Mikrobiologia to nauka o drobnoustrojach, do których zaliczamy:

1. Wirusy

2. Organizmy prokariotyczne:

   1. Bakterie,

   2. Riketsje,

   3. Mikoplazmy,

   4. Sinice.

3. Organizmy eukariotyczne:

   1. Grzyby mikroskopowe,

   2. Glony jednokomórkowe i kolonijne,

   3. Pierwotniaki.

Sterylizacja, czyli wyjaławianie – jest to zabicie lub usunięcie wszystkich drobnoustrojów – zarówno form wegetatywnych, jak i przetrwalnikowych, różnymi metodami.

Forma wegetatywna – przejawia funkcje życiowe.

Przetrwalniki – formy zachowawcze, nie pobierają pokarmu, nie rozmnażają się.

METODY STERYLIZACJI

1. Sterylizacja termiczna

   1. NA SUCHO

1. Wyżarzanie

2. Opalanie

3. Jałowienie w suszarce

   1. NA MOKRO

1. Autoklaw (sterylizator podłoży syntetycznych)

2. Aparat Kocha – metoda tyndalizacji (pasteryzacja frakcjonowana – jałowienie 3-krotne w odstępach 24 godzinnych)

1. Metody mechaniczne – filtrowanie.

Rodzaje filtrów mikrobiologcznych
a. filtr Chamberlanda
b. filtry membranowe

1. Metody radiacyjne
   a. promieniowanie UV
   b. promieniowanie jonizujące
   c. promieniowanie Rentgena

Dezynfekcja – odkażanie – działanie środkami chemicznymi na drobnoustroje. Podczas dezynfekcji niszczymy tylko formy wegetatywne drobnoustrojów.

Działanie środków dezynfekcyjnych może być:
1. Zabójcze (bakterio- lub mikobójcze) – zabicie komórek drobnoustrojów.
2. Statyczne (bakterio- lub mikostatyczne) – powstrzymanie dalszego rozwoju bez przerywania czynności życiowych.

Pasteryzacja – jednorazowe ogrzanie płynów do temperatury od 60 do ok. 90°C i natychmiastowe schłodzenie. Pasteryzacja powoduje zabicie tylko form wegetatywnych mikroorganizmów.

Podłoża mikrobiologiczne (pożywki) – środowiska w których sztucznie stworzono odpowiednie warunki odżywcze i pH dla wzrostu i rozwoju drobnoustrojów.

Cechy charakterystyczne podłóż:
- łatwo dostępne źródło węgla (wyjątek autotrofy)
- łatwo dostępne źródło azotu (wyjątek asymilatory azotu atmosferycznego)
- obecność soli mineralnych
- izotoniczność środowiska
- odpowiednie pH

Podział podłóż:

* ze względu na konsystencję:
- płynne np. bulion
- półpłynne np. żelatyna
- stałe np. agar-agar

*ze względu na skład chemiczny:
- syntetyczne (sztuczne) np. Chapman, podłoże Demetera,
- naturalne np. bulion, brzeczka, surowica, jajko kurze
- minimalne
- pełne

*ze względu na wzrost drobnoustrojów:
- ogólne (zwykłe, kolektywne, podstawowe, uniwersalne)
- selektywne (specjalne, wybiórcze)

Podłoża ogólne do hodowli bakterii
- Agar zwykły (MPA) – podłoże stałe
- bulion zwykły – podłoże płynne
- żelatyna – podłoże ogólne do hodowli bakterii proteolitycznych

Podłoża ogólne do hodowli grzybów:
- brzeczka – podłoże stałe

Warunki rozwoju mikroorganizmów:
- obecność wody
- obecność soli mineralnych i substancji odżywczych
- odpowiednie pH
- temperatura
- skład atmosfery środowiska

Ogólne warunki hodowli drobnoustrojów

drobnoustroje	pożywka	temperatura	pH	czas hodowli
bakterie	MPA bulion	37⁰C 37⁰C	~ 7 ~ 7	24 h 24 h
bakterie proteolityczne	żelatyna	20-22⁰C	~ 7	48 h
grzyby	brzeczka	28⁰C	~ 5,6	3 dni

Mikroorganizmy tlenowe i względnie beztlenowe hoduje się w termostatach (inkubatorach, cieplarkach) lub na wytrząsarkach (napowietrzanie) z łaźnią wodną.

Bezwzględne beztlenowce hoduje się pod parafiną, olejem, warstwą agaru 3% lub w obecności mikroorganizmów usuwających tlen z pożywki. Hodowlę beztlenowców można również przeprowadzić w eksykatorach próżniowych lub w anaerostatach.

Przechowywanie drobnoustrojów
- w chłodni w temperaturze +1°C - +4°C
- w zamrażalkach
- w postaci zliofilizowanej

Liofilizacja – suszenie drobnoustrojów w niskiej temperaturze w próżni.

