Metody badania komórek:
1. CYTOCHEMICZNE - mikroskopy
- zachowanie struktury
- wykrywają i lokalizują subst. ‘in situ’ (bez naruszenia jego struktury)
(immunocytochemia, hybrydocytochemia, autoradiografia,
metody mikroskopowe, cytochemia klasyczna)
2. BIOCHEMICZNE - ilościowa zawartość substancji i jej charakterystyka
- niszczenie struktur
- wykrywają substancje w wyciągach/homogenatach
(frakcjonowanie, elektroforeza, chromatografia, PCR, sekwencjonowanie)
Metody cytochemiczne – pozwalają na wykrycie i lokalizację badanych związków w kom. Zachowana zostaje struktura wewnętrzna komórek a produkty reakcji wykrywane są IN SITU, czyli w ich naturalnych lokalizacjach, przy użyciu mikroskopów. Produkt jest: widoczny, nierozpuszczalny i znajduje się w miejscu naturalnego występowania.
IMMUNOCYTOCHEMIA - DO WYKRYWANIA SUBSTANCJI - wysoka specyficzność metody. Wykorzystuje się: przeciwciała znakowane z np. fluorochromami, enzymami lub metalami ciężkimi (co pozwala na ich mikroskopową lokalizację).
Przy znakowaniu złotem (obserwacja w TEM).
HYBRYDOCYTOCHEMIA – DO WYKRYWANIA LOKALIZACJI DNA/RNA O OKREŚLONEJ SEKWENCJI – przy użyciu znakowanych fluorochromami, antygenami lub izotopami promieniotwórczymi Sondami (komplementarne łańcuchy).
AUTORADIOGRFIA (inna strona)
JAK ZROBIĆ IN SITU:
A/ utrwalić materiał (alkoholami, aldehydami kw.org. lub solami metali ciężkich) (niską temp./mikrofalami)
B/ odwadnianie i zatopienie materiału (w alkoholu i acetonie o rosnącym stęż.)(wprowadzenie parafiny/żywic akrylowych i epoxydowych). Przy mrożeniu ten etap pomijamy!
C/ krojenie (świetlny = 1-10ym) (elektronowy = 20-50 nm)
Metody biochemiczne – badanie ilościowej zawartości substancji badanych. Materiał zwykle podlega homogenizacji komórek i często też frakcjonowaniu wirownikiem na warstwy ze wzrastającą prędkością.
FRAKCJONOWANIE (inna strona)
ELEKTROFOREZA (inna strona)
CHROMATOGRAFIA (inna strona)
PCR (Reakcja Łańcucha Polimerazy)
– namnażanie śladowych ilości kw.nukleinowych przy użyciu polimerazy DNA poprzez przeprowadzanie wielu replikacji djących setki/tysiące identycznych cząstek. Każdy cykl jest bardziej efektywny, gdyż ma więcej matryc. (Przy RNA najpierw przepisujemy materiał na DNA dzięki odwrotnej transkryptazie)
DO BADANIA: GENÓW, DNA mitochondrialnego/WIRUSOWEGO i w kryminologii.
SEKWENCJONOWANIE
- sekwencjonowanie monomerów (w b./kw.nukl.)
- odrywanie łańcucha (B.) lub dodawanie do niego (DNA) kolejnych monomerów i ich identyfikacja.
Mikroskop świetlny 1.000x (2D)
- ŚW. Widzialne – (V)
- rozdzielczość 0,2 ym
^, O, 2D, kolor
MODYFIKACJE:
M. kontrastowo fazowy
*LIVE – NO pigment
M. interferencyjny
* LIVE – 3D (kontrast Nomarskiego)
M. ciemnego pola
- efekt HALO (świetlna otoczka)
- obserwacja powierzchni kom/bakt.
M. fluorescencyjny
V i V~~> en.
Fluor. Pierwotna/autofluorescencja lub f.wtórna wywołana barwnymi fluorochromami.
M. konfokalny – (3D)
- V.laser
- b. ostry obraz
M. elektronowy TRANSMISTYJNY 1mln (2D)
> 0,2 nm
^, O, pozorny, cz-b.
M. elek. SKALINGOWY 250 K (3D)
> 5 nm
^, 3d, cz-b