Podsumowanie ćwiczenia

4

Specyficzność mutagenów chemicznych i

fizycznych

UV

DMS

H

2

O

2

Deficyt w XPV

Pol



Pol ,

T T

T T

T T

A

A

UV

UV

Pol V

(E.coli)

T=T
A G

Xeroderma
pigmentosum
(Variant)

CC106

UV

GCCG

UV

ATGC

H

2

0

2

CC104 GC->TA

CC101 AT->CG

CC105 AT->TA

Wyniki uzyskane na ćwiczeniach w dniu 15.03.2012

H

2

O

2

MF

dawka 0 150 mM

250 mM

Szczep CC101 (ATCG) > 8,5x10

-8

> 1,15x10

-7

3x10

-2

CC104 (GCTA) 2x10

-8

> 3,5x10

-5

?

CC105 (ATAT) 1,7x10

-5

51x10

-5

?

DMS

dawka 0 20
mM

CC102 (GCAT) ? >2x10

-7

57x10

-7

CC104 (GCTA) 1,1x10

-6

3x10

-4

CC105 (ATTA) 2,6x10

-9

4x10

-7

UV

CC 103 (GCCG) kilka mutantów CC106 (ATGC)

brak mutantów

Ćwiczenie 6

Rola polimeraz o obniżonej

wierności

w mutagenezie.

Niestabilność trójek

nukleotydowych.

Błędna naprawa
DNA

System SOS u E.coli

Bakterie naświetlone małymi dawkami

UV są bardziej odporne na działanie

dużych dawek UV, ale

kosztem zwiększenia częstości mutacji

W skład systemu wchodzi ok. 43

różnych białek, m.in.

2 polimerazy

DNA o obniżonej wierności, ale

zwiększonej tolerancji na uszkodzenia

DNA

System SOS u
E.coli

Regulator – białko

RecA

rekombinacj
a

SOS

Platforma do
tworzenia
trójniciowych
struktur DNA

Po utworzeniu
filamentu na ssDNA
staje się proteazą dla
represora regulonu
SOS

5’

5’

System SOS u E.coli (ok. 43

genów)

Pełna indukcja ok. 40 min

(proteaza
)

Oraz dinB – Pol
IV

Escherichia coli

Escherichia coli

posiada

posiada

-

dwie replikacyjne polimerazy DNA

dwie replikacyjne polimerazy DNA

(Pol III,

(Pol III,

Pol I)

Pol I)

-

trzy polimerazy indukowane w systemie

trzy polimerazy indukowane w systemie

SOS

SOS

•

•

Pol II

Pol II

(pol B) – wierna

(pol B) – wierna

•

•

Pol IV

Pol IV

(din B) - niewierna

(din B) - niewierna

•

•

Pol V

Pol V

(umuDC) - niewierna

(umuDC) - niewierna

T T

Zamiana
polimerazy

T T

G A

T T

G A

Polimeraza DNA V
kopiuje:

Dimery tyminowe – TT:GA mutacje TC
6-4 fotoprodukty

Miejsca apurynowe ATTA

Addukty acetyloaminofluorenu -
bezbłędnie

Błędy na nieuszkodzonej matrycy

Niska procesywność

Przejście przez uszkodzenie

nie gwarantuje podjęcia

replikacji, gdyż polimerazy

DNA nie mogą wydłużać źle

sparowanych końców

Funkcją niektórych

polimeraz jest wydłużanie

źle sparowancyh końców

Polimeraza DNA IV

250 cząsteczek/niezaindukowaną komórkę

Liczba cząsteczek wzrasta 10-krotnie po
indukcji SOS

Nie kopiuje CPD i 6-4 fotoproduktów

Główna rola – wydłużanie
źle sparowanych końców
DNA

Np. pol V wstawia C naprzeciw adduktu B[a]P-
G i odpada, a pol IV wydłuża bezbłędnie

Uczestniczy w powstawaniu

mutacji adaptacyjnych

Polimeraza DNA II jest wierna i zapewnia re-

start replikacji po zatrzymaniu widełek

replikacyjnych

Np. bierze udział w
przechodzeniu przez
addukty AAF-G z
wytworzeniem
frameshiftów -2

Pol V - bezbłędnie

N

N

N

N
H

N

dRyb

O

C

H

3

OH

OH

+

dG1

m.w. (MH

) = 424

dR

O

H

OH

N

O

N

N

CH

3

dC1

, m.w. (MH

+

) =

384

C

H

3

dRyb

N

O

N

N

O

H

OH

D'

dC2

, m.w. (MH

+

) = 382

Transformacja DNA faga M13 do

szczepów E. coli:

1. JM 105 uvr – obecne 3 polimerazy SOS

2. JM 105 uvr dinB umuDC – tylko Pol II

3. JM 105 uvr polB umuDC – tylko Pol IV

4. JM 105 uvrA dinB polB - tylko Pol V

Część osób zmodyfikuje
dsDNA faga M13
promieniowaniem UV

Błędy replikacyjne jako źródło
mutacji

Wstawienie
nieprawidłowej zasady

Poślizg

polimerazy

Choroby traktów poliglutaminowych

(CAG/CTG)

Choroba Huntingtona (odkryta w 1993 r)

Choroba Huntingtona (odkryta w 1993 r)

Gen HD - w egzonie 1 występuje 7-34 powtórzeń

CAG

Mutacja

> 40 powtórzeń

Objawy: gromadzenie w jądrach komórek źle
sfałdowanego białka lub odciętego przez kaspazy
traktu poliGlu -

interakcja i hamowane czynników

transkrypcyjnych oraz deacetylazy histonów

Ekspansja trójek nukleotydowych (CAG)

– choroba Huntingtona

Ekspansja zależna od
MSH2

Delecja niezależna od
MSH2

3'

5'

5'

3'

G

A

C

C

A

G

CAGCAGCAGCAG

5'

3'

G

A

C

C

A

G

5'

3'

G

A

C

C

A

G

MSH2

MSH2

MutS β

(Msh2−Msh3)

powoduje ekspansję

CAG w sekwencji kodującej u myszy HD

Naprawia pętle

insercyjno-

delecyjne

Naprawia błędnie

sparowane zasady

Ekspansja jest zależna od obecności 8-OHG w
DNA

7 tyg myszy – brak ekspansji

52 tyg myszy – ekspansja

Wzrost uszkodzeń DNA z wiekiem:

3MeA – 1,2 raza; 5OHC – 8 razy; 8-OHG – 3
razy

Poziom 8-OHG jest większy w mózgu niż w
tkankach somatycznych, np. wątrobie

Mutacja białka OGG1 (wycina z DNA 8-OHG i
nacina nić DNA) hamuje ekspansję

Inne glikozylazy nie są zaangażowane