METODA IZOLACJI MIKROORGANIZMÓW:

1. Metoda opadowa

2. Metoda odciskowa

3. Metoda posypowa

4. Metoda płytkowa rozcieńczeń Kocha

5. Metoda posiewu po wieloboku

MORFOLOGIA BAKTERII:

- FORMY KULISTE:

Układy:

• Micrococcus (ziarniak),

• Diplococcus (dwoinka),

• Tetragenes (czwórniak),

• Sarcina (sześcianka)

• Streptococcus (paciorkowiec),

• Staphylococcus (gronkowiec).

- FORMY CYLINDRYCZNE:

• Bacillus (laseczka),

• Clostridium (laseczka),

• Streptobacillus (laseczka),

• Bacterium (pałeczka).

- FORMY SPIRALNE:

• Spirillum (śrubowiec),

• Spirochaeta (krętek),

• Vibrio (przecinkowiec).

BARWNIKI

Są to substancje syntetyczne pochodzenia naturalnego, które absorbują się lub rozpuszczają w barwionych substratach, dając trwałe połączenia barwne.

Związki stosowane do barwienia posiadają zazwyczaj grupę chromoforową – BARWNĄ (zalicza się tutaj grupy -azo, -nitrozo, -azoksy, -tiokarbonylową) i auksochromową – NASILAJĄCĄ BARWĘ i UŁATWIAJĄCĄ BARWIENIE, tzn. mającą zdolność tworzenia soli z różnymi substratami np. grupy –amino, -hydroksy, -karboksy

PODZIAŁ BARWNIKÓW

- kwaśne (eozyna, fuksyna kwaśna, zieleń jasna)

- zasadowe (błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fiolet goryczki, fuksyna zasadowa)

Barwniki zasadowe to sole, w których barwny jest kation; ich roztwory są na skutek hydrolizy lekko kwaśne. Barwniki kwaśne to sole, w których kationem jest metal, a jonem barwnym anion.

Do barwienia drobnoustrojów stosuje się przeważnie barwniki zasadowe. Wynika to z budowy i składu chemicznego powierzchniowych warstw komórki, jak również ze znacznej zawartości kwasów nukleinowych.

CELE BARWIENIA

• odróżnienie bakterii od składników otoczenia

• odróżnienie poszczególnych grup drobnoustrojów między sobą

• odróżnienie pewnych szczegółów w budowie komórki

• wykazanie zmian czynnościowych w komórce

BARWIENIE BAKTERII ZALEŻY OD

• stanu fizyko – chemicznego barwnika i odbarwiacza

• natury barwionych substratów

• zewnętrznych czynników natury fizycznej i chemicznej wspierających procesy barwienia (np. podgrzewanie preparatów)

• liczby i pozycji grup chromoforowych barwnika, a także od obecności grup auksochromowych

ROZTWORY MACIERZYSTE

Aby sporządzić barwnik przygotowuje się roztwory macierzyste, czyli nasycone roztwory alkoholowe w stosunku 1:10. Na 1g barwnika daje się 10 ml 96% alkoholu etylowego. Rozczyn ten pozostawia się w cieplarce przez 3-6 dni często mieszając. Zlany znad osadu roztwór macierzysty barwnika rozcieńcza się wodą destylowaną i dodaje ewentualnie bejców.

METODY BARWIENIA DROBNOUSTROJÓW

SPORZĄDZANIE PREPARATÓW BAKTERIOLOGICZNYCH

1.Na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanosimy za pomocą wyjałowionej ezy 2-3 krople płynu fizjologicznego.

2.Ponownie wyjałowioną ezą pobieramy materiał, wprowadzamy go do kropli soli fizjologicznej i wykonujemy równomierny rozmaz.

3.Wyjaławiamy ezę.

4.Preparat suszymy na wolnym powietrzu.

5.Preparat utrwalamy przez trzykrotne przeciągnięcie przez płomień palnika.

6.Po ostudzeniu zalewamy roztworem barwnika.

7.Spłukujemy wodą, suszymy i oglądamy pod imersją.

CEL UTRWALANIA

• zabicie komórek bakterii

• przyklejenie komórek do szkiełka podstawowego

• częściowa denaturacja białka i rozerwanie struktur komórkowych, co ułatwia wniknięcie barwnika do wnętrza komórki

TEORETYCZNE PODSTAWY BARWIENIA BAKTERII

Rodzaje preparatów mikroskopowych
1. Utrwalone i barwione (głównie bakterie)
2. Przyżyciowe (grzyby, ruch bakterii)

Rodzaje barwienia:

- barwienie proste polega na wprowadzeniu do komórki jednego barwnika,

pozytywne negatywne

obserwujemy zabarwione obserwujemy niezabarwione

drobnoustroje na bezbarwnym tle drobnoustroje na barwnym tle

- barwienie złożone – w czasie barwienia stosuje się kilka barwników w mieszaninie lub kolejno po sobie oraz odbarwiacze.

