treated with allogenic bone marrow grafts following total-body irra-

diation. Virchows Arch A Pathol Pathol Anat 349: 98-114

21. Sung AD, Chao NJ (2013) Concise review: acute graft-versus-host dis-

ease: immunobiology, prevention, and treatment. Stem Cells Transl

Med 2: 25-32

22. Barnes DW, Loutit JF (1957) Treatment of murine leukaemia with x-

rays and homologous bone marrow. II. Br J Haematol 3: 241-252

23. Thomas ED, Lochte HL Jr, Cannon JH, Sahler OD, Ferrebee JW (1959)

Supralethal whole body irradiation and isologous marrow transplan-

tation in man. J Clin Invest 38: 1709-1716

24. Thomas ED (1964) Observations on supralethal whole-body irradia-

tion and marrow transplantation in man and dog. Ann N Y Acad Sci

114: 393-402

25. Thomas ED, Ferrebee JW (1962) Prolonged storage of marrow and its

use in the treatment of radiation injury. Transfusion 2: 115-117

26. Thomas ED, Lochte HL Jr, Lu WC, Ferrebee JW (1957) Intravenous

infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemo-

therapy. N Engl J Med 257: 491-496

27. Mathe G, Amiel JL, Schwarzenberg G L, Cattan A, Schneider M (1963)

Haematopoietic chimera after allogeneic (homologous) bone-marrow

transplantation. (Control of the secondary syndrome. Specific toler-

ance due to chimerism). Br Med J 2: 1633-1635

28. Thomas ED, Storb R (1970) Technique for human marrow grafting.

Blood. 36: 507-15

29. Dausset J (1958) Iso-leuco-anticorps. Acta Haematol 20: 156-166
30. VanRood JJ, Eernisse JG, VanLeeuwen A (1958) Leucocyte antibodies

in sera of pregnant women. Nature 181: 1735-1736

31. Gatti RA, Meuwissen HJ, Allen HD, Hong R, Good RA (1968) Immu-

nological reconstitution of sex-linked lymphopenic immunological

deficiency. Lancet 2: 1366-1369

32. Bach FH, Albertini RJ, Joo P, Anderson JL, Bortin MM (1968) Bone-

marrow transplantation in a patient with the Wiskott-Aldrich syn-

drome. Lancet 2: 1364-1366

33. De Koning J, Van Bekkum DW, Dicke KA, Dooren LJ, Rádl J, Van

Rood JJ (1969) Transplantation of bone-marrow cells and fetal thymus

in an infant with lymphopenic immunological deficiency. Lancet 1:

