Metody izolacji leukocytów

Źródłem komórek immunologicznie kompetentnych do badań w tym oceny

ich aktywności może być krew obwodowa, centralne (grasica, szpik) i

obwodowe (śledziona, węzły chłonne) narządy limfatyczne lub popłuczyny z

dróg oddechowych.

• W przypadku krwi by zahamować procesy krzepnięcia stosuje się między

innymi: heparynę (20 IU/ml krwi), cytrynian sodu (3,8-5%), wersenian sodu

(4 mM) lub kulki szklane (przy mieszaniu włóknik osadza się na kulkach).

Krew z antykoagulantem lub odwłóknioną, można następnie poddać dalszej

analizie.

• Narządy limfatyczne pobrane od zwierząt odpłukuję się w PBS od resztek

krwi, rozdrabnia i przeciska przez sito nylonowe (25-50 m) lub wyczesuje

się igłami preparacyjnymi, uwalniając komórki immunokompetentne.

• Komórki szpiku kostnego można uzyskać poprzez wymywanie roztworem soli

fizjologicznej wnętrza, odciętej z obu stron, kości udowej za pomocą

strzykawki z igłą. Uzyskuje się w ten sposób zawiesinę komórek o różnym

stopniu dojrzałości i kompetencji immunologicznej.

• Materiał z dróg oddechowych można uzyskać na drodze płukania

oskrzelowo-pęcherzykowego (bronchoalveolar lavage - BAL) roztworem soli

fizjologicznej, przeprowadzanym podczas standardowej bronchoskopii.

Uzyskane komórki zawiesza się w pełnym, standardowym płynie

hodowlanym.

Sedymentacja

• Sedymentacja spontaniczna - najprostsza metoda (1-2

godzin w 37

0

C).

• Sedymentacja indukowana - poprzez dodatek substancji o

dużej lepkości (roztwory dekstranu wielkocząsteczkowego,

0,1-1,5% metylceluloza, 3% żelatyna, 1,2% alkohol

poliwinylowy). Opłaszczone erytrocyty szybciej

sedymentują, a lżejsze leukocyty można wykryć w

supernatancie. W celu uzyskania określonych populacji

leukocytów przeprowadza się kolejne etapy izolacji.

Wirowanie w gradiencie

gęstości

Najczęściej stosowanym gradientem gęstości jest mieszanina Ficoll-Isopaque lub

Histopaque. Służy do izolacji limfocytów z krwi i płynów ustrojowych. Na

określoną objętość gradientu gęstości nawarstwia się delikatnie zawiesinę

komórek (np: pełną krew). Po odwirowaniu, zbiera się interfazę (warstwa

komórek na granicy gradientu i płynu nawarstwionego) bogatą w limfocyty i

monocyty. Przez warstwę przechodzą erytrocyty i granulocyty, które zbierają się

na dnie probówki. Warunkiem uzyskania odpowiedniego rozdziału elementów

morfotycznych krwi jest zastosowanie preparatów o odpowiedniej gęstości.
Granulocyty z osadu można odzyskać poprzez lizę erytrocytów na drodze szoku

osmotycznego przy pomocy 0,83% roztworu chlorku amonu (0,14 M NH

4

Cl z

buforem TRIS, pH 7,4) w 37

0

C przez 5 minut lub przy użyciu wody destylowanej

(1 część płynu hodowlanego i 2 części wody).

Gradient dwustopniowy

Do izolacji granulocytów z

pełnej krwi wykorzystuje się

wirowanie w dwustopniowym

gradiencie gęstości,

składającym się z Histopaque

1077 i Histopaque 1119. Krew

nawarstwiona na gradient

sporządzony z dwóch równych

objętości tych związków wiruje

się w temperaturze pokojowej

przez około 30 min. przy

700xg. Uzyskuje się 2

interfazy: górną, zawierającą

limfocyty i dolną, zawierającą

granulocyty. Erytrocyty

sedymentują na dno

probówki.