Sporządzanie preparatów bakteriologicznych:

1. Na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanosimy za pomocą wyjałowionej ezy 2-3 krople płynu fizjologicznego (0,85% roztworu NaCl) – [dotyczy hodowli bakterii z podłoża stałego].

2. Ponownie wyjałowioną ezą pobieramy badany materiał, wprowadzamy go do kropli soli fizjologicznej i wykonujemy rozmaz.

3. Wyjaławiamy ezę.

4. Rozmaz suszymy na wolnym powietrzu.

5. Preparat utrwalamy poprzez trzykrotne przeprowadzenie go przez płomień palnika.

CEL UTRWALANIA:

- zabicie komórek bakterii,
- przyklejenie komórek do szkiełka podstawowego

- częściowa denaturacja białka i rozerwanie struktur komórkowych, co powoduje odsłanianie grup czynnych biorących udział w reakcji i ułatwia wniknięcie barwnika do wnętrza komórki.

1. Utrwalony preparat studzimy na wolnym powietrzu.

BARWIENIE BAKTERII METODĄ PROSTĄ POZYTYWNĄ:

1. Na wysuszony i utrwalony preparat działamy fuksyną alkoholowo-wodną, przez 1,5-2 minut.

2. Preparat spłukujemy wodą, suszymy i oglądamy pod imersją.

Olejek imersyjny – stosujemy w celu skupienia wiązki światła i skierowania bezpośrednio do soczewki frontalnej obiektywu imersyjnego.

Powiększenie mikroskopu – iloczyn powiększenia okularu i obiektywu, np. 10 x 100 = 1000, 12,5 x 100 = 1250.
1000 – 1250 krotnym powiększeniu oglądamy bakterie

Posługiwanie się mikroskopem imersyjnym:

1. Umieścić kroplę olejku imersyjnego na szkiełku przedmiotowym z preparatem.

2. Kondensor podnieść do góry.

3. Odszukać obiektyw imersyjny (100x powiększony).

4. Umieścić szkiełko przedmiotowe na stoliku.

5. Opuścić obiektyw do zanurzenia w olejku zawsze patrząc z boku, aby nie uszkodzić obiektywu.

6. Nastawić światło lusterkiem.

7. Obiektyw powoli podnosić do góry ŚRUBĄ MAKROMETRYCZNĄ do momentu pojawienia się obrazu.

8. Ostrość regulować ŚRUBĄ MIKROMETRYCZNĄ (pół obrotu).

BARWIENIE ZŁOŻONE METODĄ GRAMA W MODYFIKACJI HUCKERA

W metodzie Grama stosujemy:

- barwnik podstawowy – fiolet krystaliczny czas barwienia 1 min.

- bejca (zaprawa, utrwalacz) – płyn Lugola (I w KI, jod w jodku potasu)

- odbarwiacz – 95% etanol

- barwnik kontrastowy – safranina

1. BAKTERIE GRAMDODATNIE – zatrzymują barwnik podstawowy (fiolet) po utrwaleniu go płynem Lugola i nie odbarwiają się pod wpływem alkoholu. W metodzie Grama barwią się na kolor fioletowy. Zaliczamy do nich wszystkie laseczki i formy kuliste.

2. BAKTERIE GRAMUJEMNE – nie zatrzymują kompleksu fiolet krystaliczny – jod, odbarwiają się pod wpływem alkoholu i przyjmują barwnik kontrastowy. W metodzie Grama barwią się na kolor różowy. Należą do nich wszystkie pałeczki.

FORMY CYLINDRYCZNE BAKTERII:

PAŁECZKA

• Gramujemne

• Nie wytwarzają przetrwalników

• Brak zjawiska atrakcji barwnika w barwieniu prostym negatywnym

• Zwykle mniejsze

LASECZKA

• Gramdodatnie

• Wytwarzają przetrwalniki

• Wykazują zjawisko atrakcji barwnika w barwieniu prostym negatywnym

• Zwykle większe

Bacillus	Clostridium
Tlenowe lub względnie beztlenowe	Beztlenowe
Średnica przetrwalnika nie przekracza średnicy komórki wegetatywnej	Średnica przetrwalnika przekracza średnicę komórki wegetatywnej

TECHNIKA BARWIENIA METODĄ GRAMA W MODYFIKACJI HUCKERA

Na wysuszony i utrwalony preparat działamy:

1. Fiolet krystaliczny – 1 minuta.

2. Spłukujemy wodą.

3. Płyn Lugola (I w KI) – 1 minuta.

4. Spłukujemy wodą.

5. Preparat odbarwiamy alkoholem do momentu spływania bezbarwnych kropli alkoholi po powierzchni preparatu (ok. 30 sekund).

