Ćw. 1

02.10.2012

POBIERANIE I PRZESYŁANIE PRÓB DO BADANIA:

Zarazek musi przeżyć do momentu badania (!) :

Pobieranie:

• Przed leczeniem

• W początkowym okresie choroby

• Bez środków dezynfekujących (chyba, że wkłucia)

• Sterylne narzędzia i pojemniki

• Stado – od większej ilości sztuk (kilku wybranych)

• Odpowiedni dobór materiału (objawy, zmiany patomorfologiczne)

• Pośmiertnie – jak najszybciej (komensale)

Przesyłanie:

• Chronić przed wysychaniem (wymazy)

• Temperatura do 4 ^oC (lód, termos)

• Czytelne oznakowanie

• Pismo przewodnie

• Podłoże transportowe, transportowo-wzrostowe np. haemomedium (krew), uromedium (mocz), anareomedium (bakterie beztlenowe)

• Czas: do 2 dni (bakterie beztlenowe jeśli nie w podłożu, szybciej)

Pismo przewodnie, stałe elementy:

• Właściciel

• Gatunek

• Ilość zwierząt (1 / stado)

• Skąd pobierany

• Objawy kliniczne

• Zmiany patomorfologiczne

• Leczenie (czym) / brak

• Rozpoznanie

• W jakim kierunku ma być zbadana próba (potwierdzenie, odrzucenie)

• Dane wysyłającego (pieczątka, podpis)

Podłoża transportowe do 5 dni
Podłoża transportowo-wzrostowe dodatkowo namnażają
Anaeromedium – jak najszybszy transport

Przesyłanie:

• Bez zbędnej zwłoki

• Ukierunkowana diagnostyka (ułatwia, skraca czas)

• Godziny przyjęć

• Dni określonych badań (badania drogie np. PCR, rzadko wykonywane)

Sterylizacja:

• Postępowanie aseptyczne

• Sterylizacja (jałowienie)

• Dezynfekcja (odkażanie)

Metody sterylizacji:

• Fizyczna – czynniki fizyczne
  a) termiczna – wysoka temperatura
  b) promieniowanie
  c) ultradźwięki

• Chemiczna – środki chemiczne

• Mechaniczna – z użyciem filtrów, sączków

Postępowanie aseptyczne – praca czysta, unikanie zakażenia siebie, środowiska, materiału

Sterylizacja (jałowienie) – niszczenie wszystkich drobnoustrojów we środowisku (formy nieaktywne, przetrwalniki)
- silnie działające metody

Dezynfekcja – niszczenie bakterii chorobotwórczych w środowisku (formy wegetatywne)

Ad.1 a) Sterylizacja fizyczna – termiczna
do materiałów termostabilnych (ni63+6+3

+9ewrażliwych na temperaturę >100^oC)

• Opalanie w płomieniu + alkohol 96% x 3
  drobny sprzęt np. ezy, nożyczki, wloty probówek, korki, dawniej klatki metalowe, pęsety,

• Mokra (gotowanie, para nasycona pod ciśnieniem)
  - gotowanie w wodzie (sterylizator) 100^oC, 15-20 minut od zagotowania (przetrwalniki przeżywają)
  drobne przedmioty
  - gorąca para bieżąca (aparat Kocha) – 20-30 minut od wypełnienia parą
  pożywki dla bakterii
  tyndalizacja – 3x co 24h
  - para nasycona pod ciśnieniem (autoklaw)
  autoklaw „czysty”: 1 atmosfera, 121-6 ^oC, 20-30 minut (do 1h)
  autoklaw „brudny” : 2,5 atmosfery, 134-138^oC, 20-30 minut
  w produkcji żywności 115^oC – autoklaw przemysłowy

• Sucha
  -suche, gorące powietrze (suszarka)
  szkło laboratoryjne bez gumy
  160^oC – 2h, 180oC – 1h
  luźno ułożone, wloty zabezpieczone, nie można przesadzić z temperaturą

Autoklaw „czysty”
- ciśnienie zwiększone o 1 atmosferę
- pożywki dla bakterii, szkło z elementami gumowymi, plastiki, sprzęty metalowe, fartuchy

Autoklaw „brudny”
- ciśnienie zwię kszone o 2,5 atmosfery
- materiał zakażony

Ad. 1 b,c sterylizacja fizyczna: promieniowanie i ultradźwięki

Promieniowanie – niszczy kwasy nukleinowe bakterii,
powierzchnie, pomieszczenia

• UV – lampy rtęciowo-kwarcowe, mała przenikliwość

• ɣ - przenikliwe – warunki przemysłowe, do sterylizacji dużej ilości sprzętu termowrażliwego

Ultradźwięki 20-100 kHz – w sposób mechaniczny niszczą komórki drobnoustrojów
delikatne sprzęty
rzadko

W produkcji żywności dodatkowo:

• Pasteryzacja (pasteryzator):
  - zmienia walory smakowe
  - niska 65-75 oC, 30 minut
  - wysoka 85-100 oC, 30 minut

• UHT – ultra high temperaturę
  - 135-150 oC, 1-2s (cały proces 4-5s)

• Liofilizacja – suszenie sublimacyjne
  - do substratów termolabilnych
  - metoda konserwacji
  - zamrożony produkt odparowuje się w wysokiej próżni
  - w medycynie: produkcja szczepionek, bakterii
  - żywność dla kosmonautów

Ad. 2 Sterylizacja chemiczna:

• Kwasy, zasady, alkohole (70 %)

• Związki chlorowe, jod, fenol, krezol, formaldehyd,

• Związki utleniające np. H₂O₂

• Mydła, detergenty, roztwory barwników

• Tlenek etylenu, kwas nadoctowy – skomplikowana aparatura np. sztuczna nerka

Ad.3 sterylizacja mechaniczna – filtracja (ciecze, gazy)

• Dawniej filtry szklane, porcelanowe, azbestowe

• Obecnie filtry membranowo-celulozowe, poru 0,22 µm

• Przy przepuszczaniu ciśnienie dodatnie lub ujemne

• Sito molekularne:
  - ciecze: płyny wrażliwe na temperaturę (enzymy, surowica, hormony)
  - gazy: dekontaminacja powietrzem, komory laminarne, cieplarka do hodowli drobnoustrojów (jałowienie CO₂)
  - dodatnie lub ujemne ciśnienie

Ćw. 2

09.10.2012

Tok postępowania rozpoznawczego:

Rejestracja próby w laboratorium
Badanie bez zbędnej zwłoki (beztlenowce)

• Badanie mikroskopowe ( morfologia, bezpieczeństwo)

• Izolacja (badanie hodowlane + namnożenie)

• Identyfikacja
  a) biochemiczna – skład enzymów wielu bakterii różni się
  b) serologiczna – swoiste surowice diagnostyczne
  c) lizotypia – dochodzenie epidemiologiczne, b. szczegółowe za pomocą bakteriofagów

• (nie zawsze) Próba (badanie) biologiczne – na zwierzętach (badanie zjadliwości)

• Antybiogram – określenie wrażliwości na leki
  

• Badanie serologiczne – uzupełnienie toku
  - szukanie odpowiedzi immunologicznej (przeciwciała w surowicy)

Mikroskopy i mikroskopowanie:

• Mikroskop świetlny
  a) jasne pole
  b) ciemne pole

• Mikroskop kontrastowo-fazowy (najczęściej niebarwione próbki)
  a) kontrast pozytywny (ciemne na jasnym)
  b) kontrast negatywny (jasne na ciemnym)

• Mikroskop fluorescencyjny (luminescencyjny, UV)
  barwa zależna od rodzaju fluorochromu np. FITC – świecenie na zielono

• Mikroskop konfolokalny
  - trójwymiarowa struktura próbki; luminescencja wybarwionych struktur,
  - promień laserowy

Badanie mikroskopowe (morfologiczne) – pierwszy element toku rozpoznawczego
! Nie jest medodą identyfikacji !

