Nowoczesne metody

diagnostyczne i

sposoby

monitorowania

w hematologii

Trzy drogi do zrozumienia

transformacji

nowotworowej

•Cytogenetyka

•Cząsteczki sygnałowe

•Onkowirusologia

CYTOGENETYKA

• Określony nowotwór jest związany z

określoną zmianą genetyczną

• Taka zmiana w PBSz jest zlokalizowana

albo na chromosomie 9, albo na 22
(1973)

• Dalsze rozpracowanie tego zjawiska

powinno doprowadzić zarówno do
zrozumienia istoty choroby, jak i
wskazać możliwości jej leczenia

CZĄSTKI SYGNAŁOWE

• Cz.s. przekazują informacje między komórkami, w tym

informacje określające życie i i rozmnażanie się

komórek

• Cz.s.międzykomórkowe, takie jak cytokiny działają na

komórki po przyłączeniu się do swoistych receptorów.

Receptory te następnie przekazują informacje do

cytoplazmy i tam swoiste cząsteczki przekazu

(transdukcji) sygnału (czps) przekazują ją do jądra.

• Cz.p.s są enzymami zlokalizowanymi w cytoplażmie,

które po pobudzeniu przez wewnątrzkomórkową część

receptora cytokinowego, aktywują kolejne białka, w

tym czynniki transkrypcyjne (takie jak kinazy

tyrozynowe, serynowo-treoninowe itd.)

I CO DALEJ…?

• Mutacje genów cytokin, receptorów

cytokin, białek przekazu sygnału i
czynników transkrypcyjnych mogą
powodować nowotworowe
zachowanie się komórek poprzez
spowodowanie braku reakcji na
regulację przez organizm

Czy wszystkie mutacje genów

kodujących cz.s. mogą powodować

transformację nowotworową?

• NIE!!!
• Mutacje inaktywujące (niszczące czynność

genu) powodują niedobór a nie nadmiar

komórek

• TYLKO mutacje aktywujące (zwiększające

czynność genu) mogą powodować nadmierne

rozmnażanie się komórek

• Mutacje aktywujące nie dotyczą tych genów

bezpośrednio, ale raczej ich regulatorów;

takie mutacje niszczą „wyłącznik”

Onkowirusologia

• Zaczęło się od odkrycia (1911) u kurczaków wirusa

mięsaka Rousa przez Peytona Rousa, a następnie u

myszy wirusa białaczki Grossa (1945) przez Ludwika

Grossa, i wreszcie od opisania (1970) wirusa

powodującego chłoniaka u myszy przez Abelsona i

Rabsteina

• Okazało się, że te wirusy zwane retrowirusami

(zwierzęce wirusy nowotworowe RNA) zawierają

onkogeny takie jak src (wirus mięsaka Rousa), abl

(wirus białaczki Abelsona) i wiele innych

• Wkrótce stwierdzono, że onkogeny wirusowe nie są

oryginalnymi genami wirusów, ale w rzeczywistości

są genami zwierzęcymi „ ukradzionymi” przez wirusy,

Onkowirusologia

cd

• Onkowirusolodzy zaczęli poszukiwać

ludzkich odpowiedników onkogenów

zwierzęcych i ich lokalizacji

chromosomalnej

• W 1982 stwierdzono, że ludzki homolog

dla onkogenu c-ABL jest zlokalizowany

na chromosomie 9 i…
• W 1983 stwierdzono , że w PBSz c-ABL

jest przeniesiony z chromosomu 9 na 22

NOMENKLATURA

• v-abl: gen wirusowy

» c-abl: jego komórkowy (mysi) homolog

• c-ABL: jego komórkowy (ludzki)

homolog

Co się dzieje z c-ABL a

PBSz?

• Gen c-ABL jest przenoszony na

chromosom 22 bez swoistych
sekwencji regulatorowych, które
pozostają na chromosomie 9

• Powoduje to, że c-ABL na

chromosomie 22 pozostaje stale
włączony

• A jego produkt, kinaza tyrozynowa

ABL jest stale wytwarzana

Następstwa powstania

fuzyjnego genu BCR-ABL

Zaburzone są trzy główne zjawiska:

• Rozmnażanie się (które jest

zwiększone)

• Apoptoza (która jest zahamowana)
• Adhezja (która jest zmniejszona)

I dopiero razem te trzy zjawiska nadają

komórce złośliwy fenotyp

Przewlekła białaczka szpikowa

rodzaje remisji

Hematologiczna: normalizacja granulocytozy;

zmniejszenie klonu białaczkowego (kb) < wlk

normalnego układu krwiotwórczego

Cytogenetyczna: nieobecność chromosomu

Filadelfia; zmniejszenie kb < 1/10 wlk normalnego

układu krwiotwórczego

Molekularna: nieobecność transkryptu BCR-ABL w

badaniu PCR

zmniejszenie kb < miliona komórek

Wyleczenie: eliminacja kb

Diagnostyka genetyczna PBSz

czułość metod

1/ cytogenetyczna:
a/ kariotyp – 10

-1

b/ FISH (cytogenetyka molekularna) – 10

-2

2/ molekularna
a/ badania jakościowe: RT-PCR – 10

-4

nested PCR – 10

-6

b/ badania ilościowe: RQ-PCR – 10

-5

– 10

-6

c/ analiza mutacji:
sekwencjonowanie
ASO-PCR (allele specific

oligonucleotides)

