Oznaczanie aktywności
wieloenzymowego układu
fotosyntetycznego
Oznaczanie aktywności
wieloenzymowego układu
fotosyntetycznego
Chloroplasty
• Eukariotyczne organellum
komórkowe otoczone podwójną błoną
białkowo-lipidową,
• rodzaj plastydów,
• zawierają zielony barwnik – chlorofil-
zlokalizowany w granach,
• w ich wnętrzu przebiegają reakcje
składające się na proces fotosyntezy.
Fotosynteza
• proces anaboliczny,
• zależna od światła asymilacja
dwutlenku węgla i wody z
utworzeniem węglowodanów i tlenu
cząsteczkowego,
• zachodzą dwa rodzaje reakcji
świetlnych wynikające z aktywności
dwóch fotosystemów.
Fotosystem
• jest kompleksem barwnikowo-lipidowo-
białkowym absorbującym kwanty światła
• chlorofil występujący w centrum reakcji
PSI wykazuje maksimum absorbancji
światła przy 700nm, a chlorofil z
centrum reakcji PSII ma maksimum
absorbancji przy 680nm,
• te dwa fotosystemy łączy łańcuch
transportu elektronów.
• proces rozpoczyna się od fotosystemu II.
Pomiar aktywności
fotosystemów
• Aktywność obydwu układów mierzy
się stosując sztuczne donory i
akceptory elektronów,
• odpowiednio dostarczając dzięki
temu lub pobierając elektrony w
różnych miejscach łańcucha
fotosyntetycznego.
Pomiar aktywności PS II
• Produkt reakcji zachodzącej w PS II –
tlen,
• Aktywność = szybkość wydzielania
tlenu przez chloroplasty,
• Do pomiarów używamy elektrody
tlenowej Clarka.
Pomiar aktywności PS I
• Aktywność można oznaczać również
za pomocą elektrody Clarka stosując
sztuczne donory i akceptory
elektronów,
(zredukowana forma drugiego
akceptora elektronów ulegając
samoutlenieniu wytwarza rodnik
ponadtlenowy, co wymaga obecności
tlenu => jest to reakcja Mehlera)
Elektroda tlenowa Clarka
• Jest dość czuła, potrafi zmierzyć stężenie
tlenu, wynoszące nawet:0,1 mmol/l.
• Składa się z:
Katody– polaryzująca się, pomiarowa,
Anody – niepolaryzująca, elektroda
odniesienia.
• Obie elektrody zanurzone są w roztworze
elektrolitu (nasycony roztwór KCl) i
oddzielone od badanej zawiesiny błoną
teflonową.
• Prąd pomiędzy nimi płynie jedynie przez płyn
elektrodowy, a tlen dyfunduje przez błonę do
elektrolitu.
• Sygnałem wyjściowym elektrody jest natężenie
prądu, które jest proporcjonalne do ciśnienia
parcjalnego tlenu lub stężenia w elektrolicie.
• W chwili doprowadzenia napięcia do elektrod w
roztworze następuje elektrolityczna redukcja
tlenu, początkowo do nadtlenku wodoru, a
następnie do jonu hydroksylowego. Źródłem
elektronów redukujących tlen jest utleniająca
się anoda.
Charakteryzacja układu
fotosyntetycznego
• Dzięki zastosowaniu szeregu
inhibitorów, np. DBMIB, kwas
tłuszczowy, hydroksyloamina
• Kontrola fotosyntetyczna = stosunek
szybkości transportu elektronów przed
dodaniem ADP i fosforanu do szybkości
transportu elektronów po ich dodaniu
• Jony amonowe rozprzęgają specyficznie
fosforylację fotosyntetyczną.
Wykonanie pomiarów
• Przyjmujemy następujące wartości
dotyczące nasycenia mieszanin tlenem:
100% - napowietrzona w temp.25 stopni
mieszanina rekacyjna
0% - mieszanina reakcyjna nasycona
azotem w temp. 25 stopni
Pomiary wykonujemy wyłączając źródło
światła po dodaniu zawiesiny
chloroplastów.
