MIKROBIOLOGIA

Prowadzące przedmiot: dr n. med. Ewa Romuk

dr n. med. Aleksandra

Kasperczyk

Adres mailowy: [e-mail]

Budowa mikroskopu świetlnego

Zbudowany jest z dwóch układów:
mechanicznego

-podstawa – element stabilizujący urządzenie, zawiera wbudowane źródło
światła

-statyw – zapewnia sztywność całej konstrukcji, łączy poszczególne
elementy mikroskopu
- tubus – element łączący odcinek pomiędzy obiektywami a okularami

-rewolwer –obrotowa tarcza, w której osadzone są obiektywy, obrót
rewolweru pozwala na wprowadzenie w oś optyczną żądanego obiektywu

-śruba makro- i mikrometryczna –służą do ustawienia obrazu,
wprowadzając w ruch stolik przedmiotowy regulują odpowiednią odległość
obserwowanego przedmiotu od obiektywu,
śruba makrometryczna – mechanizm ruchu zgrubnego, pozwala na szybkie
znalezienie obrazu preparatu
śruba mikrometryczna – mechanizm ruchu drobnego, służy do korekcji
ostrości obrazu

-stolik przedmiotowy – służy do położenia i umocowania na nim preparatu,

-wyposażony w pokrętła mechanizmu krzyżowego pozwala na przesuwanie

-preparatu w osiach X, Y, a tym samym zmianę pola widzenia

optycznego

-okulary – zbudowane najczęściej z kilku soczewek, służących do
powiększania wytworzonego w obiektywie obrazu, a jednocześnie korygując
pewne wady obrazu

-obiektywy –skupiają promienie świetlne wychodzące z preparatu tworząc
jego powiększony obraz za pomocą zespołu soczewek.
Na metalowej oprawce obiektywu wygrawerowane są informacje o
rodzaju układu optycznego, powiększeniu własnym, apreturze, długości
tubusa i grubości szkiełka nakrywkowego.

Wyróżniamy:
- obiektywy suche (pow. do 60x) - przestrzeń robocza pomiędzy
preparatem a soczewką czołową obiektywu wypełniona jest powietrzem,
co powoduje rozproszenie części promieni świetlnych i w rezultacie mniejszą
ostrość obrazu,
- obiektywy immersyjne,
zanurzeniowe (pow. do 150x), gdzie przestrzeń roboczą wypełnia
olejek immersyjny o podobnym współczynniku załamania światła do szkła,
promienie nie ulegają więc rozproszeniu, umożliwiając uzyskanie jasnego,
wyraźnego obrazu.

-kondensor – umieszczony pod stolikiem, składa się z kilku soczewek
skupiających promienie świetlne na preparacie, a ostatecznie na soczewce
obiektywu, wyposażony w przysłonę regulującą dopływ światła

-źródło światła – najczęściej lampa wewnętrzna wbudowana w podstawę
mikroskopu, w starszych typach lampa zewnętrzna lub światło dzienne,
których promienie kieruje się na kondensor za pomocą zwierciadła (lusterka

).

W obserwacji mikroskopowej drobnoustrojów najważniejszymi parametrami
mikroskopu są:

-powiększenie mikroskopu – iloczyn powiększenia obiektywu i
powiększenia okularu

-zdolność rozdzielcza mikroskopu – najmniejsza odległość między dwoma
punktami widzianymi oddzielnie.

Im większa jest zdolność rozdzielcza mikroskopu, tym mniejsze obiekty
są widoczne.

Technika mikroskopowania

1. Ustawić mikroskop ok. 15-20 cm od krawędzi stołu laboratoryjnego

i

sprawdzić jego czystość.

2. Ustawić w osi optycznej obiektyw o małym powiększeniu (np. 10x)

w

odległości 3-4 cm od stolika, otworzyć przysłonę, włączyć źródło

światła.

3. Umieścić preparat na stoliku przedmiotowym.

4. Podnosić stolik za pomocą śruby makrometrycznej do momentu

uzyskania

obrazu preparatu widzianego w okularach. Wyregulować ostrość

obrazu za

pomocą śruby mikrometrycznej.