Przewlekła białaczka

limfocytowa

Rozpoznanie

NCI-WG (1996):
Limfocytoza krwi obw.(x10

9

/l):>5; >1 limfocytów

Immunofenotyp: CD19, CD20, CD23 + CD5

IWCLL workshop (2005):
stała, zwiększona liczba (?) klonalnych limfocytów +morfologia

immunofenotyp PBL-B

Immunofenotyp min: CD19, CD20, CD23, CD5 + łań lekkie sIg
rekomendowane: CD79b, sIg
Wymagane w bad klinicznych: ZAP70, CD38

Przewlekła białaczka

limfocytowa

Badania molekularne i cytogenetyczne

NCI-WG (1996) – potencjalnie ważne jako czynniki

prognostyczne

2005r: badania ważne rokowniczo;

• Analiza cytogenetyczna wykrywa u 35-50%

chorych (FISH u >80%) anomalie cytogenetyczne

(Dohner i wsp 1995)

• Stan mutacji VH Ig (Damle i wsp 1999, Hamblin i

wsp 1999)

• Analiza profilu ekspresji genów techniką

mikromacierzy DNA

Średni czas przeżycia chorych na PBL-B

a nieprawidłowosći genetyczne

Anomalie genetyczne

Średni czas przeżycia (m-

ce)

delecja 17p

32

delecja 11q

79

trisomia 12q

114

delecja 13q

133

Prawidłowy kariotyp 111
N-VH Ig

79

M-VH Ig

152

Przewlekła białaczka

limfocytowa

Kryteria odpowiedzi na leczenie
NCI-WG (1996): CR – badanie fizykalne – bez odchyleń
brak objawów choroby
ALC(G/l) < 4; ANC (G/l) > 1,5; Plt(G/l) > 100; Hb (g/dl)

>11

Limfocyty w szpiku kostnym(%) < 30; bez guzków

limfoidalnych

2005r.:
CR – MRD(minimal residual disease),

molekularna CR

< 0,01% krwinek białych krwi obw; <

0,05% kom szpiku

Chłoniaki nieziarnicze

Chłoniak grudkowy – w 85% stwierdza się t(14;18),
w której onkogen BCL-2 z chr 18q21, zostaje przeniesiony na chr14q32
miejsce genu dla łańcucha ciężkiego Ig
Chłoniak Burkitta – powszechna jest translokacja onkogenu c-myc
z chr 8 na: ch 14, t(8;14)(q24;q32), lub
na chr 2 miejsce genu dla łańcucha lekkiego kappa, t(2;8)(p13;q24),

lub

na chr 22 miejsce genu dla łańcucha lekkiego lambda, t(8;22)(q24;q11)
Chłoniak anaplastyczny wielkokomórkowy –
w 50% z typową t(2;5)(p23;q35),
która obejmuje gen NPM z 5p35 i gen ALK z 2p23, efektem jest fuzyjne
białko p80

Chłoniaki nieziarnicze

Chłoniak strefy płaszcza (mantle cell) – w 30-55% obecna

t(11;14),

rezultatem której jest aktywacja genu cykliny D1 (CCND1),

zlokalizowa-

nego na chr 11q13, przez gen IgH z chr 14,
Cyklina D1 uwrażliwia komórki na działanie czynników wzrostu

- t(11;14) stwierdza się w 3% szpiczaka plazmocytowego
- „ „ w 20% białaczki prolimfocytowej

Ostre białaczki limfoblastyczne B

komórkowe

CD19+ i/lub cyCD79+, i/lub cyCD22+

Wczesne pre-B: t(12;21), obejmuje geny TEL-AML1, produkt

białkowy działa jako czynnik transkrypcyjny

: t(9;22), geny BCR-ABL, kinaza tyrozynowa o
działaniu sygnału przenoszenia

Pre-B: CD10+, cyIgM+; t(1;19); geny E2A-PBX1; produkt białka
działa jak czynnik transkrypcyjny

Dojrzałe B: sIg+; t(8;14); MYC/IGH,
t(2;8); IGK/MYC,
t(8;22); MYC/IGL – produkty białkowe pełnią

funkcję

czynników transkrypcyjnych

Ostre białaczki szpikowe

MLA- M2 – MPO+, CD13+, CD33+,HLA-DR+
w 18-30% stwierdza się t(8;21), obejmująca geny ETO i AML1

MLA-M3 – CD33+, HLA-DR-
w 80-100% obecna t(15;17), z udziałem genów PML i RARA, wynikiem

jest fuzyjne białko kwas retinowy/receptor alfa, które odpowiada na

leczenie kwasem all-trans-retinowym oraz trójtlenkiem arsenu, co reguluje

końcowe różnicowanie mieloidalnych prekursorów

MLA-M4 – typowe (100%) inv (16)

MLA-M4 lub M5- typowe delecje w regionie 11q23 (35%),
typowe t(9;11), t(10;11), t(1;11), t(2;11)