1) Technika mikroskopowa
* stanowi podstawowe narzędzie badań struktur komórkowych
* nie umożliwia uzyskania dokładnych informacji o składzie chemicznym i funkcjach organelli komórkowych
2) Metody i techniki pracy sprawdzone w fizyce, chemii i medycynie, wykorzystywane do badania komórek i tkanek
* delikatne rozbijanie komórek lub tworzenie za pomocą detergentów porów w błonie komórkowej (w ten drugi sposób uwalniane są
białka czy DNA bez zniszczenia komórek)
* uzyskuje się wówczas homogenat – zawiesinę komórkową
* techniki frakcjonowania – techniki rozdzielania zawartości komórek
* ultrawirówka – urządzenia stosowane w technikach frakcjonowania, w którym badane próbki poddaje się działaniu siły odśrodkowej
* poszczególne organelle różnią się masą i gęstością, więc stosuje się wirowanie różnicowe, tzn. ze wzrastającą szybkością (do 100tys
obrotów/min) i w określonym czasie
- najcięższe organelle opadają na dno próbówki, tworząc osad
- ponad nimi pozostaje roztwór, który po przelaniu do następnej próbówki nadal poddawany jest wirowaniu
* uzyskane frakcje komórkowe można dalej oczyszczać za pomocą wirowania równowagowego w gradiencie gęstości
- osad do wirowania nanosi się (nawarstwia) na powierzchnię odpowiedniego roztworu (np. fikolu o zróżnicowanym stężeniu), rosnącym w
kierunku dna próbówki i następnie wiruje
- podczas wirowania w gradiencie gęstości składniki komórki wędrują do rejonów o gęstości, która jest równa ich własnej, tworząc tam
pasma zawierające oczyszczone frakcje
* frakcje zbiera się oddzielnie i poddaje dalszym badaniom
3) autoradiografia – pozwala na kontrolowanie przebiegu reakcji po uprzednim oznakowaniu radioizotopami uczestniczących w niej
związków
* substancje promieniotwórcze występują w organizmie w ilościach śladowych i jeśli zostaną wprowadzone do organizmu, wbudowuje je on
do swoich związków chemicznych
* przemiany RNA
- aby śledzić przemiany RNA w komórkach embrionalnych (zarodkowych), można inkubować komórki z radioaktywnym
prekursorem tego związku, znakowanym np. izotopem wodoru
3
H
- po inkubacji materiał poddaje się rutynowej technice histologicznej: sporządza się skrawki, umieszcza na szkiełkach podstawowych,
preparaty pokrywa się emulsją fotograficzną zawierającą AgBr i pozostawia w ciemności (nawet na kilka miesięcy)
- w tym czasie promieniowanie emitowane przez izotop promieniotwórczy trafia na AgBr i powoduje pojawienie się w nim metalicznego
srebra
- po wywołaniu autoradiogramu można np. dokładnie określić lokalizację „promieniotwórczego” RNA w komórce albo rozpoznać określone
sekwencje DNA
- przy zastosowaniu bardzo cienkich skrawków można oglądać autoradiogramy pod mikroskopem elektronowym
4) chromatografia – metoda pozwalająca rozdzielać jednorodne mieszaniny związków, np. białek, aminokwasów lub barwników
asymilacyjnych
- wykorzystuje się siły oddziaływania rozdzielanych składników z fazą ruchomą i nieruchomą
* chromatografia bibułkowa
- stosowana np. w rozdzielaniu barwników roślinnych
- ekstrakt barwników, uzyskiwany przez roztarcie (np. w moździerzu) liści wybranej rośliny z odpowiednim rozpuszczalnikiem
(np. alkoholem), stanowi mieszaninę składników, które należy rozdzielić
- bibuła chromatograficzna to faza nieruchoma (stacjonarna), a mieszanina rozpuszczalników (np. eteru i benzenu lub benzyny i
benzenu) to faza ruchoma
- na bibułę chromatograficzną nanosi się w linii startu przesączony ekstrakt barwników i całość suszy
- do szklanego naczynia (komory chromatograficznej) wlewa się mieszaninę rozpuszczalników (układ rozwijający), przykrywa i zostawia
- po wysyceniu wnętrza komory chromatograficznej oparami rozpuszczalników umocowuje się w niej pasek bibuły, zanurzając go poniżej linii
startu w układzie rozwijającym
- mieszanina rozpuszczalników wsiąka w bibułę dzięki jej woskowatości i unosi się ku górze, a wraz z nią przemieszczają się barwniki
- szybkość przemieszczania się barwników jest różna
