Metody
mikroskopowe.
Przygotowanie
preparatów
mikroskopowych.

Prof.dr. hab. inż.Jan
Wasylak

Preparaty mikroskopowe stosowane przez

mineralogów i petrografów można podzielić na
dwie grupy:

1. Preparaty do badań w świetle przechodzącym

przy użyciu mikroskopu polaryzującego tzw.
płytki cienkie,

2. Preparaty do badań w świetle odbitym przy

użyciu mikroskopu kruszcowego tzw. Preparaty
polerowane (zgłady)

Ze względu na sposób wykonywania preparatów
mikroskopowych i zakres ich stosowania można je
podzielić następująco:

ze skał i minerałów

Płytki cienkie

z węgli

ze skał

Preparaty proszkowe

z minerałów

z osadów chemicznych

otrzymywanych w

toku analizy

z rud

Preparaty polerowane

z metali

kawałkowe

z węgli

ziarnowe

ze skał

Preparaty

orientowane

z minerałów

polerowane płytki

cienkie

Preparaty

uniwersalne

polerowane preparaty

proszkowe

Płytki cienkie

Płytki cienkie ze skał i minerałów.
Skały i minerały, z których wykonuje się preparaty
mikroskopowe różnią się twardością, porowatością,
odpornością na wodę i zmianę temperatury.
Najprostsza jest preparatyka minerałów i skał twardych.
Próbki miękkie lub porowate należy odpowiednio
utwardzić. Najczęściej stosuje się do tego balsam
kanadyjski, parafinę, żywice epoksydowe lub szkła
organiczne. W przypadku materiału wrażliwego na wodę
szlifowanie wykonuję się przy użyciu past szlifierskich z
oliwą lub naftą. W przypadku minerałów uwodnionych
należy uważać, by nie przegrzać próbki w czasie
naklejania na szkiełko podstawowe.

Płytki cienkie z węgli.

Do najstarszych metod mikroskopowych
badania węgli zalicza się technikę cienkich
płytek. Obecnie jest ona stosowana głównie w
Wielkiej Brytanii i Stanach Zjednoczonych.
Płytki te mają zazwyczaj grubość 3 – 10 μm i
służą do obserwacji składników
przeświecających w węglach brunatnych i w
słabej uwęglonych węglach kamiennych. Jeżeli
węgle są słabo przejrzyste, należy grubość
płytek zmniejszyć do 0,5 μm. Okruchy węgla,
z których wykonywane są płytki cienie,
impregnuje się parafiną lub balsamem
kanadyjskim.

Preparaty proszkowe

Preparaty proszkowe ze skał.
Wykonuje się je ze skał grubo- średnio- drobno-ziarnistych. Ze skały pobiera

się próbkę według ustalonych norm. Poddaje się ją rozkruszeniu, w taki
sposób aby uzyskany materiał odpowiadał składem mineralnym całej skale.
Uzyskany proszek przesiewa się przez sita o 900,4900 i 10000 oczek/cm .
Otrzymuje się w ten sposób frakcje o wielkości ziaren: I 0,2-0,08mm II 0,08-
0,06mm, III<0,06mm. Następnie wykonuje się preparaty proszkowe z
poszczególnych frakcji przez ostrożne mieszanie igłą stalową proszku na
szkiełku podstawowym z balsamem kanadyjskim. Czynność mieszania należy
wykonywać szybko, aby przed zastygnięciem balsamu można było nakryć
preparat szkiełkiem nakrywkowym.

Odmienny jest sposób wykonywania preparatów ze skał sypkich. Ziarna

skały przykleja się balsamem kanadyjskim do szkiełka nakrywkowego, które
jest osadzone na szkiełku podstawowym. Po zagęszczeniu balsamu ziarna
szlifuje się do określonej grubości, a następnie nakleja powierzchnią
szlifowaną na inne szkiełko podstawowe, poddając szlifowaniu drugą stronę
preparatu.

Preparaty proszkowe z minerałów.