6. Przerywamy działanie odbarwiania wodą.

7. Preparat podbarwiamy safraniną – 45 sekund.

8. Spłukujemy wodą.

9. Preparat suszymy i oglądamy pod imersją.

BARWIENIE PROSTE NEGATYWNE

Barwienie negatywne polega na tym, że barwnik znajdujący się w stanie małej dyspersji (b. gruboziarnisty) nie wnika do wnętrza komórki bakteryjnej, zabarwia jedynie tło. Przy tym sposobie barwienia nie zabarwione bakterie widoczne są na barwnym tle.

Najczęściej stosowany barwnik:

- tusz chiński,

- nigrozyna,

- cyjanochina (tło czerwone),

- kolargol (tło czerwone),

- czerwień Kongo (tło czerwone).

Wykonanie preparatu
1. 2-3 krople barwnika umieszczamy w odległości ok. 2cm od krótszego brzegu szkiełka podstawowego
2. Wyjałowioną ezą przenosimy niewielką ilość badanego materiału i dokładnie mieszamy go z barwnikiem.
3. Przy pomocy tekturki o równym brzegu ustawionym pod kątem 45° ruchem ciągłym sporządzamy jednolity rozmaz na ok. 2/3 powierzchni szkiełka podstawowego.
4. Preparat suszymy i oglądamy pod imersją.

Preparatu nie spłukujemy wodą oraz nie utrwalamy.

W barwieniu prostym negatywnym bakterie gram dodatnie wykazują zjawisko atrakcji barwnika, polegające na asocjacji cząsteczek barwnika na powierzchni niezabarwionej komórki.

Bakterie gramujemne nie wykazują zjawiska atrakcji barwnika i tło preparatu jest równomiernie wybarwione. Jednakże czasami można zaobserwować wewnątrz nie wybarwione komórki, delikatną smugę barwnika lub punkcik, co tłumaczy się większą przepuszczalnością ściany komórkowej u bakterii gram ujemnych.

BAKTERIE GRAMUJEMNE BAKTERIE GRAMDODATNIE

brak zjawiska atrakcji barwnika zjawisko atrakcji barwnika

Barwienie negatywne służy do obserwacji bakterii nie wchłaniających uniwersalnych barwników mikrobiologicznych, np. krętek blady (Treponema pallidum).

MORFOLOGIA PROMIENIOWCÓW

PROMIENIOWCE – ACTINOMYCES

Są to gram dodatnie bakterie o różnorodnych cechach morfologicznych fizjologiczno-biochemicznych, o składzie nukleotydowym G + C (guanina + cytozyna) w DNA > 55 mol % (55 – 75 mol %). Są ogniwem pośrednim pomiędzy bakteriami właściwym, a grzybami.

Cechy upodobniające promieniowce do bakterii i grzybów:

CECHY BAKTERII	CECHY GRZYBÓW
Organizmy prokariotyczne	Wytwarzają pseudogrzybnię
Brak uorganizowanego jądra komórkowego	Rozmnażanie

Cechy fizjologiczne promieniowców:

1. Różnorodność procesów rozmnażania (zarodniki – arthrospory, aleuriospory, zoospory - pływki, fragmentacja strzępek, podział komórek).

2. W większości tlenowce (zdarzają się również wyjątki mikroaerofile i betlenowce – głownie pasożyty).

3. Większość to saprofity (nieliczne to pasożyty i chemoautotrofy).

4. Organizmy jednokomórkowe. Komórki mają postać rozgałęzionej strzępki, która może tworzyć dwa rodzaje grzybni:

- grzybnia powietrzna (powierzchniowa) – odpowiada za procesy rozmnażania

- grzybnia podłożowa – przytwierdza do podłoża, odpowiada za pobieranie składników odżywczych.

5. Mają zdolność do autolizy – rozpadu grzybni na fragmenty.

6. Wytwarzają heterokarionty poprzez funkcję protoplastów.

7. Są głównie mezofilami.

* Strzępki promieniowców tworzą grzybnię.

Wybrane rodzaje promieniowców:

• Nocardia sp.

• Actinomyces sp.

• Streptomyces sp.