1223-1227

34. Buckner CD, Epstein RB, Rudolph RH, Clift RA, Storb R, Thomas ED

(1970) Allogeneic marrow engraftment following whole body irradia-

tion in a patient with leukemia. Blood 35: 741-750

35. Storb R, Rudolph RH, Thomas ED (1971) Marrow grafts between ca-

nine siblings matched by serotyping and mixed leukocyte culture. J

Clin Invest 50: 1272-1275

36. Thomas ED, Buckner CD, Rudolph RH, Fefer A, Storb R, Neiman

PE, Bryant JI, Chard RL, Clift RA, Epstein RB, Fialkow PJ, Funk DD,

Giblett ER, Lerner KG, Reynolds FA, Slichter S. (1971) Allogeneic mar-

row grafting for hematologic malignancy using HL-A matched donor-

recipient sibling pairs. Blood 38: 267-287

37. Santos GW, Owens AH Jr (1969) Allogeneic marrow transplants in cy-

clophosphamide treated mice. Transplant Proc 1: 44-46

38. Santos GW, Sensenbrenner LL, Burke PJ, Colvin M, Owens AH Jr, Bias

WB, Slavin RE (1971) Marrow transplantation in man following cyclo-

phosphamide. Transplant Proc 3: 400-404

39. Thomas ED, Buckner CD, Banaji M, Clift RA, Fefer A, Flournoy N,

Goodell BW, Hickman RO, Lerner KG, Neiman PE, Sale GE, Sand-

ers JE, Singer J, Stevens M, Storb R, Weiden PL (1977) One hundred

patients with acute leukemia treated by chemotherapy, total body ir-

radiation, and allogeneic marrow transplantation. Blood 49: 511-533

40. Thomas ED, Storb R, Clift RA, Fefer A, Johnson L, Neiman PE, Lerner

KG, Glucksberg H, Buckner CD (1975) Bone-marrow transplantation

(second of two parts). N Engl J Med 292: 895-902

41. Santos GW, Tutschka PJ, Brookmeyer R, Saral R, Beschorner WE, Bias

WB, Braine HG, Burns WH, Elfenbein GJ, Kaizer H, et al. (1983) Mar-

row transplantation for acute nonlymphocytic leukemia after treat-

ment with busulfan and cyclophosphamide. N Engl J Med 309: 1347-

1353

42. Jedrzejczak WW, Siekierzyński M, Czarnecki C, Dziuk E (1976) Pat-

terns of changes in peripheral blood composition in the course of com-

bination chemotherapy of cancer. Strahlentherapie 152: 469-476

43. Wiktor-Jedrzejczak W, Czarnecki C (1974) Management of infections

in neutropenia. Wiad Lek 27: 1865-1868

44. Jedrzejczak WW (1977) Skutki uboczne chemioterapii nowotworów

jako kliniczny modle ostrej choroby popromiennej. Rozprawa habili-

tacyjna, CKP WAM, Warszawa

45. Jędrzejczak WW, Siekierzynski M, Dziuk E, Czarnecki Cz (1977) Ostra

choroba popromienna — wybór modelu do badan klinicznych. Lek

Wojsk 53: 37-42

46. Wiktor-Jedrzejczak W, Pojda Z (1987) Bone marrow transplantation in

Polish conditions. A modified method of marrow collection and prep-

aration for transplantation. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 35: 79-86

47. Wiktor-Jedrzejczak W, Szczylik C, Pojda Z, Siekierzynski M, Kansy J,

Klos M, Ratajczak MZ, Pejcz J, Jaskulski D, Gornas P (1987) Success of

bone marrow transplantation in congenital Diamond-Blackfan anae-

mia: a case report. Eur J Haematol 38: 204-206

48. Wiktor-Jedrzejczak W, Szczylik C, Matej H, Pojda Z, Ratajczak MZ,

Myc A, Siekierzyński M, Kansy J, Kłos M, Rybicki Z (1989) Allogeneic

bone marrow transplantation from HLA-identical siblings following

conditioning with busulfan and cyclophosphamide. First results. Folia

Haematol Int Mag Klin Morphol Blutforsch 116: 403-408

49. Ikehara S, Ohtsuki H, Good RA, Asamoto H, Nakamura T, Sekita K,

Muso E, Tochino Y, Ida T, Kuzuya H, et al. (1985) Prevention of type

204

www.postepybiochemii.pl

translational research in regenerative medicine:

an example of bone marrow transplantation

Wiesław Wiktor Jędrzejczak

*

Department of Hematology, Oncology and Internal Diseases, Medical University of Warsaw, 1a Banacha St., 02-097 Warsaw, Poland

*

e-mail: [e-mail]

key words: stem cells, animal models, postirradiation sickness

aBStract

Science provides diagnostic and therapeutic methods that subsequently need to be introduced to routine clinical practice in ordered way.

translational research allows for adaptation of methods developed on experimental animals to the requirements of man. this process requires

on one hand consideration of biological differences between model organisms (in case of bone marrow transplantation mainly mouse and

dog) and man and consideration of differences in size (usually upscaling of procedures). procedures that have been elaborated during transla-

tion of methods of transplantation of hematopoietic cells elaborated on experimental animals to clinical situations could be successfully used

during introduction to the clinic of other types of cellular therapies.

I diabetes in nonobese diabetic mice by allogenic bone marrow trans-

plantation. Proc Natl Acad Sci USA 82: 7743-7747

50. Dang MN, Buzzetti R, Pozzilli P (2013) Epigenetics in autoimmune

diseases with focus on type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev 29:

8-18

51. Voltarelli JC, Couri CE, Stracieri AB, Oliveira MC, Moraes DA, Pieroni

F, Coutinho M, Malmegrim KC, Foss-Freitas MC, Simões BP, Foss MC,

Squiers E, Burt RK (2007) Autologous nonmyeloablative hematopoi-

etic stem cell transplantation in newly diagnosed type 1 diabetes mel-

litus. JAMA 297: 1568-1576

52. Snarski E, Milczarczyk A, Torosian T, Paluszewska M, Urbanowska E,

Król M, Boguradzki P, Jedynasty K, Franek E, Jedrzejczak WW (2011)

Independence of exogenous insulin following immunoablation and

stem cell reconstitution in newly diagnosed diabetes type I. Bone Mar-

row. Transplant 46: 562-566

53. Snarski E, Torosian T, Paluszewska M, Urbanowska E, Milczarczyk

A, Jedynasty K, Franek E, Wiktor-Jedrzejczak W (2009) Alleviation of

exogenous insulin requirement in type 1 diabetes mellitus after im-

munoablation and transplantation of autologous hematopoietic stem

cells. Pol Arch Med Wewn 119: 422-426

54. Directive 2004/23/EC of the European parliament and of the Council

of 31 March 2004 on setting standards of quality and safety for the

donation, procurement, testing, processing, preservation, storage and

distribution of human tissues and cells

55. Ustawa z dnia 1 lipca 2005 r. o pobieraniu, przechowywaniu i prze-

szczepianiu komórek, tkanek i narządów Dz. U. z 2005 r. Nr 169, poz.

1411, (Ustawa z dnia 1 lipca 2005 r. o pobieraniu, przechowywaniu i

przeszczepianiu komórek, tkanek i narządów) Dz. U. z 2009 r. Nr 141,

poz. 1149, (Ustawa z dnia 17 lipca 2009 r. o zmianie ustawy o pobiera-

niu, przechowywaniu i przeszczepianiu komórek, tkanek i narządów

oraz o zmianie ustawy - Przepisy wprowadzające Kodeks karny)