Zakład Mikrobiologii i Laboratoryjnej Immunologii Medycznej

Metody izolowania

komórek krwi obwodowej

Wybór metody izolacji komórek opiera się na uwzględnieniu:

• rodzaju komórek, które chcemy wyizolować

• wielkości odzysku uzyskanych komórek

• czystość uzyskanych komórek

Prawidłowo przeprowadzona izolacja powinna pozwolić na:

• ocenę sprawności funkcjonalnej komórek

• założenie hodowli komórek.

Źródła komórek:

• krew obwodowa

• płyny ustrojowe

• tkanki – migdałki, węzły chłonne, grasica, śledziona…

I.

Metody izolowania komórek z narządów:

1) mechaniczne
2) enzymatyczne

Ad.1
Mechaniczne rozdrabnianie wyizolowanych narządów,
homogenizacja (przecieranie na sicie, wytłaczanie),
np. izolowanie leukocytów z grasicy, śledziony,
węzłów chłonnych.

Ad.2
Stosowanie enzymów np. trypsyny, powodujących
rozluźnienie tkanki łącznej i uwolnienie komórek do
supernatantu.

grasica

śledziona

II.

Metody izolowania frakcji komórek z krwi obwodowej



Metody biologiczne:
1- wykorzystanie właściwości fagocytarnych komórek
2- wykorzystanie właściwości adhezyjnych komórek
3- rozdział limfocytów T i B na kolumnach z perełkami szklanymi lub wełną nylonową
4- technika negatywnej selekcji
5- rozdział komórek za pomocą chromatografii powinowactwa
6- izolacja z narządów in vivo



Metody fizyko-chemiczne:
1- Metoda sedymentacji
2- Metoda adherencyjna
3- Izolowanie komórek w gradientach gęstości
4- Izolacja komórek z zastosowaniem kulek paramagnetycznych (magnetic beads)
5- Izolacja metodą immunoadsorbcji komórek na fazie stałej (panning)
6- Izolacja przy pomocy sortera komórkowego

Cele pobierania krwi

•

Aby uzyskać surowicę, plazmę, które stanowią materiał badany do różnych oznaczeń

laboratoryjnych tj. oznaczanie poziomu przeciwciał, antygenów

•

Aby wyizolować komórki: erytrocyty, leukocyty itp.

W celu wyizolowania komórek, krew pobieramy na substancje zabezpieczającą

krzepnięciu, na tzw. antykoagulant:

 EDTA (wersenian dwusodowy)
 cytrynian trójsodowy
 Heparyna

•

w przypadku małych zwierząt (myszy, świnki, króliki) krew pobiera się prosto z serca

•

w przypadku zwierząt większych np. owca, krew pobiera się poprzez wkłucie się do

żyły szyjnej

•

człowiek - krew obwodową pobiera się zwykle z żyły łokciowej

Krew

Tkanka złożona z

elementów morfotycznych

(upostaciowionych) oraz

plazmy

. Całkowita

objętość krwi krążącej wynosi ok.

5 litrów, ponad połowę stanowi osocze, ok. 45%

krwinki czerwone i ok. 1% krwinki białe i płytki krwi

PLAZMA:
to płyn prawie w całości złożony z wody, zawiera:
witaminy, mikro- i makroelementy, produkty

metabolizmu komórek, a także fibrynogen, nie zawiera

komórek

OSOCZE:
to plazma w której zawieszone są elementy morfotyczne

krwi

SUROWICA:
frakcja krwi pozbawiona zarówno elementów

morfotycznych oraz fibrynogenu i czynników krzepnięcia

krwi (pozostałość po oddzieleniu się skrzepu).

