Oznaczanie kariotypu

Zakład Genetyki Medycznej
UM w Łodzi

Etapy badania

cytogenetycznego

• Namnożenie komórek w hodowli in vitro w celu uzyskania

komórek dzielących się mitotycznie

• Nagromadzenie komórek w stadium metafazy uzyskane

poprzez inkubację z kolchicyną

• Zakończenie hodowli i sporządzenie preparatów

chromosomowych

szok hipotoniczny
utrwalenie komórek
naniesienie zawiesiny komórek na szkiełko podstawowe
• Wybarwienie chromosomów metoda prążkową
• Analiza chromosomów w mikroskopie przy powiększeniu 1000 x
• Sporządzenie dokumentacji obrazu chromosomów – kariogramu
• Wypisanie wyniku badania

• Zastosowanie technik cytogenetyki molekularnej w

uzasadnionych przypadkach.

Standardowa hodowla limfocytów

G

0

G

1

G

2

wykończenie hodowli

M

S

stymulacja limfocytów
do wzrostu

Colcemid

PHA

Analiza cytogenetyczna:

Wymagania konieczne do

prowadzenia hodowli

cytogenetycznej

•Podłoże hodowlane odpowiednie dla rodzaju

hodowanej tkanki

•Jałowe naczynie w którym przebiega hodowla

•Inkubator ustawiony do temperatury 37 st.C z

automatycznym przepływem dwutlenku węgla ( 5

% CO2 )

Do momentu wykończenia każda hodowla

cytogenetyczna przebiega w warunkach jałowych

Rodzaje tkanek w których
oznacza się kariotyp

• Diagnostyka postnatalna:

– limfocyty krwi obwodowej (3-5 ml)
– fibroblasty skóry (biopsja skóry)

• Diagnostyka prenatalna:

– komórki owodniowe (zależnie od hbd)
– komórki trofoblastu
– komórki popłodu

• Diagnostyka nowotworowa:

– szpik
– komórki nowotworowe

Sposób pozyskiwania materiału

• limfocyty krwi obwodowej

2 ml pełnej krwi pobranej na heparynę w celu uniknięcia skrzepu w

proporcji 0,1 ml heparyny / 1 ml krwi

• komórki płodu

zawiesina komórek uzyskana po odwirowaniu wód płodowych

pobranych w czasie zabiegu amniopunkcji

• komórki trofoblastu

fragment trofoblastu uzyskany na drodze biopsji

• fibroblasty skóry

niewielki fragment skóry właściwej pobranej przy użyciu odpowiednich

narzędzi ( skin biopsy punches )

• fibroblasty gonad

materiał pobrany śródoperacyjnie

• fibroblasty popłodu

niewielki fragment tkanki popłodu pobrany w czasie sekcji

• szpik

biopsja szpiku (~1 ml)

• komórki nowotworowe

fragment guza litego

Założenie, przebieg i

wykończenie hodowli

Postnatalne badania cytogenetyczne

• Limfocyty krwi obwodowej

w probówce do hodowli limfocytów umieszczamy 9 ml kompletnego

podłoża Karyotyping, 0,5 ml mitogeu – LF-7 i 0,8 ml pełnej krwi

inkubujemy w cieplarce przez 72 h ( raz w ciągu dnia dokładnie

mieszamy )

po 48 h wymieniamy podłoże na świeże bez mitogenu
po upływie 72 h wykańczamy hodowlę poprzez dodanie Colcemidu,

