METODY IZOLACJI

KOMÓREK UKŁADU

IMMUNOLOGICZNEGO

Ćwiczenie
1

Materiał biologiczny stosowany

do izolacji

komórek układu

immunologicznego:

-

krew obwodowa

- płyny ustrojowe (wysięk otrzewnowy)
- tkanki lite (np. migdałki, węzły chłonne)
- narządy (np. wątroba, płuca)

Izolacja komórek układu
immunologicznego
z tkanek litych:

-

rozdrobnienie mechaniczne na małe fragmenty

- trawienie skrawków tkanki za pomocą
enzymów np. kolagenaza, pronaza, DNA-za

- oddzielenie zawiesiny komórek od fragmentów
tkanki przesiewając przez odpowiednie sita lub
filtry

I Pobieranie i przechowywanie krwi

do izolacji komórek układu

immunologicznego:

Krew obwodowa:



Antykoagulanty:

- heparyna w stężeniu 20-50 IU/ml

- cytrynian sodu 3,8 -5 %
- wersenian sodu (EDTA) 4 mM



Płyny do płukania:

- płyn Ringera, płyn PBS (buforowana fosforami sól

fizjologiczna)



Podłoża odżywcze

:

- zawierają podstawowe aminokwasy i białka oraz sole
mineralne, witaminy, mikroelementy,

- czasem wzbogacone dodatkiem 10-20% surowicy cielęcej,
płodowej cielęcej lub mieszanej homologicznej lub autologicznej.

- płyn Parkera, płyn Eagla, płyn Hanksa

- podłoże MEM, podłoże RPMI 1640

II Metody
izolacji

1) Metoda sedymentacji

 wykorzystuje zjawisko zróżnicowanej szybkości

opadania poszczególnych rodzajów krwinek w
zawiesinie

- czas inkubacji od 1 do 2 godz. w temp. 37

0

C

- dodanie roztworu dekstranu wielkocząsteczkowego
(Dextran 500), 3% żelatyny w NaCL lub
1,2% alkoholu poliwinylowego przyspiesza proces
(czas inkubacji 25 min)

limfocyty
monocyty
granulocyty

erytrocyt
y

2) Izolowanie komórek w gradientach
gęstości



wykorzystuje różnice pomiędzy gęstością względną

użytego gradientu a wielkością i masą izolowanych
komórek
 gradienty gęstości:

- posiadają odpowiednio dobraną gęstość

względna,

- posiadają niską lepkość,

- są izoosmotyczne względem krwi,

- nie osłabiają żywotności komórek

- nie przenikają do wnętrza komórek

- są łatwe do wypłukania z oczyszczonej

zawiesiny

komórkowej.

2.1. Izolacja limfocytów w gradiencie
jednostopniowym

Ficoll, Isopaque,

Hypaque

(1,077 g/ml)

wirowanie

Erytrocyty i
granulocyty

Supernatant

Interfaza z

komórkami

jednojądrzastymi

Supernat
ant

Interfaza 1

z komórkami

jednojądrzastymi

Interfaza 2

z

granulocyta

mi

Erytroc
yty

• Gradisol G (Mieszanina Uropoliny i
dekstranu) 1,115 g/ml

• Histopaq 1,119 g/ml i Histopaq 1,077 g/ml
• Percoll 1,076 g/ml i Percoll 1,064 g/ml

wirowanie

2.2. Izolacja limfocytów w gradiencie
dwustopniowym

3. Metody
adherencyjne

- wykorzystują zdolność przylegania do powierzchni szkła i plastiku
niektórych komórek układu immunologicznego (szczególnie
monocytów, granulocytów i limfocytów B)

- stosuje się kolumny wypełnione watą nylonową, watą szklaną,
cząsteczkami wielocukru (np.. Sephadexem D-10) lub
płytki poliestyrenowe Petriego (m.in. do rozdziału limfocytów B i T)

60 min
inkubacji w
temp. 37

0

C

limfocyty

monocy
ty

30 min
inkubacji
w temp.
4

0

C

monocy
ty

limfocyty

4. Metody z

zastosowaniem

immunoabsorbentów

Immunoabsorbenty:

- Kulki szklane, kulki plastikowe, cząsteczki
agarozy,

cząsteczki

poliakrylamidu

opłaszczone

przeciwciałami

skierowanymi

przeciwko antygenom powierzchniowym danej
populacji komórek

Metoda immunoadsorbcji komórek na

fazie stałej (panning)

- wykorzystywana do rozdziału limfocytów T na
subpopulacje CD4 i CD8

4. Izolacja komórek z zastosowaniem

kulek paramagnetycznych (magnetic

beads)

- służą do uzyskania czystych populacji komórek z wstępnie
uzyskanej mieszaniny

Odpłukane czyste

eozynofile

Inkubacja

granulocytów

z

przeciwciałami

anty-

neutrofilowymi

Oddzielenie

populacji

neutrofilów

w polu

magnetyczny

m

kuleczki

magnetyczne

opłaszone

przeciwciałami

anty-

neutrofilowymi

5. Izolacja za pomocą fluorescencyjnie

aktywowanego „sortera”

komórek (FACS) (cytometr przepływowy)

6. Izolacja limfocytów T przy

pomocy zastosowania testu

rozetowego

Testy rozetowe zaliczane są do grupy biologicznych

metod izolacji

Ocena żywotności i czystości wyizolowanych
komórek

Żywotność

- oceniana metodą przeżyciowego barwienia błękitem
trypanu, który ma zdolność wnikania jedynie do wnętrza
martwych komórek (Norma ok. 100%)

Czystość

- oceniana w preparacie wybarwionym metodą Giemsy
(licząc 100 kolejnych komórek i wyrażając liczbę badanych
komórek w procentach)

cdn…