Wielowarstwowy gradient

percoll’u

Percoll jest to zawiesina kuleczek
(15-30 nm) krzemionki pokrytych
poliwinylopyrolidonem (PVP).
Poszczególne warstwy
przygotowuje się rozpuszczając
Percoll (1,130 g/ml) w płynie
fizjologicznym.
Gradient wielowarstwowy służy
do rozdziału subpopulacji
leukocytów np: limfocytów B i T,
komórek NK, monocytów oraz
granulocytów. Izolowane komórki
zatrzymują się na odpowiednich
warstwach o określonej gęstości
w zależności od swojej masy

Metody adherencyjne

Adherencją nazywamy zdolność przylegania do szkła bądź plastiku części komórek

krwi, zwłaszcza monocytów, makrofagów, granulocytów i limfocytów B.

Komórki mogą ulegać adhezji na:

- kulkach szklanych
- płytkach Petriego (polistyrenowe)
- kolumnach z waty nylonowej lub szklanej, z cząsteczkami wielocukru (Sephadex G-

10) lub poliakrylamidu

Zawiesinę komórek inkubuje się na nośniku około 30-45 min. w temp. 37

o

C a

następnie wypłukuje się medium hodowlanym komórki nie przylegające (limfocyty

T). Poprzez inkubację zawartości kolumny (szczególnie szklanej lub nylonowej) w 50

% FBS następuje uwalnianie zaadsorbowanych komórek.

Immunoabsorpcja

Immunoadsorbenty (nośniki),

są to kulki (szklane,

plastikowe) cząsteczki agarozy,

sepharozy, poliakrylamidu

opłaszczone przeciwciałami

skierowanymi przeciw

antygenom powierzchniowym

danej populacji komórek.

Immunoadsorbenty można

umieszczać w szklanych

kolumnach lub innych

nośnikach. Podczas inkubacji

następuje wysokoselektywne

łączenie komórek z

immunoadsorbentem. Aby

uwolnić komórki ze złoża

przepłukuje się je dużą ilością

odpowiedniego eluentu: EDTA,

trypsyna, FBS

Immunofenotypowanie

Wykorzystując immunoabsorpcję

można otrzymać określone subbopulację

komórek. Przeciwciała skierowane

przeciw markerom CD (cluster of

differentiation) określonej populacji,

powodują związanie komórek z

nośnikiem. Proces ten można powtarzać

wielokrotnie, otrzymując komórki o ściśle

określonym składzie CD.

Technika negatywnej selekcji

Związanie Ig z antygenem w

obecności białek układu dopełniacza

doprowadza do lizy komórek. W wyniku

tego po przejściu przez kolumnę w

zawiesinie pozostaje populacja komórek

nienaruszonych , oraz resztki komórek

martwych w wyniku działania białek

układu dopełniacza.

Wykorzystanie fagocytozy

Wykorzystanie właściwości fagocytarnych monocytów,

makrofagów, granulocytów i komórek dendrytycznych pozwala

na ich wyodrębnienie z badanego materiału. W procesie

fagocytozy obce cząsteczki (karbonylek żelaza lub lateks) zostają

otoczone wypustkami błony komórkowej i wchłonięte do wnętrza

pod postacią fagosomu. Następnie komórki te oddziela się od

przy pomocy magnesu (żelazo) lub po przez wirowanie (lateks).

Izolacja magnetyczna z

wykorzystaniem Ig

Nieco inną metodą oczyszczania danej

populacji komórek jest metoda izolacji

magnetycznej z zastosowaniem

paramagnetycznych cząstek polistyrenowych.

Cząstki te o średnicy kilku mikrometrów opłaszcza

się przeciwciałami i inkubuje z komórkami.

Następuje wówczas wiązanie miedzy Ig na

nośniku a komórkami mającymi na powierzchni

odpowiednie antygeny. Komórki związane z

cząsteczkami nośnika izoluje się z zawiesiny za

pomocą magnesu.

Cytometria przepływowa

Cytometria przepływowa (Flow

cytometry – FCM) to wysoce

specjalistyczna metoda analityczna,

umożliwiająca jednoczesny pomiar

wielu biochemicznych i biofizycznych

właściwości zawieszonych w cieczy

komórek i ich składowych. Technika

ta opiera się na zastosowaniu

przeciwciał monoklonalnych

sprzężonych z barwnikami

fluorescencyjnymi lub bezpośrednim

barwieniu komórek.

