Podsumowanie ćwiczenia 6

Rola polimeraz SOS w mutagenezie indukowanej HNE i UV

HNE

A

3 polimerazy

B

Pol II

C

Pol IV

D

Pol V

l. Ły-

sinek

%

MF

X10

-4

l.

Ły-

sine

k

%

MF

X10

-4

l.

Ły-

sine

k

%

MF

X10

-4

l.

Ły-

sine

k

%

MF

X10

-4

0

1421

10

0

>2

794

10

0

>2

771

100 2,6

797

1
0
0

31

5

532

37

97

496

62 100

481

62 3,5

429

5
4

130

15

146

10

150

92

11 500

72

9,3 19

0

59

7,

4

140

50

18

1,2 320

22

2,7

92

5

0,6

5

40

0

14

1,

7

180

UV

1 min

197

14

40

5

63

8,2

159

2
0

UV

3 min

33

2,3

32

4

5

0,6

5

50

6,

3

1

10

100

0

50

100

HNE (mM)

S

ur

vi

va

l

[%

]

J M105

uvr

uvr umuDCpolB

uvr dinBumuDC

uvr dinBpolB

DNA polymerase IV is engaged in

DNA polymerase IV is engaged in

translesion synthesis of HNE-DNA

translesion synthesis of HNE-DNA

adducts

adducts

0.0E+00

2.5E-03

5.0E-03

7.5E-03

0

10

20

HNE(mM)

M

u

ta

ti

o

n

f

re

q

en

cy

uvr dinBumuDC

uvr dinBpolB

uvrpolDC

Pol
IV

Pol
II

Pol
V

DNA polymerase IV bypasses HNE-DNA adducts in an error-

DNA polymerase IV bypasses HNE-DNA adducts in an error-

free manner. DNA polymerase V is responsible for mutations.

free manner. DNA polymerase V is responsible for mutations.

Podsumowanie ćwiczenia 7

MutS

dziki

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2
3 4

3 2 4 1 3 2 1 4 1 2 3
4

dzień 0 / dzień 1 /
dzień 3

dzień 0 / dzień 1 / dzień 3

Ćwiczenie 8:

Testy wykrywania mutagenów

środowiskowych

I. Testy bakteryjne (test Amesa, SOS chromotest, test Millera)

wykorzystujące rewersję do prototrofii lub uszkodzenie DNA

II. Inne testy z wykorzystaniem mikroorganizmów, mutageneza w

drożdżach, badanie mutacji ludzkiego genu TP53 w drożdżach

III. Testy z wykorzystaniem Drosophila melanogaster

IV. Mutacje w organizmach ssaków z wykorzystaniem

mikroorganizmów lub wirusów: host-mediated assay

V. Uszkodzenia DNA w komórkach ssaków, test kometkowy

VI. Mutacje punktowe w organizmach ssaków,

big blue mouse

VII. Wymiany chromatyd siostrzanych

VIII. Aberracje chromosomowe

IX. Mikrojądra

X. Testy na kancerogenezę – zaberowane krypty w jelicie grubym

(zmiany przednowotworowe), indukcja nowotworów w różnych
organach)

Funkcjonalny
test na mutacje
w TP53 w
drożdżach

Test bada czy białko
TP53 aktywuje
transkrypcję
drożdżowego genu
reporterowego
ADE2, będącego pod
kontrolą promotora
współpracującego z
TP53. Kolonie
zawierające

wersję

podstawową genu
TP53 są białe

,

natomiast

wersję

zmutowaną są
różowe

.

Test kometkowy

The Big Blue mouse system. The
transgenic mice carrying the lacI target
gene in an integrated -based vector, are
treated with Cr by instillation into the
lung. Later, animals are sacrificed, the
lungs are removed, and lung DNA is
isolated. Target gene sequences are
recovered by packaging and lacI mutants
are identified by plaque color on indicator
plates.

Big blue mouse

1. SOS chromotest

Badamy uszkodzenia DNA indukowane przez

NQO

oraz

DMS

Pierwsza hodowla już została nastawiona przez prowadzących – zaczynamy

od p. 2

Każda grupa robi jeden związek; do DMS kontrolą jest NQO.

2. Wymiana chromatyd siostrzanych

Pokaz preparatów mikroskopowych – oglądamy pod imersją oraz liczymy

liczbę wymian indukowanych 4-hydroksynonenalem w komórkach
nieuszkodzonych oraz z zespołem Wernera (z płyty CD)

3. Zaberowane krypty w jelicie grubym

Oglądamy pod mikroskopem strukturę jelita; szukamy zaberowanych krypt.

Oglądamy preparaty histologiczne przekroju jelita myszy; szukamy

dzielących się i zaberowanych krypt

Ćwiczenie 8

Wymiany chromatyd siostrzanych

Powstają w wyniku rekombinacji homologicznej pomiędzy
siostrzanymi chromatydami w fazie S

Pokaz wymian indukowanych 4-hydroksynonenalem w komórkach z
wyciszoną i niewyciszoną helikazą WRN – każda grupa policzy po 20
metafaz w każdej serii

Zaberowane krypty jelitowe jako zmiany
przednowotworowe

Fig. 2.  Multi-stage model of rat colon cancer induced by PhIP. ACF, a candidate preneoplastic
lesion of the colon, are induced shortly after exposure to PhIP. The majority of ACF are
histologically non-dysplastic lesions with a subset of lesions demonstrating dysplastic features.
Approximately one-quarter of dysplastic ACF harbor either Apc or β-catenin mutations. Dysplastic
ACF may further progress into more dysplastic lesions, namely high-grade dysplastic ACF,
adenomas and adenocarcinomas. The susceptibility gene, Sct, on rat chromosome 16 is
considered to control the development of ACF

Różna morfologia zaberowanych krypt

Przekroje podłużne i
poprzeczne przez
ścianę jelita grubego
myszy

(barwione
hematoksyliną i
eozyną)