Wykonuje się je przez utwardzenie minerałów ciężkich z
tworzyw sztucznych. Następnie poddaje się je
szlifowaniu i polerowaniu w celu uzyskania idealnie
gładkiej powierzchni. Tworzywa te są przeźroczyste,
twarde, odporne na działanie HCl, benzenu i cieczy
imersyjnych. Dlatego też można przeprowadzić cały tok
badań mikroskopowych w świetle odbitym, a także
trawić i rozpuszczać w kwasach poszczególne minerały.

Preparaty polerowane

Preparaty polerowane z rud.
Uzyskuje się je przez polerowanie rud na tarczach ołowiowo-

antymonowych. Wymagana jest wysoka jakość polerowania.

Preparaty polerowane z metali
Preparaty takie uzyskuje się przez elektropolerowanie metalu.

Preparaty polerowane z węgli
Sporządza się je z uśrednionych próbek bruzdowych. Przy ich

wykonaniu istotny jest wybór właściwej substancji zlepiającej
ziarna oraz odpowiedni sposób kruszenia i pomniejszania próbek
zwłaszcza węgli bogatych w fuzyt. Do sporządzenia preparatów
ziarnowych z węgli stosowany może być szelak w mieszaninie z
balsamem kanadyjskim. Po każdorazowym badaniu preparat
poleruje się.

Preparaty orientowane

Preparaty orientowane ze skał.
Wykonuje się je ze skał o teksturze kierunkowej.

Preparaty orientowane z minerałów.
Wykonuje się je z większych kryształów. Nowoczesne piły
tarczowe są zaopatrzone w uchwyty do próbek z głowicami
pozwalającymi na ustawienie ich i cięcie pod odpowiednim
kątem.

Preparaty uniwersalne

W badaniach petrograficznych rud rzadko stosowane są
polerowane płytki cienie, zwane także preparatami uniwersalnymi.
W przypadku badan minerałów nieprzezroczystych tworzących
skupienia w skałach najczęściej wykonuje się dwa preparaty:
płytkę cienką i preparat polerowany. Gdy są większe skupienia
kruszców przecina się próbkę na pół i z przystających powierzchni
wykonuje się preparaty do światła przechodzącego i odbitego.
Polerowane płytki cienkie wykonywano dwoma sposobami.
Pierwszy polega na szlifowaniu płytki przyklejonej do szkiełka
podstawowego i osiągnięciu właściwej grubości (około 0,02 mm)
przez polerowanie preparatu.
Drugi sposób polega na przygotowaniu w pierwszej fazie
polerowanego zgładu. Preparat taki nakleja się na szkiełko
podstawowe, a następnie w zwykły sposób szlifuje się do właściwej
grubości. Tak wykonywaną cienką płytkę odkleja się od szkiełka
podstawowego i przykleja stroną niepolerowaną na inne szkiełko.

Elektronowy mikroskop transmisyjny

Uproszczony schemat mikroskopu
elektronowego (mikroskop transmisyjnego)
rejestrowane są elektrony przechodzące przez
próbkę.

TEM

Elektronowy mikroskop transmisyjny

( Transmission Electron

Microscope)

Zastosowania:

• analiza mikrostrukturalna
• analiza między powierzchni
• struktura krystaliczna
• powiększenie do 1 000 000 razy – atomowa

zdolność rozdzielcza

• lokalna analiza pierwiastkowa

Próbki:

• grubość do ~0.1 mikrona
• minimalna wielkość~1mm; maksymalna zależnie od
instrumentu
• przygotowanie próbki czasochłonne i skomplikowane

 

Najczęściej stosowana metodą przygotowania

preparatów jest wykonanie repliki (np. platynowej lub
platynowo-węglowej) z powierzchni badanej próbki. Za
pomocą takiej repliki możliwe jest odwzorowanie
topografii powierzchni badanego materiału. Warunkiem
uzyskania dobrej repliki jest całkowite usunięcie próbki
macierzystej (rozpuszczenie w rozpuszczalniku
organicznym, bądź wytrawienie w rozpuszczalniku
nieorganicznym).

