Podsumowanie ćwiczenia 6 –

fotoreaktywacja

Prób

a

AB1157

BH200 (30sek

UV)

BH200 (1 min UV)

E-arg

MF

(x10

-8

)

LB

(x10

8

)

E-arg

MF

(x10

-8

)

LB

(x10

8

)

E-arg

MF

(x10

-8

)

LB

(x10

8

)

K

17

0,39

43,5

4

0,09

44

4,5

0,25

18

A

103

321

0,32

16

3,76

4,25 18

100

0,18

B

166

404

0,41

40

1,6

25

12

3,74

(195)

( 60)

3,21

C

107

13,5

7,9

44

9,7

4,55 22

8,46

2,6

Błędy replikacyjne jako źródło
mutacji

Wstawienie
nieprawidłowej zasady

Poślizg

polimerazy

Choroby traktów poliglutaminowych

(CAG/CTG)

Choroba Huntingtona (odkryta w 1993 r)

Choroba Huntingtona (odkryta w 1993 r)

Gen HD - w egzonie 1 występuje 7-34 powtórzeń

CAG

Mutacja

> 40 powtórzeń

Objawy: gromadzenie w jądrach komórek źle
sfałdowanego białka lub odciętego przez kaspazy
traktu poliGlu -

interakcja i hamowane czynników

transkrypcyjnych oraz deacetylazy histonów

Ćwiczenie 7

niestabilność trójek

nukleotydowych

Ekspansja trójek nukleotydowych (CAG)

– choroba Huntingtona

Ekspansja zależna od
MSH2

Delecja niezależna od
MSH2

3'

5'

5'

3'

G

A

C

C

A

G

CAGCAGCAGCAG

5'

3'

G

A

C

C

A

G

5'

3'

G

A

C

C

A

G

MSH2

MSH2

MutS β

(Msh2−Msh3)

powoduje ekspansję

CAG w sekwencji kodującej u myszy HD

Naprawia pętle

insercyjno-

delecyjne

Naprawia błędnie

sparowane zasady

Ekspansja jest zależna od obecności 8-OHG w
DNA

7 tyg myszy – brak ekspansji

52 tyg myszy – ekspansja

Wzrost uszkodzeń DNA z wiekiem:

3MeA – 1,2 raza; 5OHC – 8 razy; 8-OHG – 3
razy

Mutacja białka OGG1 (wycina z DNA 8-OHG i
nacina nić DNA) hamuje ekspansję

Inne glikozylazy nie są zaangażowane

1. Izolacja plazmidów zawierających
wstawki CGT/CAT różnej długości ze
szczepów bakterii MMR

-

oraz MMR

+

(kit)

2. Elektroforeza agarozowa

3. Izolacja własnego DNA z nabłonka
policzka – kit (przygotowanie do ćwiczenia
9)

4. Liczenie wyników ćwiczenia 6 – liczymy
mutanty i wszystkie łysinki.

Dziś wykonujemy:

Transformacja DNA faga

M13 do szczepów E.
coli:

1.

JM 105 uvr – obecne 3 polimerazy
SOS

2.

JM 105 uvr dinB umuDC – tylko
Pol II

3.

JM 105 uvr polB umuDC – tylko Pol
IV

4.

JM 105 uvrA dinB polB - tylko Pol
V

Polimerazy DNA o obniżonej wierności -
podsumowanie

Przeżyc

ie

Stęż.

HNE

Pol

II, IV,

V

Pol II Pol IV Pol V

0

100

100

100

100

5

102

85

43

27

67

15

87

114

66

8,7

80

50

36

93

18

3,4

24