Znaczenie promieniowców:

1. Uczestniczą w procesie tworzenia gleby.

2. Biorą udział w syntezie i rozkładzie próchnicy.

3. Uczestniczą w tworzeniu się struktury gleby.

4. Produkują metabolit zwany geosminą, który nadaje glebie charakterystyczny ziemisty zapach (Streptomyces odorifer).

5. Biorą udział w przemianach związków fosforowych (głównie Streptomyces sp. uruchamia nierozpuszczalne fosforany).

6. Niektóre gatunki współżyją z roślinami wyższymi i wiążą azot atmosferyczny (np. Frankia alni).

7. Wykazują uzdolnienia w zakresie adsorpcji i degradacji miko toksyn.

8. Produkują witaminy (zwłaszcza z grupy B), enzymy, oraz są głównymi producentami antybiotyków.

9. Uczestniczą w samooczyszczaniu się wód.

10. Są wskaźnikami terenów roponośnych (węgiel jako źródło energii).

11. Są silnymi alergenami, niektóre są szkodnikami magazynów, wiele gatunków ma właściwości chorobotwórcze (gruźlica, trąd, promienica, nokardioza).

ANTYBIOTYK - jest to substancja chemiczna pochodzenia biologicznego (lub jej syntetyczny analog), która wybiórczo działa zabójczo lub statycznie na drobnoustroje w niskich stężeniach – oligodynamicznie. Antybiotyki są produktami wtórnego metabolizmu drobnoustrojów. Można przypuszczać że powstały w wyniku przypadkowych mutacji genetycznych. Zakodowane są głównie w plazmidach. Wytwarzanie antybiotyku jest cechą szczepową.

Promieniowce produkujące antybiotyki:

Streptomyces grisens – streptomycyna

Streptomyces erythreus – erytromycyna

Streptomyces venezuelae – chloramfenikol

Streptomyces aureofaciens – tetracyklina

Streptomyces noursei – nystatyna

MORFOLOGIA GRZYBÓW

Systematyka grzybów wg Gaϋmana:

Typ: Fungi

1. Klasa: Archimycetes – pragrzyby (grzyby o plechach okresowo lub stale nagich, np. rak ziemniaczany).

2. Klasa: Phycomycetes – pleśniaki, glonowce (grzybnia o strzępkach jednokomórkowych, przeważnie niepodzielna przegrodami poprzecznymi, zarodnie z zarodnikami).

3. Klasa: Ascomycetes – workowce (zarodnia w postaci worka – ascus, z zarodnikami – ascosporami – zwykle po 8 w worku; w workach zachodzi proces koniugacji).

4. Klasa: Basidiomycetes – podstawczaki.

5. Klasa: Denteromycetes – grzyby niedoskonałe (wielokomórkowe, nie są znane stadia płciowe, rozmnażają się przez konidia).

SYSTEMATYKA DROŻDŻY

TYP: Fungi
KLASA: Ascomycetes (workowce)
RODZINA: Saccharomyces
RODZAJ: Saccharomyces cerevisiae (drożdże piekarnicze) Saccharomyces elipsoideus (drożdże winne) Saccharomyces carlsbergensis/uvarum (drożdże piwne)

TEST NA ŻYWOTNOŚĆ DROŻDŻY

błękit metylenowy

+ komórki martwe komórki żywe

zawiesina drożdży ciemnoniebieskie bezbarwne

Preparaty przyżyciowe, szkiełko nakrywkowe, kondensor poodsuwany, preparat ustawiamy pod średnim powiększeniem mikroskopu (40-krotnym).

TEST NA ODŻYWIANIE DROŻDŻY (WYKRYWANIE GLIKOGENU)

płyn Lugola

+ ziarna glikogenu

zawiesina drożdży ceglastopomarańczowy kolor

KLASA: Phycomycetes
RZĄD: Mucorales
RODZINA: Mucoraceae

Rodzaj: Mucor

kolumella

sporangium

sporangiospory

sporangiofor

Mucor sp.

Rodzaj: Rhizopus

Rhizopus sp.

stolony

rhizoidy

KLASA: Deuteromycetes
RZĄD: Moniliales
RODZINA: Moniliaceae

Rodzaj: Aspergillus

Aspergillus niger

konidia

sterigmy

konidiofor

Rodzaj: Penicillium

konidia

sterigmy I i II rzędowe

konidiofor

Penicillium sp.

Rodzaj: Oospora

Oospora lactis

Rodzaj: Trichothecium

konidia

Trichothecium sp.

RODZINA: Dematiaceae

Rodzaj: Cladosporium

konidia

Cladosporium sp.

Rodzaj: Alternaria

konidia

Alternaria sp.

RODZINA: Tuberculariaceae

Rodzaj: Fusarium

chlamydospory

makrokonidia

mikrokonidia

Fusarium sp.

MIKOTOKSYNY są to substancje biologicznie czynne, produkowane przez grzyby toksynotwórcze z klasy Deuteromycetes. Działają one totalnie na mikro – i makroorganizmy. Działanie ich może być mutagenne, teratogenne, kokarcinogenne i fitotoksyczne.