5. Włączając w oś optyczną obiektywy o większych powiększeniach
korygować ostrość obrazu za pomocą śruby mikrometrycznej i
oświetlenia, podnosząc kondensor i regulując dostęp światła

przysłoną.

6. Ustawić położenie preparatu za pomocą aparatu krzyżowego, aby
oglądane obiekty znajdowały się w środku pola widzenia.

7. Zastosowanie obiektywu immersyjnego wymaga naniesienia na
powierzchnię preparatu kropli olejku immersyjnego, a następnie
podnoszenia śrubą mikrometryczną stolika do momentu zetknięcia się
olejku z soczewką czołową obiektywu; moment ten należy uchwycić,
obserwując z boku podnoszenie się stolika.

8. Patrząc w okulary skorygować ostrość śrubą mikrometryczną i oświetlenie
preparatu, podnosząc kondensor do górnej pozycji.

9. Po skończonym mikroskopowaniu zdjąć preparat ze stolika, wyczyścić
okulary oraz obiektywy mikroskopu miękką ściereczką nasączoną benzyną.

10. Przed odstawieniem mikroskopu wprowadzić w oś optyczną obiektyw o
małym powiększeniu (np.10x), opuścić stolik i kondensor w dół, nakryć
mikroskop pokrowcem.

Izolowanie czystych kultur drobnoustrojów, techniki

posiewów.

Oznaczanie liczby drobnoustrojów.

Prowadzenie badań nad drobnoustrojami wymaga

wyposażenia

laboratorium mikrobiologicznego w podstawowy sprzęt.

-igła preparacyjna – cienki, prosty drucik umocowany w

oprawce, służący do posiewów głębinowych bakterii,
sporządzania preparatów mykologicznych.

Może być zakończony haczykiem i wtedy służy do

przeszczepiania grzybów.

-eza –stalowy lub platynowy drucik umocowany w oprawce

zakończony oczkiem. Służy do posiewów, przesiewów,
sporządzania preparatów mikroskopowych.

-głaszczka – szklany wygięty pręt służący do posiewów

powierzchniowych na płytkach Petriego lub rozsiewania
materiału biologicznego na innych powierzchniach.

Rys.. Igła, eza, głaszczka

- płytki Petriego - dwie szklane lub jednorazowe z tworzywa,
zachodzące na
siebie szalki stosowane do hodowli drobnoustrojów na podłożach
stałych,
liczenia i określania morfologii kolonii mikroorganizmów

- kolby, probówki szklane - stosowane do wykonania rozcieńczeń,
sporządzania i przechowywania pożywek, do posiewów i
prowadzenia
hodowli na pożywkach płynnych i zestalonych

- pipety szklane / miarowe

-pipety pasteurowskie

- komory zliczeniowe- służą do określania liczby bakterii na
jednostkę
objętości cieczy. Bakterie są liczone wizualnie pod mikroskopem.

Wyjaławianie pożywek.
Pożywki wyjaławia się przez stosowanie temperatury i przez sączenie.

Przechowywanie pożywek.
Podstawowe składniki pożywek, takie jak: bulion zwykły, agar zwykły,
wyciągi z narządów lub z drożdży oraz pożywki w postaci zakupionych
proszków, a także pożywki gotowe przechowuje się w lodówkach, niekiedy
w zamrażarkach, rzadziej w temperaturach pokojowych. Najwłaściwsza
jest temperatura 4 0C.

Szkło.
Probówki, płytki Petriego, kolby, butelki i buteleczki muszą być wykonane
ze szkła o obojętnym oddziaływaniu

Kontrola jakości pożywek.
Po wykonaniu danej serii pożywki, należy za pomocą szczepu wzorcowego
przeprowadzić kontrole jej właściwości fizjologicznych i biochemicznych, tj.
czy odpowiada ona celowi zastosowania, np. wzrost szczególnie wybrednych
bakterii, rozkład wybranego substratu, właściwe zabarwienie pożywki i in.
Do każdej pożywki należy dobrać jeden lub kilka szczepów wzorcowych,
typowych.