zastosowanie

szoku hipotonicznego przy użyciu 0,075 M KCL i utrwalenie w

mieszaninie metanolu i kwasu octowego w stosunku 3:1

wykonujemy preparaty poprzez nakraplanie utrwalonej zawiesiny

na przygotowane szkiełka podstawowe

Założenie, przebieg i

wykończenie hodowli

Postnatalne badania cytogenetyczne

• Fibroblasty skóry, gonad, popłodu, komórki nowotworowe

fragment skóry właściwej inkubujemy w probówce w roztworze

Kolagenazy Typ IV w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek

zawiesinę komórkową przenosimy do naczynia ‘’ typu Falcon ‘’ i

dodajemy 6 ml kompletnego podłoża BioAmf-2

po upływie 5 – 7 dni po raz pierwszy obserwujemy hodowlę w

mikroskopie odwróconym, w przypadku uzyskania wzrostu komórek

wymieniamy podłoże co

2 -3 dni
w momencie uzyskania wzrostu komórkowego na całej powierzchni

naczynia wykonujemy pierwszy pasaż, czyli podział i przeniesienie

hodowanego materiału do kolejnych naczyń

wykańczamy hodowlę gdy obserwujemy odpowiedni wzrost i

odpowiednią liczbę figur podziałowych w jednym z naczyń poprzez

dodanie Colcemidu, zastosowanie szoku hipotonicznego przy użyciu 0,4

% chlorku potasu i cytrynianu sodu, utrwalenie w mieszaninie metanolu

i kwasu octowego w stosunku 3:1

wykonujemy preparaty poprzez nakraplanie utrwalonej zawiesiny na

przygotowane szkiełka podstawowe

Założenie, przebieg i

wykończenie hodowli

Prenatalne badania cytogenetyczne

•Komórki płodu - hodowla in situ

uzyskane wody płodowe wirujemy, supernatant przekazujemy do

badania biochemicznego, osad komórkowy zawieszamy w 0,5 ml

kompletnego podłoża BioAmf-2
nanosimy zawiesinę komórkową równomiernie na cztery szkiełka

nakrywkowe umieszczone w jałowych szalkach Petriego
po 24 h dodajemy 2 ml podłża, które następnie wymieniamy co 2 dni
wykańczamy hodowlę gdy obserwujemy odpowiedni wzrost komórek

i odpowiednią liczbę figur podziałowych w szalkach poprzez dodanie

Colcemidu, zastosowanie szoku hipotonicznego przy użyciu 0,8 %

cytrynianu sodu, utrwalenie w mieszaninie metanolu i kwasu

octowego w stosunku 3:1 oraz 2:3
preparatami są szkiełka nakrywkowe z utrwalonymi koloniami

amniocytów

Założenie, przebieg i

wykończenie hodowli

Prenatalne badania cytogenetyczne

• Komórki trofoblastu – hodowla bezpośrednia

uzyskane kosmki trofoblastu umieszczamy w szalce Petriego z

2ml podłoża BioAmf-2

po 72 h wykańczamy hodowlę poprzez dodanie Colcemidu,

zastosowanie szoku hipotonicznego przy użyciu 0,8 %
cytrynianu sodu, utrwalenie w mieszaninie metanolu i kwasu
octowego w stosunku 3:1

wykonujemy preparaty poprzez nakroplenie i rozprowadzenie

utrwalonej zawiesiny komórkowej na przygotowanych szkiełkach
podstawowych

Czas trwania hodowli

•Limfocyty krwi obwodowej – 72 godziny
•Fibroblasty skóry i inne – 2 do 3 tygodni
•Komórki płodu po hodowli in situ – 7 do 10 dni
•Komórki trofoblastu po hodowli bezpośredniej –

3 dni

Barwienie preparatów

Preparaty uzyskane po hodowli

cytogenetycznej barwimy

rutynowo techniką

prążków G ( GTG )

W przypadku stwierdzenia nieprawidłowości

wzoru prążków G wymagane jest

zastosowanie innych technik prążkowych :
•Technika prążków C ( CBG )
•Technika prążków Q ( QFQ )
•Technika prążków NOR
•Technika prążków DAPI

Technika prążków G (GTG)

Charakterystyczny wzór prążkowy dla każdego

chromosomu – na przemian jasne i ciemne
poprzeczne prążki.