Cel:

• Orientacja co do składu mikroflory (mikrobioty)
  - sposób reakcji z barwnikiem (np. metoda Grama)

• Charakterystyczne cechy morfologiczne bakterii
  - sposób ułożenia w preparacie: parami, łańcuszki, grona, tetraty, pakietowce,

• Ukierunkowanie dalszego postępowania laboratoryjnego

Materiał:

• Próbka kliniczna

• Próbka z hodowli na podłożu płynnym

• Próbka z hodowli na podłożu stałym

Preparaty bakterii niebarwionych rzadko.

• Cel:
  - wykazanie właściwości ruchu
  - częściej w mykologii (rozmiar grzyba)

• Metody: preparat mokry, nieutrwalony, niebarwiony, przyżyciowo
  1. Zwykły mikroskop świetlny – metoda kropli wiszącej
  -pole jasne, ciemne na kondesor – kropla wody
  2. Ciemne pole widzenia – dolna immersja wodna
  3. Mikroskop kontrastowo-fazowy

Wykonywanie preparatu barwionego:

• Odtłuszczenie szkiełka (szare mydło + szmatka)

• Zaznaczenie miejsca nanoszenia materiału

• Wykonanie rozmazu (cienki, możliwie na jak największej powierzchni)

• Suszenie preparatu
  - na powietrzu,
  - do uzyskania matowej powierzchni

• Utrwalenie:
  a) fizyczne (termiczne – 3x nad palnikiem)
  b) chemiczne (utrwalacz w zestawie do barwienia)

• Barwienie odpowiednią metodą

• Spłukanie wodą

• Suszenie w bibule

• Oglądanie:
  - olejek immersyjny,
  - obiektyw 100x

Preparat dociskowy – ze środka narządu, nieskażony, rozmaz jak największy

Utrwalenie by:

• Zabić bakterie

• Przytwierdzić do szkiełka

• Ułatwia wnikanie barwnika do komórki i wiązanie się z jej elementami,

Po utrwaleniu preparat barwi się i spłukuje.

Metody barwienia:

• Pozytywne (bakterie), negatywne (tło), kombinowane (bakterie i tło)

• Proste (monochromatyczne, jednolite) i złożone (polichromatyczne)

Barwniki:
roztwory macierzyste (alkoholowe) i wtórne, robocze (wodne).

• Zasadowe (anilinowe)
  błękit metylenu, zieleń malachitowa, safranina, hematooksylina

• Kwaśne
  fuksyna kwaśna, eozyna

Zaprawy / bejce:
ułatwienie wnikania i wiązania

• Dodawane bezpośrednio do barwnika
  (ług sodowy w błękicie Loeflera, fenol w fuksynie)

• Stosowane same, jako jeden z dwóch kroków w metodzie barwienia
  (płyn Lugola w metodzie Grama)

Badanie proste metodą Leofflera:
Po sporządzeniu rozmazu:

• Utrwalenie termiczne (3x palnik)

• Błękit metylenowy Leofflera (5 minut)

Efekt: wszystkie komórki niebieskie (kształt, sposób ułożenia).

Ćw. 3

16.10.2012

Barwienie mikroskopowe cd.

• Barwienie złożone metodą Grama

• Badanie struktur bakteryjnych

• Specjalne metody barwienia

Metoda Grama:

Po utrwaleniu:

• Barwienie pierwszym barwnikiem – fiolet krystaliczny lub gancjana (fioletowy, niebieski)

• Płyn Lugola – bejca

• Odbarwienie preparatu alkoholem (Gram + trwale wiąże barwnik)

• Barwienie następne barwnikiem kontrastowym np. fuksyna (czerwona)

• Podstawowa metoda w bakteriologii

• Różnicuje na G+ i G-

• G+ to te, które przyjęły barwnik (fiolet) trwale

• G- , które pierwszy barwnik wiążą nietrwale – zostaje wypłukany i wiążą drugi

Różnice te są wynikiem:

• Obecności białka zasadowego i rybonukleinianu magnezu w błonie cytoplazmatycznej bakterii G+

• Różnica punktów izoelektrycznych bakterii G+ i G-

• Różnic w budowie i składzie chemicznym ściany komórkowej

Przyłożenie praktyczne – mechanizm działania antybiotyków

G+	G-
Grubsza ściana komórkowa; przede wszystkim peptydoglikan, kwasy tejchojowe (glicerolo-, rybitolotejchojowe)	Cieńsza, dwuwarstwowa budowa, na zewnątrz błona zewnętrzna (fragment ściany kom. G-) Dwuwarstwa fosfolipidowa Białka (śródbłonowe, poryny) Lipopolisacharyd (LPS) – składa się z: lipid A oligosacharydy polisacharyd (antygen somatyczny O) - endotoksyna (antygen somatyczny O) Przestrzeń peryplazmatyczna, cieniutka warstwa peptydoglikanów (mureina) 5-10 % ściany
Większość ziarniaków (poza dwoinką Neissera) Laseczki Maczugowce Prątki	Ziarniaki z rodzaju Neissera Pałeczki (większość) Przecinkowce, Krętki,

Barwienie Grama w modyfikacji Kopeloffa:

Suszymy na powietrzu, nie utrwalamy (utrwalenie chemiczne)

• Płyn A + kilka kropel płynu B (utrwalacz)
  2-3 minuty
  woda

• Płyn Lugola (bejca)
  2 minuty
  woda

• Odbarwienie: aceton + chloroform
  woda

• Fuksyna
  15 s
  woda

Specjalne metody barwienia:

• Wykazanie charakterystycznych struktur w komórkach bakteryjnych
  ama - otoczki,
  - przetrwalniki,
  - rzęski

• Wykazanie charakterystycznych właściwości bakterii
  np. bakterie kwasooporne

Barwienie otoczek metodą kombinowaną Bum-Ginsa:

• Kropla płynnej hodowli + kropla tłuszczu

• Rozmaz za pomocą drugiego szkiełka

• Suszenie na powietrzu

• Utrwalenie nad palnikiem

• Barwienie fuksyną enolową 1-2 minuty

• Spłukanie wodą, suszenie

Otoczka:

• Otoczkę mają tylko niektóre bakterie

• Wszystkie bakterie produkują polimery – jeśli nazbiera się ich wystarczająco dużo tworzą otoczkę

• Nie barwi się

• Polimery:
  - polisacharydy (większość)
  - polipeptydy (nieliczne np. laseczka wąglika)

• Chroni bakterie przed wnikaniem niektórych antybiotyków, działaniem układu immunologicznego

Przetrwalniki:

• Nie wszystkie bakterie je produkują

• Umożliwiają przetrwanie w niekorzystnych warunkach środowiska,

• U bakterii – endospory – zamknięte w komórce bakteryjnej

• Proces wytwarzanie zarodników (sporulacja) – niesymetryczny podział materiału genetycznego

• Budowa:
  - DNA
  - ochronny płaszcz białkowy

• Mogą być szersze lub węższe od komórki

• Ułożenie:
  - terminalne – na końcu kom.
  - subterminalne,
  - centralne,

• Ułożenie, deformowanie komórki – charakterystyczne dla gatunku,

• Uwalniane po śmierci

• Oporne na wysoką temperaturę, promieniowanie X i Y, zmiany pH, wysuszenie

• Germinacja – kiełkowanie przetrwalników

• Bardzo trudno się barwią, wysoka temperatura

Barwienie przetrwalników metodą Schoffera-Fultona:

• Utrwalenie termiczne

• 5% zieleń malachitowa – 60s

• 3x podgrzewamy do ukazania się pary

• Po ostygnięciu spłukujemy wodą

• 0,5% safranina – 30s

• Płukanie, suszenie

Barwienie bakterii kwasoodpornych metodą Ziehl-Nielsena:

• Utrwalenie terminalne

• Fuksyna karbonylowa 3-5 minut

• Podgrzewanie 3x do obłoczka pary

• Spłukać wodą

• Odbarwienie (alkohol etylowy + kwas solny)

• Spłukać wodą

• Błękit metylenowy 10s

• Spłukać

• Charakterystyczna błona komórkowa – kwasy mykolowe i tłuszcze (woski, kwasy tłuszczowe),

• Intensywne podgrzewanie → ropuszczenie wosków

• Nie uda się wypłukać barwnika

Ćw. 4

23.10.2102

Badanie hodowlane:

• Pożywki bakteryjne

• Metody posiewu i hodowli

• Wzrost bakterii na podłożach

Warunki niezbędne dla wzrostu drobnoustrojów:

• Pożywka

• Odpowiednia temperatura
  (termo-, mezo-, psychofile)

• Atmosfera gazowa
  (tlenowce, mikroaerofilne, beztlenowce)

• Wilgotność

Psychofile – niska temperatura, -5 – 20^oC
mesofile – 20-40^oC
termofile – wyższe temperatury

Wilgotność zapewniają cieplarki – są zaopatrzone w płaszcz wodny.
Można zwiększać:
- wstawiając tackę z wodą,
- wodna komora – lignina z wodą, na to płytki i przykryć folią

Mikroaerofilne – atmosfera bogata w CO₂ (5-10 %) – cieplarka z przepływem CO₂ (zazwyczaj z większą wilgotnością).

Beztlenowce – nie wytrzymuję w normalnej temperaturze.

Pożywka bakteryjna:

Cechy:

• Składniki odżywcze (wyciąg mięsny, pepton, inne)

• Odpowiednie pH (zwykle 7,2-7,4)

• Odpowiednie ciśnienie osmotyczne – izotoniczne (0,87 % NaCl)

• Jałowe (autoklaw)

Ad.1 Są cudżowne:
- dla większości bakterii aminokwasy,
- cukier nie zawsze.

Wyciąg mięsny - z chudego mięsa (bez tłuszczu, błon), zmielony, zalany wodą (2x), przetrzymać 24h w chłodni, gotować, przesączyć i uzupełnić wodą do początkowej objętości. Odkazić.
w zasadzie w każdym podłożu.

Pepton – nadtrawione białko; mieszanina wolnych aminokwasów i peptydów
- dla bakterii, które nie mogą strawić białka.

Inne substancje odżywcze.

Ad.2 pH (7,2-7,4)

• Odchylenia

• Zbliżone do obojętnego

• Mierzyć przed zasiedleniem

• Zmiareczkować w razie odchyleń

Ad.3 Ciśnienie osmotyczne:

• Zapobiega skurczaniu / rozkurczaniu komórek

• Ciśnienie osmotyczne fizjologiczne,

Ad.4 Jałowienie:

• Wysterylizować,

• Autoklaw czysty (120^o)

• Wrażliwość na temperaturę w aparcie kocha

Podział podłóż:

• Stan skupienia:
  - płynne – bulion (wyciąg mięsny, 1-2% pepton, 0,5% NaCl), woda peptonowa
  - półpłynne -0,25-0,5 % agaru
  - stałe – agar odżywczy (bulion, 2% agaru), podłoże żelatynowe

• Pochodzenie składników:
  - naturalne,
  - syntetyczne,

• Wymagania mikroorganizmów:
  - zwykłe (proste, ubogie) – bulion (agar odżywczy)
  - wzbogacone ( specjalne) – dla drobnoustrojów o bogatych wymaganiach odżywczych

Ad.1

Bulion
woda peptonowa (woda destylowana, pepton, NaCl)
półpłynne – dodaje się agar (nie jest dodatkiem odżywczym)
stałe=żelatynowe (dla bakterii hodowanych w temperaturze <30^oC, środowisko odżywcze)

Ad.2
naturalne np. bulion, surowica, wyciągi roślinne
syntetyczne – synetyzowane na drodze chemicznej (aminokwasy, witaminy)

Ad.3
wzbogacone – dla wyższych wymagań bakterii. Dodatek:
- cukrów (różne),
- surowicy,
- żółtka,
- wyciągu drożdżowego.
najczęściej agar z dodatkiem krwi

Ad.4 Przeznaczenie:

• Wzrostowe – do namnażania bakterii np. bulion, agar, TSA (tryptozowosojowy).

• Wybiórcze – do izolacji określonego gatunku drobnoustrojów (materiał zanieczyszczony postronną florą bakteryjną)
  np. dla salmonelli żółć, gronkowiec NaCl (nawet 10%),

• Różnicujące – dla wykrycia właściwości biochemicznych i fizjologicznych hodowanych drobnoustrojów (różne bakterie w różny sposób)

• Chromogenne (j.w.) – substraty (barwniki) chromogenne.

• Wybiórczo różnicujące

• Transportowe

• Transportowo-wzrostowe

• Specjalne
  - Lowenstein-Jensenn tylko prątek gruźlicy
  - Loeffer – tylko maczugowiec błonicy
  do namnażania tylko jednego rodzaju drobnoustroju – wysoce selektywne

Posiew drobnoustrojów:

Cel:

• Izolacja zarazka – wyosobnienie zarazka z badanego materiału i uzyskanie czystej hodowli

• Namnażanie drobnoustroju:
  a) do dalszych badań
  b) sporządzenie szczepionek, antygenów diagnostycznych, czyste kultury bakterii do przemysłu (fermenty)

• Pierwszy krok przy identyfikacji biochemicznej

• --------//------------ wykonywaniu antybiogramu

Ogólne zasady:

• Do posiewu służą jałowe narzędzia, ezy, wymazówki, bagietki, głaszczki

• Podłoże na płytkach Petriego (stałe) lub w probówkach (stałe- skos, słupek; półpłynne; płynne)

• Przygotowanie podłóż:
  a) płytki podsuszyć (20 minut w cieplarce)
  b) opisać – po stronie agaru na szalkach
  c) unikać kontaminacji

Posiew sektorowy (redukcyjny, izolacyjny, do pojedynczych kolonii)
do izolacji drobnoustrojów

Kolonia – skupisko (lokalnie ograniczone, widoczne gołym okiem) drobnoustrojów potomnych powstałych w wyniku podziału jednej komórki bakteryjnej.

Posiew na podłoża w probówkach (płynne, skos, słupek)
(tylko na szalkach Petriego można uzyskać pojedyncze kolonie)

Przesiewy z podłóż płynnych na stałe lub odwrotnie

Inkubacja w odpowiednich warunkach (wieczkiem do dołu)

PŁYNNE	SKOS	SŁUPEK
wstrząsnąć	wężykiem	posiew wkłuty

Metody hodowli beztlenowych:

• Metody fizyczne:
  a) anaerostat – uniwersalny do hodowli tlenowych i beztlenowych
  b) podłoże Wrzoska, Robertsona – bulion, kawałek wątroby (zmniejszenie potencjału redox, Robertson serce), zalane olejem parafinowym (chroni przed tlenem)
  c) wysoki słupek agarowy (8-10cm): rozpuszcza się agar i wpuszcza bakterie do ciekłego

• Metody chemiczne:
  hermetyczny pojemnik i substancje chemiczne
  a) wiążące tlen – pirogald
  b) obniżające potencjał oksydoredukcyjny – tioglikolan sodu
  c) generatory atmosfery obojętnej

• Metody kombinowane (fizyczno-chemiczne)
  eksykator uszczelniony

• Metody biologiczne
  płytka Fortnera – na płytce szczelnie zamkniętej beztlenowce i tlenowce

Ćw. 5

30.10.2012

Badanie hodowlane cd.