Przed barwieniem właściwym dokonuje się szeregu czynności

przygotowawczych.

Należą do nich:
1. przygotowanie szkiełek podstawowych.

Używa się szkiełek wykonanych ze szkła obojętnego nie

uwalniającego zasad. Szkiełka dokładnie myje się w
roztworze mydła lub w detergentach. Jeśli podejrzewa się,
że szkiełko jest zanieczyszczone, to należy natrzeć je na
sucho zwykłym mydłem i również na sucho wytrzeć czystą
ścierką, a następnie opalić w płomieniu palnika gazowego.

Szkiełka zanieczyszczone nie nadają się do wykonywania

preparatów.

2. Nakładanie bakterii.

Z pożywki płynnej na szkiełko bakterie nakłada się ezą.

Po powierzchni szkiełka kroplę rozprowadza się w kształcie koła
o średnicy 1—2 cm. Szkiełko zostawia się aż do wyschnięcia kropli.

Z pożywki stałej bakterie nakłada się ezą do uprzednio położonej na

szkiełku kropli soli fizjologicznej lub innego jałowego płynu.
W kropli tej robi się zawiesinę bakterii i rozprowadza po powierzchni szkła.
Szkiełko odkłada się aż do wyschnięcia.

Z materiału chorobowego wykonuje się preparaty różnymi sposobami.
Oprócz wyżej przedstawionych, stosuje się jeszcze rozcieranie materiału
(plwociny, ropy, zeskrobin) między dwoma szkiełkami podstawowymi, na
dwóch trzecich ich powierzchni. Za jedną czwartą część szkiełka trzyma
się palcami, dlatego należy uważać, by nie zetknąć się z zarazkami.
Preparaty takie także suszy się.

METODY BARWIENIA BAKTERII

1.Barwniki.
Barwniki, zależnie od zdolności łączenia się i powinowactwa do różnych
związków chemicznych, dzielą się na dwie grupy: zasadowe i kwaśne.
Ze względu na kwaśne pH składników komórki bakteryjnej
(kwasy nukleinowe) w bakteriologii mają zastosowanie barwniki zasadowe,
takie jak

fiolet krystaliczny (gencjana), fiolet metylowy, fuksyna.

błękit metylenowy, zieleń metylenowa, zieleń malachitowa i safranina.

Z barwników kwaśnych używane są

eozyna i fuksyna kwaśna.

2. Teorie procesu barwienia.
Drobnoustroje mają różne powinowactwo do barwników.
Czasem jedne części komórki barwią się silniej, inne słabiej Procesy
barwienia tłumaczone są dwoma teoriami:
a. chemiczną - barwniki zasadowe łączą się z kwaśnymi związkami
komórki bakteryjnej (kwasy nukleinowe).
Zjawisko barwienia byłoby procesem łączenia się:
kwas + zasada = sól (zabarwienie).
b. fizyczna - barwniki adsorbują się na powierzchni związków
chemicznych komórki, a następnie przytrzymywane są przez siły
elektrostatyczne.

PODZIAŁ METOD BARWIENIA

Barwienie bakterii dzieli się na:
- negatywne

-pozytywno-negatywne

- pozytywne

• proste

• złożone

Barwienie negatywne - polega na tym. że do kropli żywych bakterii
na szkiełku dokłada się kroplę grubo dyspersyjnego barwnika,
takiego jak np. tusz chiński lub nigrozyna.
Drugim szkiełkiem o szlifowanych brzegach wykonuje się rozmaz obu
zmieszanych kropli. Po wysuszeniu na ciemnym tle podłoża widoczne są
bezbarwne kształty komórek bakteryjnych. Barwniki nie wnikają do wnętrza
komórki, lecz zabarwiają tło tzn. powierzchnię szkła.

Barwienie pozytywno-negatywne - można wykazać obecność otoczek
u bakterii.