    Inną metodą przygotowania próbek w mikroskopii
transmisyjnej jest barwienie negatywowe, stosowane
głównie w przypadku próbek biologicznych lub
sporadycznie chemicznych.
     Oprócz wyżej opisanych metod istnieje tzw. metoda
monowarstwy polegająca na tym, że próbkę zawiesza
się (najczęściej w alkoholu), homogenizuje
ultradźwiękami i następnie umieszcza na siatce
miedzianej uprzednio pokrytej błonką nośną.
Jeśli "ziarno" badanej próbki jest dość drobne,
wówczas stosuje się metodę preparatów proszkowych,
polegającą na tym, że na siatkę miedzianą uprzednio
pokrytą błonką nośną nanosi się cienką warstwę
proszku (preparatu).
     Rejestracji obrazu w mikroskopie dokonuje się na
szklanych płytach fotograficznych formatu 6 x 9 cm, a
następnie powiela na papierze fotograficznym.

SEM

Scanning Electron Microscope

Zdolność rozdzielcza aparatu
ok. 10 nm.
Zakres powiększeń:
od 5 do 100 000 razy.

Obraz uzyskiwany jest w wyniku "bombardowania" próbki wiązką
elektronów, która skupiona jest na przedmiocie w postaci małej
plamki. Wiązka omiata obserwowany obszar linia po linii. Układ
rejestruje elektrony odbite, przechodzące przez próbkę (pokrytą
cienką warstwą złota) lub elektrony wtórne emitowane przez
próbkę w wyniku pobudzenia próbki przez elektrony.
Obraz próbki rekonstruuje się w pamięci komputera.

Przy zastosowaniu mikroskopu skaningowego można

przeprowadzać obserwację powierzchni następujących
preparatów:

o

przewodzących elektrycznie - po uprzednim odtłuszczeniu.

o

nieprzewodzących (izolatory) - wymagają pokrycia cienką
warstwą węgla lub metalu, celem zmniejszenia elektryzowania
się preparatu oraz zwiększenia emisji elektronów wtórnych;
praktycznie wykonuje się to za pomocą próżniowego napylenia
ultracienkiej warstwy złota, platyny bądź innych metali.

o

biologicznych - technika przygotowania preparatów sprowadza
się do utrwalania suszenia w punkcie krytycznym oraz pokrycia
próbki cienką warstwą (10 nm) złota.

     

     

Do niewątpliwych zalet SEM należy to, że wiele próbek można
oglądać bez specjalnego przygotowywania. Grubość próbki,
ważny czynnik stwarzający wiele problemów w transmisyjnej
mikroskopii elektronowej, nie ma praktycznie znaczenia w
mikroskopii SEM.

Metody odwadniania materiałów biomedycznych
 kąpiele w rozpuszczalnikach (alkohol, aceton) ten proces usuwa
również lipidy i inne rozpuszczalne cząstki by temu zapobiec utrwala
się lipidy w aldehydzie i czterotlenkuosmu, co zatrzymuje również
procesy chemiczne zachodzące w żywych układach.
 zamrażanie aby zapobiec krystalizacji proces zamrożenia musi
być nagły (~10000 K/s) i to się przeprowadza w ciekłym azocie lub
helu i taki preparat ogląda się pod mikroskopem na specjalnie
chłodzonym stoliku. Utrwalone i odwodnione próbki biomedyczne
zatopione w specjalnej żywicy epoksydowej lub wosku tnie się na
warstwy o grubości ~nm przy pomocy mikrotomu.

Kontrast poprawiamy nasycając materiał biologiczny w sposób
wybiórczy chemikaliami zawierającymi ciężkie pierwiastki to jest
odpowiednik barwienia w mikroskopii optycznej np. białka, kwasy
nukleinowe łatwo przyswajają sole uranylowe, polisacharydy– żelazo,
kwas garbnikowy podwyższa gęstość elektronową kolagenu lub
elastyny.

PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO MIKROSKOPI

SKANINGOWEJ

WIELKOŚĆ I RODZAJE PRÓBEK

Maksymalne wymiary próbki, którą można umieścić na stoliku
mikroskopu skaningowego są następujące:



Próbka powinna się zmieścić w kole o średnicy 5 cm



Wysokość próbki nie powinna przekraczać 3 cm.

Jednak tylko w wyjątkowych przypadkach badamy tak duże próbki.
Próbka przeznaczona do badania metodami mikroskopii
skaningowej powinna mieć możliwie małą objętość.