• Wzrost drobnoustrojów na podłożach;,

• Badanie właściwości biochemicznych bakterii

+Morfologia hodowli płynnej:

Rodzaj wzrostu związany zwykle ze sposobem oddychania bakterii:

• Bezwzględne tlenowce rosną na powierzchni (pierścień, błonka, kożuszek)

• Względne beztlenowce – wzrost dyfuzyjny, jednostajne zmętnienie (większość drobnoustrojów)

• Beztlenowce – osad na dnie, na podłożu Wrzoska piana między bulionem a parafiną

• Mikroaerofilne – w postaci pierścienia w pewnym oddaleniu od pożywki

• Często mieszane typy wzrostu (np. zmętnienie + osad, zmętnienie + kożuszek)

Opis płynnej hodowli:

• Błonka lub kożuszek:
  - charakter,
  - wygląd powierzchni,
  - kolor,
  - skupienie.

• Zmętnienie lub osad:
  - charakter i stopień zmętnienia,
  - charakter osadu,
  - sposób unoszenia osadu po wstrząśnięciu 9np. warkocz, kłaczki)

• Zapach.

Morfologia kolonii:

Morfologia kolonii jest charakterystyczna dla danego rodzaju drobnoustrojów.
Obserwacja przy pomocy lupy lub binokularu, żeby wychwycić charakterystyczne szzcegóły.

Opis kolonii:

• Wielkość: średnica w mm (małe do 1mm, duże >5mm)

• Barwa
  zabarwiona / niezabarwiona, przezroczysta / nie, opalizacja

• Kształt
  okrągły, nieregularny, rozgałęziony, nitkowaty

• Niektóre bakterie mogą nie tworzyć pojedynczych kolonii, lecz zarastać całe podłoże – wzrost rozlany (Proteus), inne tworzą kolonie rozpełzające się po powierzchni (Bacillus)

• Charakter wzrostu
  powierzchowny / głęboki

• Postać wyniosłości:
  wypukła, wyniosła, płaska, soczewkowata, pępkowata

• Powierzchnia:
  lśniąca, matowa, pomarszczona, gładka

• Brzeg
  gładki, falisty, ząbkowany, nitkowaty, regularny/nie,

• Konsystencja
  zwarta, luźna, ziarnista, sucha, śluzowata, ciągliwa

• Zapach
  słodki, mdły, gnilny, siarkowodoru

• Inne cechy:
  hemoliza: α (częściowa, siniak), B(całkowita), ɣ (brak)

• Zmętnienie, stronty, opalizacja, przejaśnienie wokół kolonii, specjalne podłoże

Wzrost bakterii na skosie agarowym:

Przy posiewie agarowym bakterie najczęściej nie tworzą pojedynczych kolonii.

Wzrost bakterii na skosie opisujemy uwzględniając następujące cechy:

• Charakter wzrostu: jednolity (zwarty nalot), perlisty

• Brzeg: gładki, ząbkowany….

• Powierzchnia

• Struktura: gładka, ziarnista, pofałdowana

• Barwa i przezroczystość

• Konsystencja

Wzrost bakterii w posiewie kłutym:

Wysoki słupek agarowy, posiew kłuty:

• Ruchliwość

• Upłynnienie żelatyny (w przypadku bakterii proteolitycznych); charakter upłynnienia wzdłuż nakłucia

• Zależność bakterii od zapotrzebowania na tlen:
  - bezwzględne tlenowce – na powierzchni
  - bezwzględne beztlenowce – na dole
  - względne beztlenowce – na całej powierzchni
  - mikroaeroby – tuż pod powierzchnią

Formy bakterii:

W obrębie jednego gatunku bakterie mogą występować w różnych formach (wiek, zjadliwość, cechy fizjologiczne):

• Forma gładka – S
  - hodowla płynna – zmętnienie
  - kolonie: wypukłe, gładkie, błyszczące, regularny brzeg,

• Forma szorstka – R
  - płynna: osad
  - kolonie: płaskie, brzeg postrzępiony, matowe, pomarszczone powierzchnie

• Forma śluzowa – M
  - bakterie otoczkowe

Wzrost bakterii na podłożach wybiórczo – różnicujących:

• Podłoże endo- (pałeczki jelitowe)
  laktoza + pH

• Podłoże chromogenne (pałeczki jelitowe)
  zmiana koloru ze zwzględu na właściwości

• Chapmann (gronkowiec)
  mannitol (część różnicująca), pH (najczęściej żółte)

• Baird-Parker (gronkowiec)
  - wytworzenie koagulazy,
  - rozkład żółtka – lipaza,
  - rozjaśnienie wokół kolonii,

• Podłoże SS (pałeczki jelitowe)
  - laktoza + pH (malinowa)
  - wytworzenie H₂S (z FeCl₂) – czarny kolor

Identyfikacja biochemiczna drobnoustrojów:

Identyfikacja (rozróżnianie) drobnoustrojów na podstawie składu ich garnituru enzymatycznego

• Bakterie produkują konieczną do życia energię w procesie oddychania (tlenowo, beztlenowo, fermentacja).

• Istnieją różnice między poszczególnymi grupami systematycznymi bakterii w przemianie pewnych związków.

• Te różnice wynikają ze zdolności lub jej braku do wytwarzania określonych enzymów.

• Np. bakterie tlenowe wytwarzające H₂O₂ mają katalazę do jej rozkładu.

• Aby przeprowadzić różnicowanie biochemiczne bakterii konieczny jest posiew bakterii na podłożu różnicującym (rząd biochemiczny).

Przeprowadzenie:

• Metody klasyczne – rząd biochemiczny

• Metody nowoczesne – API, Enerotube, systemy komputerowe

Pośrednie kryteria chorobotwórczości:

Istnieje korelacja między chorobotwórczością a niekórymi cechami bakterii:

• Morfologiczne
  otoczka ochronna, fimbrie (adhezja)

• Hodowlane
  forma bakterii – zwykle S (wyjątek wąglik – R)
  wytwarzanie pigmentów (żółty kolor – gronkowiec)
  melanina i kryptokoków (chroni przed kom. Żernymi; grzyby)

• Biochemiczne
  koagulaza
  hemolizyny
  hialuronidaza
  kolagenaza
  fibrynolizyny

• Antygenowe
  np. streptolizyny

Opis kolonii:

• Wielkość: duża 10mm\

• Barwa: zabarwiona – kremowa

• Kształt: nieregularny

• Charakter wzrostu: powierzchniowy

• Powierzchnia: matowa, pomarszczona

• Postać wyniosłości: wypukla

• Brzeg: nieregularny, falisty

Ćw. 6

06.11.2012

Różnicowanie biochemiczne drobnoustrojów:

• Rząd biochemiczny

• System API i enterotube

Metody klasyczne – rząd biochemiczny

Przeprowadzanie identyfikacji biochemicznej:

• Po izolacji drobnoustroju interesują nas kolonie zawiesza się w płynie i posiewa (przesiewa) na rząd biochemiczny

• Rząd biochemiczny – szereg podłóż syntetycznych o znanym składzie (różnicujące)

• Na podłożach tych oceniamy (bezpośrednio / pośrednio),
  - zdolność rozkładu substratów dodanych do podłoża (ocena pośrednia),
  - zapotrzebowanie wzrostowe drobnoustrojów,
  - obecność pewnych enzymów u bakterii (bezpośrednia),

• Po 18-24 h inkubacji uzyskane wyniki porównuje się z zestawieniem właściwości drobnoustrojów i dokonuje ich identyfikacji

Zmiany podłóż świadczące o posiadaniu przez bakterie pewnej cechy:

• Zmiana barwy:
  - zmiana pH i barwy wskaźnika (oc. Pośrednia)
  - reakcja związków wytworzonych przez bakterie ze związkami dodanymi do podłoża,

• Zmiana konsystencji podłoża: (oc. bezpośrednia)
  - upłynnienie (żelatyna),
  - ścięcie (plazma, mleko).