Pomiary wydzielania tlenu –
PS II
• Mieszanina nasycona azotem +
chloroplasty => otrzymać przebieg
prostoliniowy wydzielania tlenu
• Dodajemy DCMU – dalsze oznaczenia
• Dodajemy kwas linolenowy – dalsze
oznaczenia.
• Związki te działają jako inhibitory
fotosyntezy.
Pomiary pobierania tlenu
• Wykonujemy w celu oznaczenia
aktywności całego łańcucha
fotosyntetycznego.
• Natlenowana mieszanina reakcyjna +
chloroplasty:
• + metyloamina – przeprowadzić
oznaczenia
• + DBMIB – przeprowadzić oznaczenia
• -związki te są inhibitorami systemu.
Oznaczanie aktywności PS I
• Mieszanina reakcyjna (zawierająca
Tris, askorbinian sodu, TMPD, MV) +
DCMU + chloroplasty.
• Reakcję przeprowadzać aż do
wyczerpania się tlenu.
WYNIKI
1.
2.
3.
Układ pomiarowy
(fotosystem/donor/
akceptor/inhibitor)
Aktywność
%
Aktywność
%
Aktywność
%
PSII, H
2
O, fenylo-p-benzohinon
0,995
100%
2,82
100%
1,3
100%
PSII, H
2
O, fenylo-p-benzohinon
(przed dodaniem kwasu
linolenowego)
0,652
100%
2,19
100%
1,3
100%
PSII, H
2
O, fenylo-p-benzohinon,
kwas linolenowy 0.12 nM (do 20 s
po podaniu inhibitora)
0,413
63,34%
2,81
128,40%
0,56
56%
PSII, H
2
O, fenylo-p-benzohinon,
kwas linolenowy (po 20s od
dodania inhibitora)
0,413
63,34%
0,52
35,44%
0,56
56%
PSII, H
2
O, fenylo-p-benzohinon
DCMU
0,444
44,62%
Nie
wyszło
Nie
wyszło
0,51
61%
PSC, H
2
O, metylowiologen
0,297
100%
0,56
100%
-
-
PSC, H
2
O, metylowiologen,
metyloamina 3 mM
0,681
229,3%
2,02
362,28%
0,8
160%
PSC, H
2
O, metylowiologen,
DBMIB 8,3 µM
0,166
64,84%
0
0%
-
-
PSI, TMPD, metylowiologen
1,102
100%
4,13
100%
1,26
100%
Wyniki wykonywanych pomiarów przez 3 niezależne zespoły:
Oznaczanie aktywności PSII- pomiar
wydzielania tlenu
Fenylo-p-benzochinon – akceptor
elektronów
Oznaczanie aktywności PSII- pomiar
wydzielania tlenu
Na wykresie wyróżnić możemy dwa odcinki prostoliniowe –
reakcja w zależności od ilości donora elektronów przebiega z
różną szybkością.
Pierwszy odcinek prostoliniowy- początek reakcji- szybkość
reakcji wysoka ( 0.1183 mV/s)-dostępny donor.
Drugi odcinek prostoliniowy- szybkość reakcji (0.068 mV/s) –
szybkość reakcji niższa ponieważ mniejsza jest ilość donora
elektronów.
O
H
2
Donor
elektronów
Fenylo-p-benzochinon – akceptor elektronów
Oznaczanie aktywności PSII- pomiar
wydzielania tlenu w obecności DCMU (0.025
mM)
DCMU jest inhibitorem fotosystemu PSII. Wiąże się z plastochinonem
uniemożliwiając przepływ elektronów i przerywając ich transport w
łańcuchu fotosyntetycznym.
DCMU powoduje zwolnienie tempa wydzielania tlenu, a wraz ze wzrostem
stężenia tego inhibitora w mieszaninie reakcyjnej obserwujemy spadek
aktywności fotosystemu PSII.
Przy stężeniu DCMU ok. 0.1
mM
a
stężenie wydzielanego tlenu
wynosi 50 %.
Oznaczanie aktywności PSII- pomiar
wydzielania tlenu w obecności DCMU
Dodanie
chloroplastów
Na wykresie zobrazowano zmianę napięcia [mV] w czasie [s].
Wyróżnić można 4 odcinki prostoliniowe – 4 etapy reakcji.