Metody izolowania frakcji komórek z krwi obwodowej

 Metody biologiczne

:

1- wykorzystanie właściwości fagocytarnych komórek
2- wykorzystanie właściwości adhezyjnych komórek
3- rozdział limfocytów T i B na kolumnach z perełkami szklanymi lub

wełną nylonową

4- technika negatywnej selekcji
5- rozdział komórek za pomocą chromatografii powinowactwa
6- izolacja z na rządów in vivo

Ad. 1 Metoda fagocytarna:

- służy do izolowania komórek monocytarnych z frakcji monocytaro-

makrofagowej i fibroblastów, do izolacji granulocytów

- metoda podobna do separacji magnetycznej
- komórki żerne miesza się z karbozydkiem żelaza i przenosi do zestawu

z magnesem, potrzebne nam komórki przytwierdzają się do ścianek

naczynia, a zebrany nadsącz odlewamy

Ad. 2 Metoda adhezyjna:

- naturalna adhezja (przyleganie) niektórych komórek do szkła lub

plastiku w temperaturze 37ºC

- komórki te w naturalny sposób odklejają się od tych materiałów w 4ºC

Ad.3 rozdział limfocytów

- stosuje się kolumny z perełkami lub wełną nylonową
- wykorzystuje się tu także właściwości adhezyjne
- rozfrakcjonowanie limfocytów na subpopulacje
- limfocyty B adherują do wełny, a limfocyty T przechodzą z roztworem

przez wełnę

- limfocyty T można odzyskać z wełny poprzez mechaniczne odpłukiwanie

podłożem hodowlanym

Ad.4 technika negatywnej selekcji

- wykorzystuje się cytotoksyczną surowicę odpornościową oraz

dopełniacz (komplement)

- surowica skierowana jest przeciw określonej frakcji komórek
- następuje liza komórek, które nas nie interesują

Toksyczne przeciwciało + dopełniacz + komórka swoista  liza

Ad.5 rozdział komórek za pomocą chromatografii powinowactwa

- z zastosowaniem złoża np.. Sephadex, (mikrogranulek)
- wykorzystuje się naturalną adherencję komórek, tropizm do Sephadex’u
- można użyć kolumn z przeciwciałami skierowanymi przeciwko określonym frakcjom

komórek

Ad.6 izolacja komórek z narządów in vivo

- narządy jako źródło określonych komórek
- można prowokować gromadzenie się komórek w jamach ciała, dotyczy to głównie

zwierząt laboratoryjnych

- źródło limfocytów: grasica, śledziona, węzły chłonne
- źródło granulocytów i monocytów: u zwierząt przez szczepienie dootrzewnowe

neutralnymi substancjami np.. Peptonem. Granulocyty możemy uzyskać po 4-18

godzinach. Frakcję makrofagową uzyskujemy po 72 godzinach od zaszczepienia

Sephadex

Metody izolowania frakcji komórek z krwi obwodowej



Metody biologiczne



Metody fizyko-chemiczne:

1- Metoda sedymentacji
2- Metoda adherencyjna
3- Izolowanie komórek w gradientach gęstości
4- Izolacja komórek z zastosowaniem kulek paramagnetycznych (magnetic beads)
5- Izolacja metodą immunoadsorbcji komórek na fazie stałej (panning)
6- Izolacja przy pomocy sortera komórkowego

Ad1) Metoda sedymentacji

• metoda najprostsza

• wykorzystuje zjawisko zróżnicowanej szybkości
opadania poszczególnych rodzajów krwinek w
zawiesinie

• pobraną na antykoagulant krew poddaje się
spontanicznej sedymentacji 1-2h w 37 C

• erytrocyty opadają na dno probówki

• przyśpieszenie procesu:

• dekstran wielkocząsteczkowy (Dextran 500)

• 3% żelatyny w NaCl lub z 1,2% alkoholu
poliwinylowego

Izolacja czystych populacji leukocytarnych wymaga

– dalszych metod izolacji

(fizykochemicznych i biologicznych)

Ad 2) Metody adherencyjne

•

Wykorzystują zdolność przylegania komórek do powierzchni szkła i

plastiku ( gł. monocyty)

Izolacja monocytów z frakcji komórek jednojądrowych

• inkubacja komórek na płytkach w medium z surowicą

• 60 min 37 C

• do powierzchni płytki „przyklejają” się monocyty,

limfocyty pozostają w zawiesinie i łatwo je odpłukać

• monocyty po inkubacji w 4 C przez 30 min odklejają się
od płytki

Rozdział limfocytów B i T

• inkubacja w kolumnach z watą nylonową lub wypełnionych
sephadexem D-10

• adherencji ulegają limfocyty B, limfocyty T można odpłukać

Ad 3) Izolowanie komórek w gradientach gęstości

• wykorzystuje różnice w wielkości i ciężarze
właściwym izolowanych komórek

• mieszanina rozdzielająca (gradient) o specjalnie
dobranej gęstości względnej tworzy „sito”, które:

• zatrzymuje na swej powierzchni komórki
lżejsze

• „przepuszcza” komórki cięższe (erytrocyty,
granulocyty)

Cechy gradientu:



niska lepkość



izoosmotyczny względem komórek



nie powinien wnikać do komórek i

osłabiać ich żywotności



łatwy do odpłukania

Rodzaje gradientów

:

• gradient jednostopniowy

mieszanina Ficollu (hydrofilowy polimer sacharozy) i
Isopaque

(sodium metrioate) o gęstości 1,077

wprowadzona przez Boyum do izolacji limfocytów.

• na warstwę gradientu (ok. 3ml)
nawarstwić pełną krew
z antykoagulantem (5ml)

• wirowanie w temp. pokojowej przy 400g
przez 20 min

• erytrocyty, granulocyty, martwe
komórki opadają na dno probówki

• interfaza – komórki
jednojądrowe (limfocyty,
monocyty)

Przed

wirowaniem

Po wirowaniu

Plazma

Interfaza z
komórkami
PBML

Erytrocyty i

granulocyty

Krew

Rodzaje gradientów cd…

•

gradient dwustopniowy

– nawarstwione na siebie preparaty

Histopaq 1,119 i Histopaq 1,077

• wirowanie – 30 min przy 700g w temp. pokojowej

• 2 interfazy:

• pierwsza od góry – limfocyty i monocyty

• druga – granulocyty

• erytrocyty – opadają na dno probówki

Gradisol G

• mieszanina Uropoliny i dekstranu

• jednostopniowy gradient

• po wirowaniu 25min przy 400g – 2 interfazy

Percoll (mikrokuleczki koloidalnej krzemionki pokrytych poliwinylopyrolidonem)

– dowolne wielostopniowe gradienty (rozcieńczając NaCl – 0,15nM)

Ad 4) Izolacja komórek z zastosowaniem kulek paramagnetycznych

(magnetic beads)

• Uzyskiwanie czystych populacji komórek z wstępnie uzyskanej mieszaniny

• Wyizolowane komórki inkubowane są z kulkami magnetycznymi
opłaszczonymi przeciwciałami przeciw Ag (Antigen

)

powierzchniowym komórek

Rozdział frakcji PBML na frakcję monocytarną i limfocytarną za

pomocą sortera komórkowego MACS

Inkubacja

komórek

PBML z cząsteczkami paramagnetycznymi

(opłaszczonymi mysimi monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko ludzkiemu

CD14+)

przez 30 min temp. 4

o

C)

wirowanie

(

1400 obr/min,10 min. w temp. 4

o

C.

)

Rozdział pozytywny

=

frakcja komórek
monocytarnych (CD14+)
>zatrzymana w kolumnie LS

frakcja limfocytarna (CD14 -)
>w przesączu

Naniesienie frakcji komórek

PBML na kolumnę LS.

Frakcja komórek
monocytarnych została
usunięta z kolumny LS
(przy pomocy tłoka do
kolumny).

Ad 5) Izolacja metodą immunoadsorbcji komórek na fazie stałej (panning)

• stosowany m.in. do rozdziału limfocytów T na subpopulacje CD4 i CD8

• limfocyty T inkubuje się z Ab (Antibody – przeciwciało) monoklonalnymi np.
anty

– CD4

• zawiesinę komórek wylewa się na płytkę Petriego opłaszczoną Ab anty
mysie białko

• po inkubacji limfocyty CD4 zostają związane a limfocyty CD8 można
odpłukać

Izolacja limfocytów T przy zastosowaniu testu rozetowego E

Zaliczana do grupy biologicznych metod izolacji.

Zasada

– obecność markera CD2 na limfocytach T.

