Ćwiczenie 2 Metody izolacji komórek

background image

METODY IZOLACJI KOMÓREK

UKŁADU

IMMUNOLOGICZNEGO

Ćwiczenie
2

background image

Metody izolacji

1) Metoda sedymentacji

wykorzystuje zjawisko zróżnicowanej szybkości

opadania poszczególnych rodzajów krwinek w
zawiesinie

- czas inkubacji od 1 do 2 godz. w temp. 37

0

C

- dodanie roztworu dekstranu wielkocząsteczkowego
(Dextran 500), 3% żelatyny w NaCL lub
1,2% alkoholu poliwinylowego przyspiesza proces
(czas inkubacji 25 min)

limfocyty
monocyty
granulocyty

erytrocyt
y

background image

2) Izolowanie komórek w gradientach
gęstości

wykorzystuje różnice pomiędzy gęstością względną

użytego gradientu a wielkością i masą izolowanych
komórek
gradienty gęstości:

- posiadają odpowiednio dobraną gęstość

względna,

- posiadają niską lepkość,

- są izoosmotyczne względem krwi,

- nie osłabiają żywotności komórek

- nie przenikają do wnętrza komórek

- są łatwe do wypłukania z oczyszczonej

zawiesiny

komórkowej.

background image

2.1. Izolacja limfocytów w gradiencie
jednostopniowym

Ficoll, Isopaque,

Hypaque

(1,077 g/ml)

wirowanie

Erytrocyty i
granulocyty

Supernatant

Interfaza z

komórkami

jednojądrzastymi

background image

Supernat
ant

Interfaza 1

z komórkami

jednojądrzastymi

Interfaza 2

z

granulocyta

mi

Erytroc
yty

• Gradisol G (Mieszanina Uropoliny i
dekstranu) 1,115 g/ml

• Histopaq 1,119 g/ml i Histopaq 1,077 g/ml
• Percoll 1,076 g/ml i Percoll 1,064 g/ml

wirowanie

2.2. Izolacja limfocytów w gradiencie
dwustopniowym

background image

3. Metody
adherencyjne

- wykorzystują zdolność przylegania do powierzchni szkła i plastiku
niektórych komórek układu immunologicznego (szczególnie
monocytów, granulocytów i limfocytów B)

- stosuje się kolumny wypełnione watą nylonową, watą szklaną,
cząsteczkami wielocukru (np.. Sephadexem D-10) lub
płytki poliestyrenowe Petriego (m.in. do rozdziału limfocytów B i T)

60 min
inkubacji w
temp. 37

0

C

limfocyty

monocy
ty

30 min
inkubacji
w temp.
4

0

C

monocy
ty

limfocyty

background image

4. Metody z

zastosowaniem

immunoabsorbentów

Immunoabsorbenty:

- Kulki szklane, kulki plastikowe, cząsteczki
agarozy,

cząsteczki

poliakrylamidu

opłaszczone

przeciwciałami

skierowanymi

przeciwko antygenom powierzchniowym danej
populacji komórek

background image

Metoda immunoadsorbcji komórek na

fazie stałej (panning)

- wykorzystywana do rozdziału limfocytów T na
subpopulacje CD4 i CD8

background image

4. Izolacja komórek z zastosowaniem

kulek paramagnetycznych (magnetic

beads)

- służą do uzyskania czystych populacji komórek z wstępnie
uzyskanej mieszaniny

Odpłukane czyste

eozynofile

Inkubacja

granulocytów

z

przeciwciałami

anty-

neutrofilowymi

Oddzielenie

populacji

neutrofilów

w polu

magnetyczny

m

kuleczki

magnetyczne

opłaszone

przeciwciałami

anty-

neutrofilowymi

background image

5. Izolacja za pomocą fluorescencyjnie

aktywowanego „sortera”

komórek (FACS) (cytometr przepływowy)

background image

6. Izolacja limfocytów T przy

pomocy zastosowania testu

rozetowego

Testy rozetowe zaliczane są do grupy biologicznych

metod izolacji

background image

Ocena żywotności i czystości wyizolowanych
komórek

Żywotność

- oceniana metodą przeżyciowego barwienia błękitem
trypanu, który ma zdolność wnikania jedynie do wnętrza
martwych komórek (Norma ok. 100%)

Czystość

- oceniana w preparacie wybarwionym metodą Giemsy
(licząc 100 kolejnych komórek i wyrażając liczbę badanych
komórek w procentach)

background image

cdn…


Document Outline


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
ćw1-metody izolacji Ig-wysalanie, immunologia, ćwiczenia
ćw1- metody izolacji IgM-sączenie molekularne, immunologia, ćwiczenia
ćw1-metody izolacji Ig-wysalanie, immunologia, ćwiczenia
OKREŚLENIA ĆWICZEŃ, metodyka ruchu
Tematyka ćwiczeń, Metody badań pedagogicznych
Metody izolowania komórek
cwiczenie 3 inwertaza (i) izolacja enzymu 05 05 2014
Metody izolacji leukocytów
Izolacja komórek, ✔ ★Weterynaria, weta, dump
Ćwiczenie 2 Metody dekontaminacji, Mikrobiologia
Ćwiczenia 1, Metody badań
metody izolacji
Cwiczenie 4 Metodyka cz II id 99491
Metodyka nauczania rzutu oszczep - zestaw ćwiczeń, Metodyka nauczania rzutu oszczep
METODYKA Z GLEBSZA NIEPELNOSPRAWNOSCIA INTELEKTUALNA - program wykladow i cwiczen, Metodyka nauczani
Ćwiczenia metodyka sciaga, Materiały 2 rok Fizjoterapi, Kształcenie ruchowe i metodyka nauczania ruc
Program 2011, UE Katowice, Gospodarka Turystyczna Mgr I rok, prognozowanie cwiczenia, Metody Prognoz
1 Proces?dawczy ćwiczenia metody

więcej podobnych podstron