• Wytworzenie gazu (końcowy produkt przemiany materii) :
  - pienienie,
  - porozrywanie podłoża,
  - związanie gazu z odczynnikiem dodanym do podłoża i zmiana barwy,
  CO₂ – bąbelki
  H₂S – zmiana barwy (zaczernienie FeS)

Zdolność rozkładu związków – ocena pośrednia

• Cukry (glukoza, laktoza, sacharoza, mannitol, fruktoza)
  a) fermentacja (rozkład beztlenowy) – zakwaszenie, zmiana pH
  b) fermentacja może przebiegać z lub bez wytworzenia CO2
  c) utlenienie cukrów – specjalne próby do odróżnienia fermentacji i utleniania

• Związki azotowe:
  a) rozkład → alkalizacja podłoża, zmiana barwy wskaźnika, możliwość produkcji gazów np. H2S, NH3
  b) podłoże Christensena z mocznikiem
  - obecność ureazy,
  - żółty → purpura
  c) podłoże Falkowa
  - dekarboksylacja lizyny,
  d) woda peptonowa z tryptofanem
  - wytworzenie indolu
  - odczynnik Kowacza bezpośrednio przed odczytem
  e) wytworzenie H₂S w wyniku rozłożenia aminokwasów siarkowych

Podłoże Kligera – 3 enzymy stałe

• Zawiera: glukozę, laktozę, związki azotowe,

• Rozkład tylko glukozy → słupek żółty

• Glukoza + laktoza → całe podłoże żółte

• + związki azotowe → czerwony

• + H2S → czarne

• Dla bakterii beztlenowych zamyka się podłoże warstwą oleju (jak u Wrzoska)

Zdolność do wytwarzania enzymów – ocena bezpośrednia

• Koagulaza – enzym, który ścina plazmę krwi
  - z plazmą krwi królika,
  - na szkiełku/ w probówce

• Katalaza – rozkłada H2O2 u tlenowców
  - próba z wodą utlenioną
  - na szkiełku podstawowym / w naczyniu z bakteriami/ w probówce

• Lipaza
  - podłoże z żółtkiem (mętne),
  - wokół kolonii – rozjaśnienie,

• Proteazy
  - podłoże z zsiadłym mlekiem (przejaśnienie),
  - posiew na mleku (wstępnie – ścięcie kazeiny)

• Hemolizyny – niszczą erytrocyty
  - posiew na agar z krwią
  - typy hemolizy: α, Β, ɣ

Zapotrzebowanie wzrostowe – zdolność wzrostu w obecności pewnych substancji

• Podłoże Simmonsa = cytrynianowo – azotowe (fosforan azotu)
  - jedyne źródła,
  - zielone (-)→ niebieskie (+)

• Podłoże z mewalonianem sodu

Metody nowoczesne:

• Zasada działania i wstępne opracowanie materiału jak w metodach klasycznych,

• Zestaw diagnostyczny w formie mikrotestu – kompletu odpowiednio dobranych testów dla poszczególnych grup drobnoustrojów (rodzin, rodzajów) jednorazowego użytku

• Testy API, Enterotube, systemy komputerowe

• API – specjalny zestaw dla każdej rodziny drobnoustrojów

System API:

• Wprowadzony przez firmę BioMerineux,

• Szereg mikroprobówek zawierających odwodnione substraty (każdy jeden),

• Pipetą wprowadzamy zawiesinę badanych bakterii uwadniając substrat

• Inkubacja w cieplarce 18-24h w komorze dołączonej do paska, zapewniając utrzymanie wilgoci

• Odczyt (przy niektórych testach konieczne dodanie wskaźnika w momencie odczytu)

• Zanotowanie wyniku w postaci kodu numerycznego 1-4

System Enetrotube:

• Opracowany dla pałeczek jelitowych (rodzina Enterotube),

• Jedna półokrągła probówka podzielona na 8 – 12 części wypełnionych różnymi podłożami

• Jednoczesny posiew przez pociągnięcie jednym ruchem przez wszystkie podłoża

• Inkubacja 18-24 h, odczyt

Systemy komputerowe:

• Identyfikacja w oparciu o komputerowe bazy danych z jednoczesną oceną stopnia wiarygodności rozpoznania

• Mikroplate Analyzer BIOSCREEN – automat wykonujący analizę 200 próbek jednocześnie. Wyniki są odczytywane automatycznie i opracowywane przez program komputerowy.

• Autoskan 4 – automatyczny czytnik do mikropłytek pozwala na identyfikację łącznie z określeniem wrażliwości na antybiotyk

• WALK AWAY – model 40 lub 96 (40, 96 mikropłytek)

• BATEC – aparat z ciągłą kontrolą próbek do hodowli i badania lekooporności (do prątków gruźlicy ! )

Ćw. 7

13.11.2012

Identyfikacja serologiczna:

Pojęcia:

• Identyfikacja serologiczna – swoista reakcja między nieznanym antygenem (zarazkiem) i znaną surowicą diagnostyczną (przeciwciałem)

• Swoistość reakcji – wyraża się tym, że dany antygen reaguje swoiście tylko i wyłącznie z tym przeciwciałem, które powstało pod jego wpływem

• Antygen – każda substancja, która:
  1. Jest rozpoznawana przez organizm jako obca,
  2. Pobudza organizm do odpowiedzi immunologicznej,
  3. Reaguje swoiście z jej produktami (przeciwciała, uczulone limfocyty T) in vivo i in vitro

• Przeciwciała – swoiste białka powstające podczas odpowiedzi układu immunologicznego na antygen, reagujące swoiście tylko z tym antygenem, pod wpływem którego powstały

Surowice diagnostyczne vs. Przeciwciała monoklonalne:

Surowice diagnostyczne	Przeciwciała monoklonalne
Klasyczne surowice pozyskiwane ze zwierząt – hiperimmunizacja Hiperimmunizacja – zarażanie zwierząt pod kontrolą z produkcją dużej ilości przeciwciał (wielokrotna stymulacja antygenem) Oprócz pożądanych przeciwciał inne (klasyczna surowica = mieszanina różnych przeciwciał)	Skierowane przeciwko jednemu antygenowi Drogie Zwierzę wytwarza przeciwciała w śledzionie Izolacja komórek odpowiedzialnych za przeciwciała ze śledziony Hybrydoma – prawidłowe komórki łączy się z nowotworowymi – stała produkcja przecieciał

Zasada:

• Mieszamy nieznany, badany antygen (zarazek) kolejno z różnymi surowicami diagnostycznymi i obserwujemy, z którą z nich występuje określona reakcja dodatnia (aglutynacja, precypitacja, itp.)

• Jej wystąpienie świadczy o identyczności badanego zarazka z tym, który był przyczyną powstania przeciwciał.

• W wyniku reakcji zachodzącej między antygenem a przeciwciałem powstaje kompleks antygen – przeciwciało, którego charakter zależy od postaci antygenu (upostaciowany lub nie, rozpuszczalny).