• CD2 na powierzchni limfocytów T łączy się
spontanicznie z krwinkami barana tworząc
rozety

• rozeta = limfocyt + 3 lub  krwinek

Powstałe rozetki izoluje się przez wirowanie na gradiencie Percoll.

Hemoliza krwinek czerwonych szokiem osmotycznym 

zawiesina limfocytów.

Ad 6)-

Izolacja przy pomocy sortera komórkowego (cytometr przepływowy)

Niezależnie od metody izolacji – ocena żywotności i czystości wyizolowanych
komórek.

żywotność

przyżyciowe barwienie błękitem trypanu (wnika do wnętrza martwych

komórek);

prawidłowo przeprowadzona izolacja

= 100% żywotność;

niska żywotność komórek

= nie pozwala na dalszą wiarygodną ocenę

aktywności

czystość

ocena pod mikroskopem w preparacie wybarwionym metodą Giemsy,

licząc co najmniej 100 komórek i podając procent badanych komórek.

liczba żywych komórek (opalizujące)

liczba wszystkich komórek (niebieskie+opalizujące)

X 100%

Żywotność =

Liczenie gęstości komórek w komorze Bűrkera :

1.

Przygotować komorę.

2.

Rozcieńczyć zawiesinę wyizolowanych

leukocytów w płynie Turka Bűrkera w stosunku
1:20.
3.

Zawiesinę wybarwionych komórek przenieść do

komory zgodnie z intrukcją prowadzącego
ćwiczenia.
4.Metoda liczenia:

KOMORA BŰRKERA
Do zliczania leukocytów i erytrocytów.
– głębokość komory: 0,1 mm
– duży kwadrat: 1 mm

2

– grupowy kwadrat: 0,04 mm

2

– siatka licznika z 9 dużymi kwadratami
– każdy duży kwadrat jest podzielony na 16 grupowych
– kwadraty grupowe nie są podzielone

L

k

x rozcieńczenie x 10

4

2

= l.kom/ml

L

k

– liczba komórek w dwóch dużych

kwadratach

Typy komór do

zliczania

komórek:

Komora Thoma

Komora Neubauera

Komora Bürkera

Komora Fuchs-Rosenthala

• dobór dawców przy przeszczepach – określanie
markerów powierzchniowych zgodności tkankowej.

• badanie chorób nowotworowych – izolowanie
komórek nowotworowych, określanie markerów
powierzchniowych

• badanie reakcji alergicznych – badanie aktywności
komórek układu odpornościowego na alergeny

• w opracowaniu szczepionek – badanie odpowiedzi
immunologicznej

• badanie niedoborów odporności

• immunologia rozrodu – leczenie bezpłodności

• badanie aktywności proliferacji komórek
fagocytujących

• cel diagnostyczny!!!

Cel izolowania komórek układu odpornościowego

Otrzymywanie erytrocytów

1. Świeżo pobraną krew zmieszać w stosunku 1:2 z płynem Alsever’a (glukoza,
cytrynian sodu, chlorek sodu, woda).

2. Tak przygotowaną zawiesinę można przechowywać w 4ºC przez 1-8 tygodni.

3. Przed wykorzystaniem krwinek należy 3-krotnie przepłukać je NaCl 0,85%, wirując za
każdym razem 10 minut, w 4ºC, w 2000 obr/min

.

Izolacja komórek krwi na Gradisolu:

1.

Rozcieńczyć krew w PBS bez jonów wapnia i

magnezu w stosunku 1:3
(9ml krwi + 18ml PBS)

2.

Nanieść rozcieńczoną krew na gradient, stosunek

objętościowy krew – gradient 1:2.
(2ml Gradisolu + 4ml rozcieńczonej krwi)

3.Wirowanie 20-25 min. 400 x g (1600-2000obr/min)
w temp. pokojowej

4.

Zebrać delikatnie warstwę kożuszka do nowych

probówek.

5.

Płukać dwukrotnie PBS bez jonów Ca²

+

i Mg²

+

przez 5 min. 300 x g w temp. pokojowej.

6.

Odlać supernatant i dodać 1ml PBS, wymieszać

aby powstała jednorodna zawiesina komórek.

7.

Policzyć gęstość komórek w komorze Bűrkera.