Próbki geologiczne można podzielić na dwie podstawowe grupy:

1. Próbki o powierzchni naturalnej, nazywane dalej preparatami

ziarnowymi. Są to niewielkich wymiarów (~ 1mm) kryształy,
ziarna mineralne, szczotki krystaliczne, okruchy skał lub gleby,
mikroskamieniałości, niewielkie ilości luźnego osadu itp.
Obserwujemy je w stanie naturalnym, po umieszczeniu na płytce
aluminiowej, na podłożu przylepnym.

2. Próbki o powierzchni polerowanej – zgłady lub szlify. Mogą to

być niewielkie fragmenty skały, minerału, czy skamieniałości,
które zostały zeszlifowane aż do uzyskania płaskiej powierzchni, a
następnie wypolerowane. Takie preparaty nazywamy zgładami.
Natomiast cienki plasterek wycięty z próbki, umieszczony na
szkiełku mikroskopowym, zeszlifowany do grubości około 0,03
mm i wypolerowany nazywamy szlifem.

WYBÓR SPOSOBU PRZYGOTOWANIA PRÓBKI

Sposób przygotowania próbki zależy przede wszystkim od tego,
jakiego rodzaju badania chcemy wykonać.

1. Obserwowanie wykształcenia powierzchni, morfologii
obiektów: Wybranie reprezentatywnych obiektów. Umieszczenie
badanych obiektów (przy pomocy binokularu) na płytkach
aluminiowych na podłożu przylepnym (preparat ziarnowy).
Napylenie warstwą przewodzącą, jeśli nie ma przeciwwskazań.

2. Obserwacja zmienności składu chemicznego badanego
obiektu (np. budowy strefowej, obecności wrostków). Zalecane
- polerowanie powierzchni (zgład lub szlif). Wskazane polerowanie
powierzchni i napylenie warstwą przewodzącą.

3. Jakościowe analizy EDS: Zalecane - polerowanie powierzchni i
napylenie warstwą przewodzącą (zgład lub szlif) Ewentualnie -
wybranie obiektów o zbliżonej wielkości i możliwie płaskiej
powierzchni oraz umieszczenie ich w odpowiednich odstępach
(porównywalnych z rozmiarem obiektów) na podłożu przylepnym
(preparat ziarnowy) i napylenie warstwą przewodzącą.

Przy przygotowywaniu próbek trzeba jednak brać pod uwagę:

~ Z jakiego rodzaju próbkami i jaką ich ilością mamy do czynienia.

~ Jakiej dokładności wyników oczekujemy w przypadku analiz.

~ Jakimi środkami na przygotowanie próbek dysponujemy.

~ Ile czasu możemy poświęcić na przygotowanie próbek.

~ Czy próbka ma być poddana dalszym badaniom przy pomocy innych

metod instrumentalnych.

PRZYGOTOWANIE PREPARATÓW ZIARNOWYCH

Przeznaczoną do badań próbkę należy poddać obserwacjom

makroskopowym, a następnie pod mikroskopem steroskopowym
(binokularem) w celu wybrania reprezentatywnych dla niej obiektów.
Próbki wilgotne należy wysuszyć w temperaturze pokojowej, lub w
suszarce w temperaturze 30-40 °C. Jeśli w skład próbki wchodzą
obiekty znacznie różniące się rozmiarami, to trzeba je podzielić na
grupy o zbliżonej wielkości lub przesiać przez sita.

Preparaty ziarnowe przygotowujemy na podłożu zapewniającym
odprowadzenie ładunku z próbki, a więc wykonanym z materiału
będącego dobrym przewodnikiem. Najczęściej stosujemy podłoże
wykonane z aluminium. Podłożem tym mogą być:
 Specjalne aluminiowe stoliki z „nóżką”. Nóżka umożliwia
umieszczenie stolika z próbką na stoliku podstawowym mikroskopu, w
specjalnym otworze ze sprężynką dociskającą. Zabezpiecza to próbkę
przed mikroprzesunięciami w trakcie badań. Jest to szczególnie ważne
w przypadku badania próbek przy powiększeniach ≥ 1000 x.
 Płytki aluminiowe, o grubości 1 – 2 mm, okrągłe lub prostokątne.
Ich wielkość nie może przekraczać wielkości stolika podstawowego
mikroskopu.