GRZYBY TOKSYNOTWÓRCZE:

1. Aspergillus flavus - aflatoksyny

2. Aspergillus fumigatus - ochratoksyny

3. Aspergillus ochraceus - ochratoksyny

4. Aspergillus terreus – kwas terreikowy

5. Aspergillus versicolor - sterygmatocystyna

6. Penicillium citrinum - cytrynina

7. Penicillim rugulosum - rugulozyna

8. Alternaria alternata - alterotoksyna

9. Alternaria longipes - alternariol

10. Fusarium graminearum - zearalenon

11. Trichothecium roseum - trichotecyna

BAKTERIE FERMENTACJI MLEKOWEJ cz. I

Fermentacja – proces beztlenowy w którym energia wyzwalana jest w wyniku przenoszenia elektronów w reakcjach oksydoredukcyjnych a ostatecznymi akceptorami wodorów są różne związki organiczne np. fermentacja alkoholowa, mlekowa, masłowa, propionowa i inne.

Bakterie mlekowe wywołują właściwą fermentację mlekową polegającą na przekształceniu cukrów zwłaszcza prostych (głównie heksozy) w kwas mlekowy. Należą do rodziny Lactobacillaceae.

Cechy rodziny Lactobacillaceae (bakterie mlekowe):

1. Gramdodatnie laseczki

2. Nie wytwarzają przetrwalników!

3. Są nieorzęsione (brak zdolności ruchu)

4. Względne beztlenowce

5. Z cukrów wytwarzają prawie wyłącznie kwas mlekowy

6. Nie wytwarzają katalazy

7. Nie redukują azotanów

8. W podłożu wymagają adeniny, tyminy i hipoksantyny

9. Nie rozkładają białka

10. Giną w temp. 65-75⁰C w ciągu 15 minut

11. Nie fermentują sacharozy, mannitolu i gliceryny (cukry złożone)

12. Fermentują heksozy (cukry proste)

WYKORZYSTANIE BAKTERII MLEKOWYCH:

1. Przemysł mleczarski:

- ukwaszanie śmietanki spożywczej

- dojrzewanie serów podpuszczkowych

- ukwaszanie mleka przeznaczonego do produkcji serów twarogowych

- produkcja mlecznych napojów fermentowanych

1. Przemysł warzywny: kiszenie ogórków, kapusty i innych produktów.

2. Przemysł mięsny: „dojrzewanie” surowych wędlin: metka, salami.

3. Przemysł piekarniczy: produkcja zakwasów chlebowych.

4. Przemysł paszowy: produkcja kiszonek.

MIKROFLORA FERMENTOWANYCH PRODUKTÓW MLECZARSKICH

1. KWAŚNE MLEKO:

Lactococcus lactis subsp. lactis

Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris

Lactococcus lactis subsp. cremoris

Lactococcus lactis subsp. diacetilactis

Leuconostoc

Lactococcus

1. JOGURT:

Lactobacillus delbrϋcki subsp. bulgaricus

Strepococcus salivarius subsp. thermophilus

Lactobacillus

Streptococcus
Bifidobacterium

1. KEFIR:

Candida kefir

Leuconostoc sp.

Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus kefir

Lactobacillus lactis

Lactobacillus kefiranofaciens

Lactococcus sp.

Barwienie preparatów z mleka i przetworów mlecznych:
Barwienie proste pozytywne: błękit metylenowy według Löfflera (roztwór wodny błękitu + KOH) – czas barwienia 10-15 minut.
Zjawisko metachromacji:

Polega na wybarwieniu z różną intensywnością, a nawet w odmiennych kolorach. Spowodowane jest asocjacją cząsteczek barwnika na różnych substancjach barwionych.

BAKTERIE FERMENTACJI MLEKOWEJ CZ. II

Kiszenie pasz i warzyw sprzyja:

1. Rozdrobnieniu materiału

2. Stworzeniu warunków beztlenowych

3. Zaopatrzeniu bakterii mlekowych w składniki pokarmowe – zapewnienie tzw. minimum cukrowego - odpowiednia ilość cukru umożliwiająca wytworzenie kwasu mlekowego w ilości pozwalającej na obniżenie pH zakiszonego materiału do wartości 4,2.