• Zawsze nastawia się próbę kontrolną (-), czasami dwie (- i +)

Antygen upostaciowany – np. całe komórki bakteryjne; duże antygeny
Antygen upostaciowany = rozpuszczalny – drobniejsze cząstki, np. białka, toksyny bakteryjne

Do identyfikacji serologicznej drobnoustroju wykorzystywane są różne odczyny serologiczne:

• Aglutynacja

• Precypitacja

• Aglutynacja pośrednia (bierna)

• Odczyn wiązania dopełniacza (OWD)

• Odczyn samoneutralizacji (SN) = zobojętniania

• Odczyny z zastosowaniem koniugatów:
  a) immunofluorescencja (IF)
  b) odczyn immunoenzymatyczny (IE, ELISA)
  c) odczyny radioimmunologiczne (RIA)

AD. 1 Aglutynacja (uporządkowanie)

Odczyn aglutynacji (zlepiania) często stosowany w identyfikacji drobnoustrojów (całe komórki)

• Antygen = AGLUTYNOGEN, przeciwciało = AGLUTYNINA,

• W odczynie biorą udział antygeny powierzchniowe bakterii (somatyczne, rzęskowe)

• Odczyn dwufazowy:
  - w I fazie swoiste wiązanie bakterii np. z ciałem
  - w II: w obecności elektrolitów – wypadanie powstającego kompleksu z roztworu (kłaczki, grudki – widoczne gołym okiem)

Odmiany:

• Aglutynacja szkiełkowa – obserwacja gołym okiem (identyfikacja bakterii)

• Mikroaglutynacja – obserwacja mikroskopowa (leptospiry = drobne bakterie)

• Probówkowa – badanie ilościowe (najczęściej w badaniu serologicznym)
  - do poszukiwania przeciwciał,
  - jeden z reagentów rozcieńczony (np. surowica)

Ad. 2 odczyn precypitacji (strącania)

• Antygeny nieupostaciowane (PRECYPITOGENY), przeciwciało (PRECYPITYNA)

• Również odczyn dwufazowy

• Precypitaty powstają w miejscu optymalnych stężeń (równe stężenie antygenu i przeciwciała)

• W przeciwnym wypadku możliwość fałszywie ujemnych wyników:
  - prozona,
  - postzona.

• Czasami konieczność rozcieńczenia badanej próby lub przeciciał,

• Bardzo czuły, umożliwiający wykrycie małych ilości substancji antygenowych,

• In vitro stosowany w diagnostyce wąglika (ekstrakt antygenowy – po gotowaniu ekstrakt z bakterii, wykrywanie toksyn, badanie swoistości gatunkowej białka)
  w medycynie sądowej

• In vivo powstające kompleksy precypitacyjne odgrywają istotną rolę w patogenezie wielu zjawisk alergicznych.

• Odczyn precypitacji można przeprowadzić w środowisku płynnym (probówka) i stałym (żel).

• Precypitację w żelu można wykonać pojedyńczą lub podwójną

precypitacja

płyny stałe


probówka płytka Petriego


pojedyncza podwójna

Precypitacja pierścieniowa środowisko płynne

Np. precypitacja wg. Ascoliego (wąglik) Na gorąco wyekstraktowany antygen Inna chemiczna Pierścień precypitacyjny – opalizuje światło

Immunodyfuzja w żelu

precypitacja prosta

dyfuzja radialna na płytce Petriego

pojedyńcza

podwójna

Ad. 3 aglutynacja pośrednia (bierna)

• Do antygenów nieupostaciowanych,

• Łączy cechy aglutynacji i precypitacji,

• Antygen nieupostaciowany łączy się z przeciwciałem zaobserwowanym na nośniku (bentonit, węgiel)

• Dodatni wynik – aglutynacja nośnika

• Jeśli nośnikiem jest krwinka czerwona odczyn określa się mianem HEMAGLUTYNACJI BIERNEJ (POŚREDNIEJ)

• W bakteriologii lateks, lateks barwiony,
  krwinki w wirusologii

Ad. 5 seroneutralizacja

• Zobojętnianie zjadliwości zarazka przez dodanie przeciwciała,

• Dwie fazy: in vitro i in vivo

• Zobojętnianie, wykonane in vitro sprawdzamy in vivo na zwierzętach doświadczalnych,

• W bakteriologii stosowany najczęściej do wykrywania i identyfikacji toksyn bakteryjnych (na myszach)

próba	próba kontrolna

Bakteriocyny:

• Polipeptydowe substancje antybiotykooporne wytwarzane przez niektóre bakterie

• Działają bakteriobójczo na inne szczepy danego gatunku lub blisko spokrewnione

• Absorbują się na powierzchni komórki docelowej (konieczny receptor)

• Hamują syntezę DNA, RNA lub białek, procesy oddychania, niektóre powodują hydrolizę mureiny

• Najlepiej poznane KOLICYNY (E.coli) – antagonizm w przewodzie pokarmowym

• Wykorzystywane do celów klasyfikacyjnych (typy bakteriocynowe) – typowanie fenotypowe (jak lizotypia)

• Mogą być bezpostaciowe lub mieć kształt podobny do bakteriofagów.

Określanie typu bakteriocyn:

• Na specjalnym podłożu posiewamy w linii średnicy płytki badany szczep

• Po 16h inkubacji inaktywujemy go chloroformem i spłukujemy

• Prostopadle do linii pierwszego posiewu wysiewamy szczepy wskaźnikowe

• Po inkubacji odczytujemy wyniki: dodatni – zahamowanie wzrostu szczepu wskaźnikowego

Ćw. 8

20.11.2012r

Koniugaty – znakowane przeciwciała, znacznik umożliwia wykrycie kompleksów antygen przeciwciało

Identyfikacja serologiczna

Odczyny z zastosowaniem koniugatów:

Rodzaje znaczników:

• Fluorochrom (fluorofor) – odczyn immunofluorescencyjny (IF), odczyt w mikroskopie fluorescencyjnym lub cytometrze przepływowym, najpopularniejszy FITC
  rodomina – czerwony, fluorosceina - zielony

• Enzym – odczyn immunoenzymatyczny (IP, ELISA) odczyt spektrofotometryczny, najpopularniejszy fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa

• Radioizotop – odczyny radioimmunologiczne (RIA), czytnik promieniowania beta lub gamma
  - konieczne gruntowne płukanie prób po każdym etapie dla pominięcia niezwiązanych reagentów,
  - wykrywanie antygenów w tkance, wydzielinach, wydalinach; często w wirusologii i immunologii

Odczyn immunofluorescencji:

Odmiany:

• Bezpośrednia – jednoetapowa
  - przeciwciała znakowane fluorochromem (zwykle FITC) reagują z antygenem w preparacie,
  - FITC pod wpływem UV emitują widzialne światło zielone

• Pośrednia – kanapkowa – 2 etapy:
  - I – nieznakowane swoiste przeciwciało reaguje z antygenem
  - II- dodanie surowicy antyglobulinowej znakowanej fluorochromem

W metodzie bezpośredniej konieczne znakowanie wielu surowic.
w metodzie pośredniej do badania różnych wirusów potrzebna jest tylko 1 surowica znakowana, antyglobulinowa: metoda tańsza, silniejszy odcczyn.

• IF bezpośrednia

• IF pośrednia:
  a)
  
  b)

Bardzo często do wykrywania antygenu w tkankach, identyfikacji wirusów.

