METODY IZOLACJI KOMÓREK
UKŁADU
IMMUNOLOGICZNEGO
Ćwiczenie
2
Metody izolacji
1) Metoda sedymentacji
wykorzystuje zjawisko zróżnicowanej szybkości
opadania poszczególnych rodzajów krwinek w
zawiesinie
- czas inkubacji od 1 do 2 godz. w temp. 37
0
C
- dodanie roztworu dekstranu wielkocząsteczkowego
(Dextran 500), 3% żelatyny w NaCL lub
1,2% alkoholu poliwinylowego przyspiesza proces
(czas inkubacji 25 min)
limfocyty
monocyty
granulocyty
erytrocyt
y
2) Izolowanie komórek w gradientach
gęstości
wykorzystuje różnice pomiędzy gęstością względną
użytego gradientu a wielkością i masą izolowanych
komórek
gradienty gęstości:
- posiadają odpowiednio dobraną gęstość
względna,
- posiadają niską lepkość,
- są izoosmotyczne względem krwi,
- nie osłabiają żywotności komórek
- nie przenikają do wnętrza komórek
- są łatwe do wypłukania z oczyszczonej
zawiesiny
komórkowej.
2.1. Izolacja limfocytów w gradiencie
jednostopniowym
Ficoll, Isopaque,
Hypaque
(1,077 g/ml)
wirowanie
Erytrocyty i
granulocyty
Supernatant
Interfaza z
komórkami
jednojądrzastymi
Supernat
ant
Interfaza 1
z komórkami
jednojądrzastymi
Interfaza 2
z
granulocyta
mi
Erytroc
yty
• Gradisol G (Mieszanina Uropoliny i
dekstranu) 1,115 g/ml
• Histopaq 1,119 g/ml i Histopaq 1,077 g/ml
• Percoll 1,076 g/ml i Percoll 1,064 g/ml
wirowanie
2.2. Izolacja limfocytów w gradiencie
dwustopniowym
3. Metody
adherencyjne
- wykorzystują zdolność przylegania do powierzchni szkła i plastiku
niektórych komórek układu immunologicznego (szczególnie
monocytów, granulocytów i limfocytów B)
- stosuje się kolumny wypełnione watą nylonową, watą szklaną,
cząsteczkami wielocukru (np.. Sephadexem D-10) lub
płytki poliestyrenowe Petriego (m.in. do rozdziału limfocytów B i T)
60 min
inkubacji w
temp. 37
0
C
limfocyty
monocy
ty
30 min
inkubacji
w temp.
4
0
C
monocy
ty
limfocyty
4. Metody z
zastosowaniem
immunoabsorbentów
Immunoabsorbenty:
- Kulki szklane, kulki plastikowe, cząsteczki
agarozy,
cząsteczki
poliakrylamidu
opłaszczone
przeciwciałami
skierowanymi
przeciwko antygenom powierzchniowym danej
populacji komórek
Metoda immunoadsorbcji komórek na
fazie stałej (panning)
- wykorzystywana do rozdziału limfocytów T na
subpopulacje CD4 i CD8
4. Izolacja komórek z zastosowaniem
kulek paramagnetycznych (magnetic
beads)
- służą do uzyskania czystych populacji komórek z wstępnie
uzyskanej mieszaniny
Odpłukane czyste
eozynofile
Inkubacja
granulocytów
z
przeciwciałami
anty-
neutrofilowymi
Oddzielenie
populacji
neutrofilów
w polu
magnetyczny
m
kuleczki
magnetyczne
opłaszone
przeciwciałami
anty-
neutrofilowymi
5. Izolacja za pomocą fluorescencyjnie
aktywowanego „sortera”
komórek (FACS) (cytometr przepływowy)
6. Izolacja limfocytów T przy
pomocy zastosowania testu
rozetowego
Testy rozetowe zaliczane są do grupy biologicznych
metod izolacji
Ocena żywotności i czystości wyizolowanych
komórek
Żywotność
- oceniana metodą przeżyciowego barwienia błękitem
trypanu, który ma zdolność wnikania jedynie do wnętrza
martwych komórek (Norma ok. 100%)
Czystość
- oceniana w preparacie wybarwionym metodą Giemsy
(licząc 100 kolejnych komórek i wyrażając liczbę badanych
komórek w procentach)
cdn…