MIKROFLORA FERMENTOWANYCH PRODUKTÓW POCHODZENIA ROŚLINNEGO

Lactobacillus plantarum
Lactococcus lactis
Lactobacillus acidophilus

Pediococcus acidilactici

Lactobacillus brevis

Enterococcus faecium
Lactobacillus lactis

Lactobacillus bulgaricus

Lactococcus plantarum

SZKODNIKI FERMENTACJI MLEKOWEJ

Szkodniki zakiszonych produktów pochodzenia roślinnego

GRUPY DROBNOUSTROJÓW	WŁAŚCIWOŚCI BIOCHEMICZNE	SPOSÓB OCHRONY
BAKTERIE GNILNE	Tlenowy i beztlenowy rozkład białek	szybkie obniżenie pH – przez zapewnienie minimum cukrowego
BAKTERIE MASŁOWE	Fermentacja masłowa	szybkie obniżenie pH – przez zapewnienie minimum cukrowego
BAKTERIE CELULOLITYCZNE i PEKTYNOLITYCZNE	Redukcja celulozy i pektyn powodują mazistości kiszonek	szybkie obniżenie pH – przez zapewnienie minimum cukrowego
BAKTERIE RZEKOMEJ FERMENTACJI MLEKOWEJ	Wytwarzanie indolu i acetony (wskaźnik złego stanu sanitarnego)	Ochrona przed zanieczyszczeniem glebą i nawozem
GRZYBY	Rozkład kwasów i mineralizacja masy roślinnej, wytwarzanie substancji toksycznych - mikotoksyn	Zachowanie warunków beztlenowych

BAKTERIE FERMENTACJI MASŁOWEJ

FERMENTACJA MASŁOWA - jest typowym procesem beztlenowym, w wyniku którego przy rozkładzie węglowodanów powstaje kwas masłowy.

Jest to heterofermentacja, ponieważ oprócz kwasu masłowego i CO₂ produkowane są także:

• Kwas octowy

• Butanol

• Aceton

• Metan

• Propan

BAKTERIE MASŁOWE NALEŻĄ DO JEDNEGO RODZAJU – Clostridium, np.:

• Clostridium acetobutylicum

• Clostridium butyricum

• Clostridium falsineum

• Clostridium pasteurianum

CECHY BAKTERII NALEŻĄCYCH DO RODZAJU Clostridium:

- gramdodatnie laseczki

- beztlenowe

- przetrwalnikują

- heterotrofy

- mezofilne

DZIAŁANIE NIEPOŻĄDANE:

• Naruszenie struktury tkankowej roślin oraz rozkład ściany komórkowej, co powoduje tzw. mazistość kiszonek

• Późne wzdęcie serów

• Psucie konserw warzywnych i owocowych

• Bombaż konserw

ZASTOSOWANIE BAKTERII MASŁOWYCH

Roszarnictwo lnu, konopi i innych roślin zawierających włókna łykowe (rozkładają pektyny, rozluźniają strukturę tkankową i pozwalają na szybkie oddzielenie włókien celulozowych).

BARWIENIE PRZETRWALNIKÓW METODĄ SCHAEFFERA-FULTONA:

Barwienie złożone pozytywne

Na wysuszony i utrwalony preparat działamy:

1. Zielenią malachitową w 5% wodnym roztworze, podgrzewając do „trzeciej pary”.

2. Po ostudzeniu preparat spłukujemy wodą.

3. Preparat podbarwiamy safraniną przez 1 minutę.

4. Preparat spłukujemy wodą, suszymy i oglądamy pod imersją.

WYNIK BARWIENIA:

- przetrwalniki wybarwiają się na kolor zielony,

- komórki wegetatywne wybarwiają się na kolor czerwony.

ANALIZA MIKROBIOLOGICZNA WODY W ASPEKCIE SANITARNO-HIGIENICZNYM

ANALIZA MIKROBIOLOGICZNA:

ANALIZA ILOŚCIOWA ANALIZA JAKOŚCIOWA

- określa się ilość drobnoustrojów w 1g, 1 cm³, 1 m³ - identyfikacja (diagnostyka) drobnoustrojów

METODY ILOŚCIOWEJ ANALIZY MIKROBIOLOGICZNEJ:

1. METODY BEZPOŚREDNIE:

1. Liczenie drobnoustrojów w komorach (np. w komorze Thoma).

2. Liczenie drobnoustrojów na preparatach barwionych

- Prescotta-Breeda
- Burriego

- rozmaz na powierzchni 1 cm²

1. Liczenie na filtrze membranowym

1. METODY POŚREDNIE:

1. Metoda optyczna (nefelometria)

2. Metoda enzymatyczna (np. próba reduktazowa)

3. Metoda płytkowa rozcieńczeń Kocha

4. Metoda filtracyjna (filtrów membranowych) – filtr z drobnoustrojami odbity na pożywce

5. Metoda wskaźnikowa

ASPEKT SANITARNY – występowanie drobnoustrojów chorobotwórczych.

ASPEKT HIGIENICZNY – zanieczyszczenie wody odchodami.

CEL: określenie ogólnej liczby drobnoustrojów w jednostce objętościowej wody oraz określenie tzw. wskaźników sanitarnych.

MIKROFLORA WÓD:

1. DROBNOUSTROJE AUTOCHTONICZNE – głównie bakterie autotroficzne (foto- i chemoautotrofy), a także saprofity, np.: bakterie – Pseudomonas, Achromobacter; grzyby – Mucor, Leptomitus, Saprolegnia.