Odczyny immunoimmunologiczne:

• Przeciwciała znakowane enzymem,

• Powstający kompleks antygen – przeciwciało wykrywa się dodając substrat dla enzymu (substraty chromogenne – reakcja barwna),

• Test Elisa – ilościowy,

• Rozłożony substrat czasem widoczny gołym okiem, czasem pod mikroskopem ocena jakościowa ( + lub -)

• Możliwy też odczyt spektrofotometryczny – ocena ilościowa

• Immunoperoksydazowy – szkiełkowy
  - przeciwciało znakowane peroksydazą chrzanową,
  - kompleks antygen przeciwciało wykrywana się za pomocą substratu dla enzymu – odczynnik penzydynowy,
  - utlenione złogi substratu widoczne w preparacie w postaci niebieskobrunatnych plam,

• Test ELISA – enzyme linked immunosorbent assay
  - do identyfikacji antygenów nieupostaciowanych (wirus, toksyna, bakterie)
  - jeden z reagentów (przeciwciało w identyfikacji, antygen w badaniach serologicznych) jest trwale zaabsorbowany na nośniku (polistyrenie, polichlorku winylu)
  - w identyfikacji test ELISA typu sandwich, w badaniach serologicznych typu pośredniego,
  - pomiar natężenia reakcji w czytniku spektrofotometrycznym (światło o określonej długości fali),
  - wykreślenie krzywej standardowej,
  - odczyt ilości bakterii z krzywej (test ilościowy),

Odczyny radioimmunologiczne:

• Opracowane w latach 50’ XXw, nagroda Nobla w 1976 r,

• Przeciwciała znakowane radioizotopami – promieniotwórczymi radioizotopami izotopami pierwiastków (jod, wodór, węgiel)

• Odczyt promieniowania w czytniku scyntylacyjnym (detektor promieniowania),

• 1251 – promieniowanie gamma

• 1319, 14c, 3H – promieniowanie beta,

• Obecnie wypierany przez ELISA ze względu na bezpieczeństwo.

Lizotypia – typowanie fagowe

• Typowanie za pomocą fagów (bakteriofagów) – typowanie fenotypowe

• Podstawa – różnice wrażliwości określonych szczepów bakterii na zakażenie różnymi gatunkami bakteriofagów,

• Bakteriofagi – wirusy bakterii, namnażają się tylko we wrażliwych bakteriach, powodując ich rozpuszczenie (lizę)

• Zmniejszenie zmętnienia w hodowli płynnej lub powstanie łysinek na podłożu stałym,

• Wrażliwość bakterii zależy od występowania receptorów na powierzchni kom,

• Fagi o małej swoistości – atakują kilka gatunków bakterii,

• Fagi o wysokiej swoistości – powodują lizę ściśle określonych szczepów,

• Fagi o wysokiej swoistości pozwalają na podział jednolitych pod względem biochemicznym, a nawet serologicznym na gatunki fagowe,

• Zastosowanie w dochodzeniach epidemiologicznych i epizootiologicznym,

Wykonanie badania:

• Czysta hodowla bulionowa bakterii, 4-5h, 4 wg skali McFarlanda (o określonym stopniu gęstości)

• Podłoże stałe Hartleya

• Siatka z dermatografem na dnie płytki (25 pól)

• Posiew bakterii (gazon) – rozlewa się na środku płytki i rozmazuje głaszczka po całej powierzchni, podsuszenie 15-20 minut w cieplarce,

• Do poszczególnych kratek wkraplamy odpowiednio rozcieńczone zestawy bakteriofagów

• Po wyschnięciu inkubacja 37oC 4-6 h

• Przez noc w temperaturze pokojowej

• Efekt: w poszczególnych kratkach różnej wielkości i liczby łysinki w gazonie

• Ocena wyników: stopień lizy, np. gronkowca > 50 łysinek lub całkowita liza (<50 łysinek [-])

• Wszystkie fagi, które dały silną wyznaczają wzór fagowy danego szczepu

Np. 7/47/53/54/75

Badanie biologiczne:

Rodzaj stosowanych zwierząt:

• Zwierzęta doświadczalne określonego gatunku, rasy, odmiany

• Zwierzęta laboratoryjne: myszy, świnki morskie, króliki,

• Zwierzęta unikalnego charakteru:
  - aseptyczne – bakteryjne (germ free) –nie przechodzą przez kanał rodny, utrzymywane w sterylnych warunkach, z nich można pozyskać:
  - gnobiotyczne – zasiedla się aseptyczne bakteriami, które powinny być normalnie w organizmie np. florą jelitową,
  - SPF – wolne od zarazków chorobotwórczych, (specyfic patogen free)
  - transgeniczne – model określonych chorób – ze zmutowanymi genami

Dobór zwierząt do badań:

• Tanie – najlepiej małe laboratoryjne,

• Klinicznie zdrowe, o wyrównanej kondycji i wieku,

• Wrażliwe na dany drobnoustrój,

Cel próby biologicznej:

• Zakażenie rozpoznawcze, diagnostyczne,

• Wykazanie chorobotwórczości i określenie zjadliwości, gdy drobnoustrój warunkowo chorobotwórczy np. pałeczka posocznicy krwotocznej

• Wyklrycie toksyn w badanym materiale, np. botulina, używane myszy

• Izolacja i namnożenie zarazka - bakterie, które trudno i długo hoduje się laboratorium, zwierzęta używane do namnożenia i wyizolowania,

• Oczyszczenie szczepów chorobotwórczych, np. bakterie pobrane ze zwłok razem z flora gnilną,

• Różnicowanie drobnoustrojów pokrewnych,

• Pasaże dla zwierząt lub zmniejszenia zjadliwości szczepów chorobotwórczych np. produkcja szczepionek

Nie jest to metoda identyfikacji!

Wykonywanie próby:

Zalecane humanitarne wykonywanie: pasza, dostęp do wody, spokój, nie stresuje się (wniosek do LKE, opisujemy powód, warunki, oni mogą sprawdzić)

• Znakowanie zwierząt – numery, obrączki, kolczyki, barwne znakowanie,

• Ujarzmianie – w odpowiedni sposób, do zabiegów bolesnych lub stresujących – znieczulenie,

• Drogi zakażenia:
  naskórne – skaryfiracja i wcieranie materiału (goli się skórę i uszkadza igłą)
  śródskórne – cienka, krótka igła, pod odpowiednim kątem
  podskórne – fałd skóry (grzbiet, pachwina)
  domięśniowe – udo
  dożylne – oko, ucho, skrzydło
  dosercowo – gdy trudno dożylnie, narkoza
  dootrzewnowo – z boku linii środkowej brzucha
  domózgowo – narkoza, w miejscu skrzyżowania oka z uchem,
  p.o. – pasza, woda, zgłębnik
  donosowo – narkoza, kropla na nos,;
  dospojówkowo, doodbytnicze – rzadko
  ryby – w imersji – kąpiel wodna z zarazkiem

• Sekcja bakteriologiczna – postępowanie aseptyczne,
  jałowe narzędzia, pojemniki, odzież ochronna, maseczka,
  zwłoki rozpiąć na desce, odkazić (owłosione – oplaić)

• Utylizacja zwłok – spalanie (ściółka też)

• Dezynfekcja pomieszczeń

Próba ilościowa:

• Do oceny zjadliwości (miara chorobotwórczości)

• DLM – dolis letalis minima 100 % - minimalna ilość zabijająca 100 % zwierząt
  mało wiarygodna, nieuwzględnia b. opornych

• LD50 lub ID50 – bardziej wiarygodna,

• Wzrastające rozcieńczenia badanego drobnoustroju

• Każdym rozcieńczeniem zakażamy min. 3 osobniki

Ćw.9

27.11.2012

Antybiogram

- określenie wrażliwości wyizolowanego drobnoustroju na chemioterapeutyki

Cel wykonania:

• Nacelowane leczenie: dobór najskuteczniejszego leku (metody jakościowe)

• Ustalenie optymalnej dawki leku

Metody:

• Dyfuzyjno-krążkowa (jakościowa)

• Ilościowe:
  a) metoda seryjnych rozcieńczeń leków w podłożu stałym
  b) ---------- ---------//----------------------- w podłożu płynnym
  c) e-test (rosnące stężenie leku) pasek nakładany na płytkę z bakteriami
  * w tych metodach określa się MIC – minimalne stężenie hamujące i MBC- minimalne stężenie bakteriobójcze

• Metody półautomatyczne i automatyczne ATB półautomatyczny system, Vitek, Sceptor,

Metoda dyfuzyjno krążkowa:

• Płytka Petriego o określonej średnicy (9-10cm) i określonej grubości podłoża (standaryzacja metody)

• Podłoże Miller-Hintona (lub M-H wzbogacone dla wymagających bakterii)

• Płytkę podsuszamy (uchylona płytka w cieplarce przez 20 minut)

• Na jej środek nanosimy określoną objętość płynnej zawiesiny bakterii o odpowiedniej gęstości w skali McFerlanda (0,5)

• Równomiernie rozprowadzamy zawiesinę (kołyszemy płytką, później rozprowadzamy szklaną bagietką)

• Po 10 minutach nakładamy krążki z antybiotykiem – jałowa pęseta lub dyspenser (dla gronkowców nie nakładamy krążków z penicyliną bo są na niego odporne)
  - odpowiedni dobór (rekomendacja Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. lekooporności drobnoustrojów)
  - krążki min. 2 cm od siebie

• Inkubacja 30 min w temperaturze pokojowej, następnie w cieplarce 16-18h (czasem 24)

• Pomiar stref zahamowania wzrostu ← im większa tym lek bardziej skuteczny

• Odczyt wyniku – wrażliwe, słabo wrażliwe, oporne

• Istotne badanie kontrolne z odpowiednimi szczepami wzrostowymi drobnoustrojów (dla wykluczenia błędów)

Barwniki i fitoncydy:

Zamiast krążków nasączonych antybiotykiem nasączone barwnikami,

Barwniki:

• Działanie bakteriostatyczne, czasem bakteriobójcze (wyższe stężenia)

• Rutynowo stosowane w podłożach wybiórczych np. fiolet krystaliczny hamuje G+, rosną G-

• Do leczenia miejscowego, pędzlowanie zmian skórnych, kompresy, najskuteczniejsze barwniki akrydynowe (rywanol)

Fitoncydy:

• Obecne w soku tkankowym roślin występują substancje lotne (soki eteryczne): cebula, czosnek, chrzan

• Działanie podobne do antybiotyków

• Związki zawarte w czosnku działają najsilniej na: G+, G- a także na niektóre bakterie antybiotykooporne

To był ostatni element badania rozpoznawczego.

Badanie ilościowe:

Nie należy do toku postępowania rozpoznawczego.

Cel:

• Określenie stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego wody i środków spożywczych

• Sporządzanie szczepionek

• Sporządzenie antygenów diagnostycznych

• Przygotowanie zawiesiny bakterii do antybiogramu, lizotypii i innych badań bakteriologicznych

• Czasem znaczenie diagnostyczne (odróżnienie zasiedlenia inwazji w przypadku komensali)

Metody:

2 podziały metod:

• A) zliczanie łącznie bakterii żywych i martwych
  b) zliczanie bakterii żywych

• A) metody bezpośrednie – liczymy poszczególne komórki w wyjściowej zawiesinie
  - preparat barwiony z określonej objętości zawiesiny – liczymy pod mikroskopem (żywe i martwe)
  - w komorze do liczenia krwinek,
  - ----------------//------------------------ z użyciem błękitu trypanu (barwi tylko martwe lub czerwieni obojętnej (barwi tylko żywe) – oddzielnie żywe i martwe
  - cytometr przepływowy
  b) pośrednie – najczęściej
  - metody nefelometryczne
  - metoda płytkowa Kocha (tylko żywe)
  - miano bakterii

Metoda nefelometryczna (McFarlanda):

• Porównujemy zmętnienie danej badanej zawiesiny ze zmętnieniem standardu

• Standard – skala McFerlanda (wzrastające stężenia siarczanu boru)

• Konieczne uwzględnienie wielkości bakterii

• Metoda niedokładna, rzędy wielkości w milionach

• Możliwy też automatyczny pomiar gęstości – densynometr, turbidymetr

Metoda płytkowa Kocha :

• Opiera się na fakcie, że z 1 żywej komórki na podłożu stałym wyrośnie 1 kolonia

• Rozcieńczenie to zawiesiny bakterii w postępie logarytmicznym (10-krotne, wzrastające rozcieńczenia)

• Z każdego rozcieczenia wysiew na 3 płytki (ta sama objętość)

• Inkubacja 18h i liczenie kolonii – wybieramy płytki, gdzie kolonie policzalne (30 – 300)

• Liczymy średnią z 3 płytek, odnosimy do 1ml nierozcieńczonej zawiesiny

V = 0,25ml, rozcieńczenie = 10^-4
40, 35, 30

śr. = 105/3=35

35*4*10⁴=1,4*10⁶ w 1ml zawiesiny

Miano bakterii:

• Miano bakterii = najmniejsza ilość próby (lub najwyższe rozcieńczenie), w którym znajdują się jeszcze bakterie

• Najczęściej miano E. coli – metoda fermentacyjna probówkowa, laktoza i wskaźnik pH

• Niegdyś miano E.coli – wyznacznik czystości mikrobiologicznej wody

• Bardzo niedokładna ocena

• Też robi się wzrastające rozcieńczenie i posiewa do probówek laktozę. Tam gdzie jeszcze są bakterie (fermantacja) podłoże robi się żółte, pozostałe różowe

• Rozcieńczenie 10^-2 miano 10-100

Badanie mikrobiologicznej czystości wody

• Źródłem zanieczyszczeń bakteryjnych wody są zwykle ścieki zawierające odchody ludzi i zwierząt,

• Ponieważ pałeczki jelitowe E.coli są stałym składnikiem mikroflory jelitowej, przyjęło się ich obecność w wodzie za wskaźnik zanieczyszczeń wód,

Dawniej:

• Miano coli i NPL w 100ml badanej wody (wyliczone na podstawie miana)

• Wskaźnik E.coli – metoda filtrów membranowych (liczba bakterii z grupy coli w 100ml badanej wody)

Wskaźnik coli:

• Odpowiednia objętość wody (100 – woda do picia, 10, 1 lub 0,1 – ścieki) sączymy przez filtry membranowe

• Nakładamy filtr, bakteriami do góry, na płytkę z podłożem Endo (laktoza, wskaźnik pH)

• Po 22h inkubacji w 37^oC liczymy kolonię grupy E.coli (ciemnoczerwone zabarwienie i metaliczny połysk)

• Wskaźnik coli – liczba bakterii grupy E.coli w 100 ml badanej wody (liczba typowych kolonii * 100/ ilość sączonej wody w ml)

Obecnie oznacza się (woda pitna, badanie podstawowe)

• FM – filtry membranowe,

• PP – podłoże płynne

• Płytki lane – mieszanie płynu z podłożem

bakterie	metoda	dopuszczalne liczba / objętość wody
E. coli	FM	0 / 100 ml
bakterie z grupy coli	FM	0 / 100 ml
Clostridia redukująca siarczany	płytki lane	0 / 100 ml
ogólna liczba bakterii w 37 oC	FM, PP	20/ 1 ml