Technika prążków GTG

46 chromosomów
22 autosomy
2 gonosomy

23 chromosomy od matki
23 chromosomy od ojca

Numerowanie
prążków

centromer -> telomer

p =

krótkie ramię

q =

długie ramię

Ideogramy

Chromosomy:

• metacentryczne (pq)

• akrocentryczne (p<<q)

• submetacentryczne (p<q)

Technika GTG – prawidłowy karityp
męski, prawidłowy kariotyp żeński

telomery

telomery

Prążki

G-pozytywne

AT

nieliczne geny

P

q

Prążki

G-negatywne

GC

głównie geny

centromer

Technika GTG

Technika prążków Q (QFQ)

Podobny do G wzór prążkowy uzyskany po barwieniu

quinakryną (barwnik fluorescencyjny). Intensywnie
zabarwia się dystalna część ramienia długiego chr.Y

Technika prążków C (CBG)

W postaci ciemnych prążków barwią się centromery wszystkich

chromosomów i heterochromotyna konstytutywna w
chromosomach 1, 9, 16, i Y.

Technika barwienia DAPI

Wybarwia się heterochromatyna okołocentromerowa

chromosomów 1, 9, 16, dystalna część ramienia

długiego Y, ramiona krótkie chromosomu nr 15.

Technika barwienia NOR

Wybarwiają się obszary aktywnych organizatorów

jąderka wszystkich chromosomów akrocentrycznych.

•

Połączenie technik biologii molekularnej
z technikami klasycznej cytogenetyki

•

Identyfikacja rearanżacji chromosomowych
i chromosomów markerowych „de novo”

•

Detekcja niektórych aberracji chromosomowych
w komórkach okresu interfazy (cytogenetyka
interfazowa)

•

Określanie punktów złamań chromosomowych;

badania nad strukturą i funkcją

specyficznych regionów chromosomowych

•

Mapowanie fizyczne (fiber FISH)

Cytogenetyka molekularna

- założenia

1

2

3

4

5

Sonda molekularna
DNA (dwuniciowa)

Wektor (plazmid)

denaturacja

dextran

hybrydyzacja

gen

Proces hybrydyzacji in situ

Techniki cytogenetyki

molekularnej

• FISH

( fluorescencyjna hybrydyzacja in situ )

• M-FISH

( wielokolorowy FISH )

• SKY

( spektralna analiza widmowa kariotypu )

• CGH

( porównawcza hybrydyzacja genomowa )

Technika FISH

wzbudzenie

emisja

fluorochrom

„sonda” DNA

filtr optyczny

DAPI

TRITC

+

Zastosowanie techniki FISH

•

Charakterystyka cytogenetyczna

aberracji strukturalnych
chromosomów

•

Wykrywanie

aneuploidii/poliploidii

•

Wykrywanie

aberracji

chromosomowych specyficznych
dla chorób nowotworowych

Technika FISH

- typy sond molekularnych

sonda

centromerowa

sonda

unikalna

z kontrolą

płytki metafazowe
- identyfikacja chromosomów

cytogenetyka interfazowa
- aberracje liczbowe chromosomów

identyfikacja regionu chromosomowego
zaangażowanego w rearanżację
chromosomową

identyfikacja chromosomu

sonda

malująca

identyfikacja chromosomów
markerowych

identyfikacja regionów chromosomowych
zaangażowanych w translokacje

Technika FISH

- płytka metafazowa

LSI SNRPN

CEP13,21/CEP14,22

LSI13/LSI18/LSI21/CEPX/CEPY

FISH

dwukolorowa FISH

wielokolorowa FISH

Interfazowy FISH

CEP Y

Multiplex FISH

M – FISH

Pula sekwencji DNA
każdego
chromosomu jest
bezpośrednio
znakowana jednym
lub kilkoma z pięciu
wykorzystywanych
fluorochromów

dzięki czemu po
hybrydyzacji
uzyskuje się
unikalny kolor dla
każdego z 24
chromosomów

1
2
3
4
5
6
7
8
9

10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

X
Y

500

600

700

500

600

700

Multiplex FISH

M – F I S H

•

Rejestracja obrazu przy użyciu

monochromatycznej

kamery CCD

(w skali szarości) oddzielnie dla każdego

z 5 fluorochromów

•

Składanie obrazów i przypisanie pseudokolorów
dla każdej pary chromosomowej

• „Kolorowy”

kariotyp

•

Analiza chromosomów

nie jest możliwa

bezpośrednio

pod mikroskopem

Multiplex FISH

M–FISH

Spectral Karyotyping

SKY

•

Generowanie „obrazu” płytki metafazowej na podstawie
pomiaru spektrofotometrycznego dla każdego piksela w
odpowiedniej macierzy obrazu

•

Przypisanie pseudokolorów dla każdej pary
chromosomowej na podstawie uzyskanego wzoru (widma)
spektralnego

• „Kolorowy”

kariotyp

Diagnostyka :

•

translokacji chromosomowych zwłaszcza tych
obejmujących więcej niż dwa chromosomy

•

chromosomów markerowych

M–FISH i SKY - aplikacje

Określanie punktów złamań chromosomowych?