• I etap – reakcja bez dodania DCMU- szybkość reakcji wysoka. Aktywność – 100%
•Etap II, III, IV – po kolejnych dawkach inhibitora- szybkość reakcji każdego z etapów
jest niższa od szybkości w etapie poprzedzającym – towarzyszy temu spadek
aktywności fotosystemu.
Oznaczanie aktywności PSII- pomiar
wydzielania tlenu w obecności kwasu
linolenowego (10mg/ml)
Kwas linolenowy rozprzęga transport protonów ( wnikając do
błon tylakoidów zaburza ich strukturę ).
Oznaczanie aktywności PSII- pomiar
wydzielania tlenu w obecności kwasu
linolenowego (10mg/ml)
•Na podstawie wykresu i wyników zespołu
drugiego możemy zauważyć, że w
pierwszych 20 sekundach po dodaniu kwasu
linolenowego szybkość reakcji jest wyższa
niż szybkość reakcji bez tego inhibitora
[ poczatkowo0.0919, po dodaniu kwasu –
0.118 mV/s].
• Taki wynik jest spowodowany faktem, że
tuż po podaniu kwasu linolenowego jeden z
enzymów kompleksu enzymatycznego
fotosystemu PSII zwiększa swoją aktywność
(by przeciwdziałać rozprzęganiu transportu
elektronów).
*Wyniki pozostałych zespołów mogą nie uwzględniać tego etapu, gdyż mógł być on
bardzo krótki i praktycznie nie zauważalny,
Oznaczanie aktywności PSII- pomiar
wydzielania tlenu w obecności kwasu
linolenowego (10mg/ml)
•
Po 20 sekundach od dodania do
mieszaniny kwasu linolenowego
obserwowany jest znaczny spadek
szybkości reakcji (do 0.02119 mV/s).
Aktywność fotosystemu spada, w
przypadku zespołu 2, do 35%. W
przypadku pozostałych zespołów spadek
ten nie jest tak znaczny, ale również
zauważalny (ok. 60%).
• Dłuższe działanie kwasu linolenowego /
większe stężenie, powoduje znaczące
uszkodzenie tylakoidów.
Oznaczanie aktywności PSII- pomiar
wydzielania tlenu w obecności kwasu
linolenowego (10mg/ml)
Oznaczanie aktywności całego łańcucha
fotosyntetycznego – pomiar pobierania tlenu
Metylowiologen- akceptor elektronów
Szybkość
pobierania tlenu
0.014 mV/s
Oznaczanie aktywności całego łańcucha
fotosyntetycznego – pomiar pobierania tlenu
w obecności metyloaminy ( 3mM)
Metyloamina jest stymulatorem- znosi gradient protonowy w
chloroplastach – jej dodanie powoduje wzrost szybkości
pobierania tlenu
•Dodanie metyloaminy do
mieszaniny reakcyjnej powoduje
ponad dwukrotny wzrost
aktywności łańcucha
fotosyntetycznego (229,3 ;
362,28%) i czterokrotny wzrost
szybkości pobierania tlenu ( z
0.014 do 0.0413 mV/s)
Oznaczanie aktywności całego łańcucha
fotosyntetycznego – pomiar pobierania tlenu
w obecności DBMIB (5mM)
DBMIB - inhibitor kompleksu cytochromów cyt.b
6
f
[ odpowiedzialnego za przenoszenie elektronów z PSII na PSII.
•Dodanie inhibitora powoduje znaczny
spadek aktywności całego łańcucha
fotosyntetycznego i spadek szybkości
pobierania tlenu ( z 0.014 do 0.0073
mV/s)
Oznaczanie aktywności PSI z DCMU
• Oznaczanie aktywności – do
momentu wyczerpania tlenu w
mieszaninie reakcyjnej.
•Wyznaczenie szybkości
pobierania tlenu przez układ w
obecności DCMU- inhibitora
fotosystemu PSII
Aktywność fotosystemu PSI jest wyższa od aktywności fotosystemu PSII.
Szybkość pobierania tlenu wynosi 0.0843, w przypadku całego łańcucha
fotosyntetycznego szybkość ta była wielokrotnie niższa- 0.014 mV/s.
TMPD- donor elektronów; metylowiologen- akceptor elektronów