2. DROBNOUSTROJE ALLOCHTONICZNE – saprofity i pasożyty naniesione z: gleby i powietrza, ścieków, przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt.

SCHEMAT ROZCIEŃCZEŃ – ANALIZA WODY

PODŁOŻE	ROZCIEŃCZENIE	Średnia ilość jtk lub miano
	N	10
Bulion z laktozą i purpurą bromokrezolową	+	+
MPA	+	+
Żelatyna	+	+
Brzeczka	+	+

ODCZYT MIKROBIOLOGICZNEJ ANALIZY WODY.

WSKAŹNIKI ZANIECZYSZCZENIA WÓD:

1. Bakterie grupy coli

- gramujemne pałeczki

- nie wytwarzają przetrwalników

- względnie beztlenowe

- fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 24-48h w temp. 35-37⁰C

Należą do rodzaju: Escherichia, Citrobacter i Enterobacter w obrębie rodziny Enterobacteriaceae.

1. Bakterie grupy coli TYPU KAŁOWEGO

- gramujemne pałeczki

- nie wytwarzają przetrwalników

- względnie beztlenowe

- fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 24-48h w temp. 44⁰C

- przeprowadzają charakterystyczne procesy biochemiczne

Większość tych bakterii występujących w wodach i ściekach to Escherichia coli.

1. ESCHERICHIA COLI – pałeczka okrężnicy, wykazuje właściwości typowe dla bakterii grupy coli typu kałowego.

Żyje w okrężnicy jelita grubego. Wykorzystuje resztki pokarmowe, syntetyzuje witaminy z grupy B i K, wpływa antagonistyczne na inne drobnoustroje. W pewnych warunkach może przejawiać właściwości chorobotwórcze – bakterie warunkowo chorobotwórcze.

METODY BADAŃ

1. Badania wstępne – przeprowadza się je metodą fermentacyjną probówkową (FP).

Polegają one na wprowadzeniu odpowiedniej ilości badanego materiału na podłoże płynne z laktozą i purpurą bromokrezolową i inkubacji w temperaturze 37⁰C przez 48h. Bakterie grupy coli fermentują laktozę z wydzieleniem kwasu i gazu. W celu wykluczenia wyników fałszywych dodatnich które dają niektóre bakterie gramdodatnie z rodzaju Bacillus i gramujemne z rodzaju Aeromonas należy przeprowadzić badania potwierdzające.

1. Badania potwierdzające
   - metoda fermentacyjna probówkowa (LPB)

Należy je wykonać w celu potwierdzenia obecności bakterii grupy coli z wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego, uzyskanych po 24 lub 48h. Mają na celu wykluczenie tzw. wyników dodatnich fałszywych.

1. Metoda rozsiewu powierzchniowego.

Należy je przeprowadzić z 24 lub 48h hodowli na podłożu LPB. Za pomocą wyjałowionej ezy, niewielką ilość materiału rozprowadza się na podłożu Endo. Inkubację należy prowadzić w temperaturze 37⁰C przez 24h. Escherichia coli rośnie na agarze Endo w postaci gładkich, czerwonych kolonii z charakterystycznym metalicznym połyskiem.

RODZINA ENTEROBACTERIACEAE

Obejmuje 14 rodzajów. Są to bakterie chorobotwórcze, warunkowo chorobotwórcze (np. Escherichia coli) i saprofity (głównie glebowe).

Gramujemne pałeczki, nie przetrwalnikują, względnie beztlenowe.

Chorobotwórcze:

Salmonella, Shigella, Proteus, Klebsiella.

Bakterie grupy coli:

Fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temp. 35-37⁰C w przeciągu 48h. Charakterystycznie rosną na agarze Endo – czerwone kolonie z metalicznym połyskiem.

Typ kałowy:

Escherichia coli

Typ kałowy i ziemny:

Citrobacter i Enterobacter (w zależności od gatunku)

ODCZYT MIKROBIOLOGICZNEJ ANALIZY WODY

1. Określenie miana drobnoustrojów – miano jest to najmniejsza ilość (objętość) badanego produktu (najwyższe rozcieńczenie), w której stwierdza się jeszcze obecność badanych mikroorganizmów.

MIANO coli – jest to najmniejsza objętość badanej wody lub ścieków, wyrażona w cm³, w której stwierdza się obecność bakterii grupy coli.

1. Oznaczanie ogólnej liczby jednostek tworzących kolonie (jtk) mikroorganizmów w 1 cm³ wody.

$$L = \ \frac{\sum_{i = 1}^{n}\text{xy}}{n}$$

gdzie:

L – ilość organizmów w 1g lub 1 cm³ wody

x – średnia liczebność kolonii w danym rozcieńczeniu

y – rozcieńczenie

n – ilość odczytów