•

Detekcja

utraty lub amplifikacji

regionów chromosomowych na

poziomie prążka chromosomowego

•

Bez konieczności prowadzenia hodowli komórkowej

•

DNA badane i referencyjne wyznakowane różnymi
fluorochromami

•

Jednoczesna hybrydyzacja do kontrolnego preparatu
cytogenetycznego

•

Porównanie natężenia fluorescencji w chromosomów danej
pary

•

Możliwość detekcji różnic w ilości kopii DNA pomiędzy
referencyjnym i badanym DNA

CGH - założenia

BADANE DNA - ?

KONTROLNE DNA – 46,XY

Cot-1 DNA

PREPRAT KONTROLNY -

46,XY

fragmenty DNA - 300-600 bp

SR-dUTP

SG-dUTP

Nick Translation

KO-DENATURACJA (73°C, 5-8’)

HYBRYDYZACJA (37°C, 3 dni)

0,3% NP-40

3’, 70°C

0,1% NP-

40

1’,

t.pok.

REJESTRACJA OBRAZU, IDENTYFIKACJA CHROMOSOMÓW, ANALIZA

STATYSTYCZNA

POLISOMIA,

DUPLIKACJA

MONOSOMIA

,

DELECJA

CGH

ANALIZA STATYSTYCZNA

„więcej kopii danej

sekwencji w badanym

DNA”

„więcej kopii danej

sekwencji w

kontrolnym DNA”

„tyle samo

kopii danych

sekwencji w

badanym i

kontrolnym

DNA”

COMPRATIVE GENOMIC
HYBRIDIZATION

RENUMERICAL

GREEN/RED

RATIO

KARIOTYPE

REFERENCE

DNA

(RED)

TEST DNA

(GREEN)

CGH

FINDINGS

+

+

+

+

4/2=2,0

3/2=1,5

2/2=1,0

1/2=0,5

TOTAL LOSS

TETRASOMY

TRISOMY

DISOMY

MONOSOMY

0/2=0,0

46,XX

Y

X

„brak

sekwencji

chromosomu

Y w

badanym

DNA”

„więcej

sekwencji

chromosomu

X w

badanym

DNA”

47,XX,

+21

Y

21

21

X

„więcej

sekwencji

chromosomu

21 w

badanym

DNA”

•

Detekcja

aneuploidii

chromosomowych oraz

amplifikacji DNA w trakcie diagnostyki
nowotworowej

•

•

Identyfikacja

chromosomów markerowych

w

trakcie diagnostyki pre- i postnatalnej

•

Detekcja

niezrównoważonych aberracji

chromosomowych

w trakcie diagnostyki pre-

i postnatalnej

•

Analiza chromosomów nie jest możliwa
bezpośrednio pod mikroskopem

CGH - aplikacje

!!! CGH nie umożliwia detekcji zrównoważonych aberracji chromosomowych !!!

Zastosowanie technik
cytogenetyki molekularnej

PREPARATY CYTOGENETYCZNE

•

Chromosomy
metafazowe

•

Jądra interfazowe

ABERRACJE CHROMOSOMOWE

•

Liczbowe

•

Strukturalne

•

Mikrodelecje/duplikacje

(+

)

(+

)

(+

)

(+

)

(+

)

(-)

(-)

(+)

(+)

(?)

(+)

(-)

(+)

(+)

(-)

FISH

CGH

M-

FISH

Podsumowanie

• Hodowla komórkowa
• Analiza kariotypu z wykorzystaniem

technik prążkowych

• Zastosowanie dodatkowych technik

cytogenetyki molekularnej (jeżeli jest
taka konieczność)

• Wynik + epikryza diagnostyczna