W 1 ml soli fizjologicznej zawiesza się bakterie, dodaje się kroplę
fuksyny karbolowej. Zawiesinę ogrzewa się do 70°C przez 1—2 min.
Jest to pierwsza faza barwienia komórek — faza pozytywna.

Następnie kroplę zawiesiny kładzie się na szkiełko i dodaje się drugą
kroplę barwnika grubo-dyspersyjnego, np. nigrozyny.
Szkiełkiem o szlifowanych brzegach robi się rozmaz jak w metodzie
negatywnej. Preparat suszy się w temperaturze pokojowej.
Jest to faza barwienia negatywnego.
W mikroskopie widoczne są czerwono zabarwione komórki na ciemnym tle.

Jeśli bakterie mają otoczki, to dookoła czerwono zabarwionej komórki
są dobrze widoczne bezbarwne otoczki na ciemnym tle.

Barwienie pozytywne - bakterie barwią się i są widoczne na bezbarwnym
tle.
Po przygotowaniu preparatu na szkle można go zabarwić metodą prostą,
która polega na zastosowaniu tylko jednego barwnika, albo metodą złożoną,
polegającą na stosowaniu kilku barwników i odbarwiaczy.

BARWIENIE PROSTE (JEDNOBARWNE)

W barwieniu tym można zastosować dowolnie wybrany barwnik
bakteriologiczny.
Najczęściej używany jest błękit metylenowy.
Na utrwalony preparat nalewa się barwnik na 10 min.
Po tym czasie preparat spłukuje się wodą.
Bakterie barwią się na

niebiesko

.

Bakterie

Gram-dodatnie

Bakterie

Gram-ujemne

Schemat barwienia bakterii metodą Grama

Utrwalenie

preparatu

Fiolet krystaliczny

Płyn Lugola

Odbarwienie

roztworem

alkoholu

Fuksyna zasadowa

W mikroskopie widoczne są bakterie zabarwione albo na kolor
ciemno-fioletowy (granatowy), są to bakterie Gram-dodatnie albo na kolor
Czerwony są to bakterie Gram-ujemne. W jednym preparacie mogą się
znajdować różne gatunki bakterii o różnym zabarwieniu, np.
Gram-dodatnie ziarniaki i Gram-ujemne pałeczki.

Od czego zależy różna barwliwość bakterii barwionych tą metodą?
Od składu chemicznego komórek bakteryjnych.

Bakterie Gram-dodatnie zawierają w komórce bakteryjnej kwasy
teichojowe i rybonukleinian magnezu połączony z białkiem.
Fiolet krystaliczny po połączeniu się z rybonukleinianem magnezu i jodem
(płyn Lugola) tworzy nierozpuszczalny w alkoholu związek.
Bakterie Gram-ujemne mają inną budowę chemiczną i dlatego
barwniki wypłukiwane są alkoholem z komórek, które w następnym
etapie przyjmują barwnik dodatkowy — fuksynę (zieleń malachitowa,
safranina).
Jest to bardzo cenna metoda służąca do podziału bakterii.

GRAM +

GRAM -

- barwią się na fioletowo
- ściana komórkowa gruba
zbudowana z mureiny

(wielowarstwowa),
połączonych białkami;
zawierają również wielocukry

tzw. kwasy tejchojowe

- gronkowce, paciorkowce,
dwoinka zapalenia płuc,

maczugowiec błoniasty,
laseczka wąglika, tężca, jadu
kiełbasianego, zgorzeli

gazowej, prątek gruźlicy,
promieniowce

-odbarwiają się
-ściana komórkowa cienka i
jednowarstwowa. Z zewnątrz

okryta błoną zewnętrzną
zbudowaną z białek i
lipopolisacharydów –

warunkuje swoistość
antygenową bakterii
(właściwości chorobowtórcze)

-Dwoinka zapalenia opon
mózgowych, rzeżączki,
pałeczka ropy błękitnej,

brucellozy, tularemii,
krztuśćca, dżumy,
przecinkowiec cholery