Próbki przymocowujemy do podłoża przy pomocy przylepnych
krążków węglowych lub taśmy węglowej. Klej pokrywający
dwustronnie krążki i taśmę zawiera domieszkę węgla, aby utworzyć
warstwę przewodzącą, zapewniającą odprowadzenie ładunków
elektrycznych z próbki. Jest to specjalny klej, przystosowany do
użytku w mikroskopie elektronowym. Nie wolno zastępować
krążków i taśmy węglowej dowolnymi przylepcami.

Próbkę należy umieścić na stoliku lub na płytce
aluminiowej na przylepcu węglowym (krążku lub taśmie).

Należy przy tym przestrzegać następujących zasad:



Obiekty powinny tworzyć jedną warstwę, tzn. każdy obiekt musi
mieć kontakt z podłożem przylepnym.



Obiekty maja mieć zbliżoną do siebie wielkość.



Obiekty nie powinny się ze sobą stykać. Najlepiej zachować
odstępy porównywalne z wielkością obiektów.

Przykłady prawidłowego i nieprawidłowego przygotowania
próbek

Na jednej płytce aluminiowej można umieścić kilka próbek. Trzeba
jednak pamiętać o tym, że obiekty w każdej z próbek powinny mieć
podobna wielkość.

Przykłady prawidłowego i nieprawidłowego przygotowania
kilku próbek na jednej płytce

PRZYGOTOWANIE ZGŁADÓW I SZLIFÓW

Przeznaczoną do badań próbkę należy poddać obserwacjom
makroskopowym, a następnie pod mikroskopem
steroskopowym w celu wytypowania fragmentów próbki, z
których będą wykonane zgłady lub szlify (płytki cienkie).
Przygotowanie zgładu umożliwia zbadanie próbki pod
mikroskopem polaryzacyjnym w świetle odbitym przed
obserwacją metodą mikroskopii skaningowej. Przygotowanie
szlifu umożliwia zbadanie próbki pod mikroskopem
polaryzacyjnym w świetle przechodzącym przed obserwacją
metodą mikroskopii skaningowej. Zgłady przeznaczone do
badań metodą mikroskopii skaningowej powinny mieć grubość
do 3 cm (lepiej nieco mniej) i powinny się mieścić na stoliku o
średnicy 5 cm. Są to wymiary maksymalne, lepiej, aby próbka
była znacznie mniejsza. Szlify przeznaczone do badań metodą
mikroskopii skaningowej powinny mieć grubość około 0,03 mm
i powinien być wykonany na standardowym szkiełku
mikroskopowym o wymiarach 26 x 48 mm (±2 mm).

Do sporządzania szlifów i zgładów należy używać
specjalnej żywicy epoksydowej, odpornej na warunki
wysokiej próżni i na działanie wiązki elektronów. Próbki
porowate, słabo spojone i bardzo kruche powinny być
przed ścieraniem i polerowaniem zatopione w żywicy
epoksydowej. Jeśli przygotowujemy szlif lub zgład z
bardzo małych obiektów, to należy te obiekty przed
ścieraniem i polerowaniem zatopić w żywicy
epoksydowej:

Do przygotowania szlifu: na szkiełku mikroskopowym.

Do przygotowania zgładu: najlepiej w mosiężnym lub
stalowym pierścieniu o średnicy zewnętrznej 24 mm i
wysokości 7 – 8 mm.

Rejestracji obrazów badanych preparatów
dokonuje się przy pomocy cyfrowego układu
detekcji. Specjalistyczny program
komputerowy umożliwia wszechstronna
obróbkę danych oraz precyzyjne pomiary
m.in. głębokości profili, całkowitych
wymiarów zewnętrznych obiektów i
odległości pomiędzy nimi. Oprogramowanie
pozwala również na: wykonanie
statystycznego rozkładu rozmiarów ziaren w
próbce, analizę morfologiczną, sporządzanie
barwnych map powierzchni, symulację
obrazów 3D oraz archiwizację fotogramów
ich wydruk, rejestrację na dowolnym
nośniku, bądź przesłanie obrazów pocztą
internetową.