Nowoczesne

cytometry wyposażone są w

przynajmniej jeden laser, emitujący

światło o określonej długości fali

(488nm). Pomiar polega na detekcji i

analizie światła rozproszonego przez

komórki oraz fluorescencji

emitowanej na skutek wzbudzenia

barwników. Dostarcza to Informacji

na temat wielkości, wewnętrznej

złożoności (ziarnistości) oraz składzie

antygenowym badanych komórek.

Wykorzystując FCM, możemy

określić ilościowo populacje i

subpopulacje komórek, ich cechy

morfologiczne oraz stan

czynnościowy.

Zasada działania i budowa cytometru

przepływowego

Cytometr przepływowy składa się z

układów: optycznego, elektronicznego,

powietrznego oraz układu transportu

cieczy. Znakowane komórki formowane

są w cienki strumień, naświetlany

wiązką lasera. Światło ulega

rozproszeniu na komórkach a w

przypadku zastosowania

fluorochromów dochodzi również do

jego emisji. Zmiany w natężeniu

światła mierzone są za pomocą

odpowiednich detektorów. Główny

(FSC) rejestruje rozproszenie zgodnie z

kierunkiem padania wiązki laserowej,

pozostałe (SSC) rejestrują rozproszenie

pod kątem 90° lub innym.
Promieniowanie rozproszone zgodnie z

kierunkiem wiązki rośnie ze wzrostem

rozmiaru cząsteczki i nie zależy od jej

kształtu i współczynnika załamania

światła, tak więc określa wielkość

komórki. Natomiast promieniowanie

rozpraszane pod kątem 90° zależy od

wielkości i kształtu cząsteczki i

różnicuje komórki ze względu na ich

kształt i wewnętrzną ziarnistość.

Powstałe sygnały elektryczne

wzmacnia się, formuje i przesyła do

komputera celem dalszej obróbki,

przechowywania i analizy.

Testy rozetkowe limfocytów

Limfocyty T posiadają na swej powierzchni

receptory (antygen CD2), dla krwinek

czerwonych barana co umożliwia

spontaniczne tworzenie rozet z tymi

krwinkami (rozetki spontaniczne E-

bezpośrednie). Rozetki można oddzielić od

pozostałych komórek poprzez wirowanie w

gradiencie stężenia a następnie poprzez

usunięcie erytrocytów na drodze szoku

osmotycznego. Około 70% limfocytów krwi

obwodowej tworzy rozetki spontaniczne.
Rozetki pośrednie (EA) powstają poprzez

łączenie się fragmentu Fc

immunoglobulin opłaszczających

erytrocyty, ze swoistymi receptorami

występującymi na powierzchni limfocytów B

(oraz na makrofagach i neutrofilach).

Rozetki EA tworzy około 30% leukocytów

krwi.
Rozetki EAC powstają przez połączenie

kompleksu erytrocyt-przeciwciało-

dopełniacz z obecnym na limfocycie B

receptorem dla składnika C3

dopełniacza. Receptory dla składników C3

dopełniacza posiadają także monocyty i

neutrofile. Rozetki EAC tworzy 10-20 %

leukocytów.

Badania izolowanych leukocytów opierają się głownie na określaniu aktywności

cytotoksycznej komórek, badaniu transformacji balstycznej, wykrywaniu

obecności cytokin i określaniu zdolności fagocytarnych i chemotaktycznych.
W celu sprawdzenia żywotności wyizolowanych komórek przeprowadza się

barwienie przyżyciowe: błękitem trypanu, eozyną, nigrozyną. Natomiast dla

ustalenia jednorodności uzyskanych populacji komórkowej, sprawdza się rozmaz

barwiony metodą May-Grunwalda Giemzy lub przeprowadza się test

immunofluorescencji powierzchniowej (IMF) przy użyciu przeciwciał

monoklonalnych.

A- limfocyt
B- granulocyt
C- monocyt