AFM

Mikroskop sił atomowych (Atomic Force Microscope)

Rodzaj mikroskopu, który umożliwia uzyskanie obrazu
powierzchni ze zdolnością rozdzielczą rzędu wymiarów
pojedynczego atomu, dzięki wykorzystaniu sił oddziaływań
międzyatomowych, na zasadzie przemiatania ostrza nad lub
pod powierzchnią próbki.

Zasada działania mikroskopu polega na pomiarze siły
oddziaływania mikroskopijnej igły z powierzchnią próbki
podczas jej skanowania. Pomiar tej siły dokonywany jest przy
pomocy promienia lasera, który jest zogniskowany na igle.
Odbity od niej trafia na fotoelement. Zmiany położenia plamki
laserowej fotoelement zamienia na impulsy elektryczne.
Impulsy te są następnie formowane, przekształcane i
przesyłane do komputera. Uzyskane dane linia po linii
rejestrowane są przez komputer i przetwarzane na obraz.

Przygotowanie próbki do pomiarów przy pomocy mikroskopii AFM
nie jest skomplikowane. Jednak jakość uzyskanego później obrazu
bardzo zależy od tej czynności. Występują tu ograniczenia co do
wymiarów, konsystencji i kształtu próbki.

Mikroskopem AFM można badać tylko ciała stałe, może się to
odbywać w powietrzu lub w cieczy. Warunkiem koniecznym
prawidłowego skanowania jest to, aby badany materiał był
solidnie umocowany do podłoża, tak, by igła nie mogła go
przesuwać. Nie można badać substancji, które przybierają kształt
naczynia w którym się znajdują. Twardość próbki ma zasadnicze
znaczenie, można badać substancje miękkie ale tylko do pewnych
granic.
    
Przydatność próbki do skanowania można stwierdzić tylko
podczas faktycznego pomiaru. Istnieją substancje, których
badanie mikroskopem AFM jest utrudnione lub niemożliwe.
Możliwe jest skanowanie proszków.

Próbka jest umieszczana na metalowym krążku o średnicy 15
mm i przymocowana jest przy pomocy przewodzącej
elektrycznie, dwustronnej taśmy samoprzylepnej.

Przykłady próbek:

Najładniejsze obrazy uzyskamy, gdy badana substancja jest
naniesiona na miniaturowe szkiełko (10 x 10 mm) a
nierównomierność powierzchni wynosi mniej niż 100 nm.

Wymagania dotyczące próbki
maksymalne rozmiary próbki wynoszą 10 x 10 x 5 mm lub 15 mm x 5
mm



maksymalna chropowatość badanej powierzchni może wynosić: 8
µm



proszków nie należy rozdrabniać



nie wolno dotykać badanej powierzchni palcami, najlepiej gdy
badana powierzchnia nie była niczym dotykana



badaną powierzchnię o ile to możliwe należy przygotować
bezpośrednio przed pomiarem (utlenianie, zanieczyszczenia)



należy objaśnić jakiego obrazu się spodziewamy, co chcemy
zobaczyć, jakie powiększenia są pożądane.

Ze względu na budowę głowicy mikroskopu
powierzchnia, która może być objęta skanowaniem
umieszczona jest centralnie na próbce a jej rozmiar
obejmuje 1,5 x 1,5 mm

2

. Nie można więc skanować

obszarów położonych na brzegach próbki.

Próbkę umieszcza się na
podstawie
piezoelektrycznej i skanuje
ostrzem. W kontaktowym
rodzaju pracy topografię
powierzchni uzyskuje się
bezpośrednio na podstawie
odchyleń ramienia, na
którym umocowane jest
ostrze, wykrywanych dzięki
odchyleniu wiązki laserowej
w fotodiodzie. Obraz jest
otrzymywany przez zmianę
napięcia w piezoelektryku
na informację w wysokości.

Literatura:

Praca zbiorowa pod redakcją A. Bolewski, W.
Żabiński
,,Metody badań minerałów i skał’’ Warszawa
1979

Instrukcja do ćwiczeń mgr inż. Barbara Trybalska

Internet

Dziękuję za uwagę !

Dziękuję za uwagę !