- barwnik najłatwiej rozpuszczalny i najsłabiej absorbowany przez bibułę przesuwa się najszybciej, co w efekcie prowadzi do rozdzielenia
wszystkich barwników na pasku bibuły
- zajmują one określone miejsca na chromatografie
- stężenie barwników można mierzyć na powierzchni, jaką zajmują na pasku bibuły, a przede wszystkim można je ekstrahować (robić
wyciąg) z bibuły za pomocą czystego rozpuszczalnika i poddać dalszej analizie
* chromatografia kolumnowa
* chromatografia cienkowarstwowa
5) elektroforeza – metoda rozdzielania jednorodnych mieszanin
- możliwa do zastosowania w polu elektrycznym – dzięki wędrującym cząsteczkom obdarzonym ładunkiem elektrycznym
- wykorzystuje się ją głównie do rozdzielania i oczyszczania mieszanin białek, aminokwasów i kwasów nukleinowych (w warunkach, w
których sumaryczny ładunek elektryczny cząsteczek jest różny od zera)
* immunoelektoforeza
* elektroforeza bibułowa
* elektroforeza żelowa – znalazła szerokie zastosowanie w medycynie klinicznej w analizie białek osocza krwi i badaniach odchyleń od
normy tych związków
BIOFIZYCZNE I BIOCHEMICZNE METODY BADANIA KOMÓREK
1) hodowle komórkowe i tkankowe – umożliwiają badanie procesów komórkowych in vitro (poza organizmem)
* zakłada się je umieszczając małe fragmenty ciała, np. skóry, w odpowiedniej pożywce
* po kilkudziesięciu godzinach na obwodzie tego fragmentu pojawiają się wywędrowujące z niego komórki – fibroblasty (komórki twórcze
tkanki łącznej właściwej)
* komórki te się dzielą, co powoduje powiększanie hodowli
* hodowla pierwotna – złożona z tkanek pobranych bezpośrednio z organizmu
* po pierwszym przeniesieniu komórek do innego naczynia, czyli po tzw. pierwszym pasażu, po pewnym czasie uzyskuje się tzw. linię
komórkową
* linie komórkowe wyprowadzane z tego samego materiału mogą się znacznie różnić właściwościami w zależności od warunków hodowli
* liczne komórki in vitro starzeją się i obumierają, obserwuje się różne zjawiska towarzyszące temu procesowi, m.in. uszkodzenia DNA,
zmiany stężenia RNA, skracanie chromosomów
* wyodrębnia się też białka znamionujące rychłą śmierć komórek
2) hodowle tkankowe prowadzi się również, wykorzystując komórki roślinne różnych organów
* w takich hodowlach uczeni mogą regenerować całe rośliny hodowane na syntetycznych pożywkach wzbogaconych w substancje hormonalne
* metody hodowli komórkowej i tkankowej roślin pozwalają śledzić procesy wzrostu i rozwoju roślin, otrzymywać rośliny o korzystnych
cechach genetycznych, dokonywać zmian składu genetycznego
1) Barwienie fluorescencyjne
* technika nadawania kolorów składnikom komórek i tkanek przy użyciu barwników fluorescencyjnych
* fluorescencja – właściwość wypromieniowywania przez barwnik fluorescencyjny światła innego koloru niż światło wcześniej
zaabsorbowane
* barwnik fluorescencyjny (np. oranż akrydyny) ma zdolność do wyemitowania fluorescencji o długości fali większej niż zaabsorbowana
* dzięki tej technice możliwe jest przyżyciowe barwienie struktur i substancji komórkowych (bez zaburzania życia komórki)
* efekty barwienia można zaobserwować z zastosowaniem mikroskopu fluorescencyjnego, który ma nadfioletowe źródło światła w
postaci lampy rtęciowej lub światła emitowanego przez laser (mikrofotografia konfokalna)
2) Znaczenie barwienie
* pozwala na uwidacznianie struktur komórkowych słabo lub zupełnie niemożliwych do zobaczenia w preparatach świeżych (niebarwionych)
* barwienie pojedyncze – używa się jednego barwnika
* barwienie złożone – używa się wielu barwników kolejno lub równocześnie
* najczęściej używane barwniki
* nowoczesne techniki stosowane w cytologii, neurobiologii i embriologii eksperymentalnej (np. z procesach klonowania zarodków)
* polegają na zabiegach chirurgicznych, przeprowadzanych przy użyciu mikronarzędzi (mikropipet, mikroskalpeli), poruszanych z wielką
precyzją za pomocą tzw mikromanipulatorów
* ciekawym przykładem są tu mikroiniekcje
- DNA wprowadza się bezpośrednio do jądra zapłodnionej komórki jajowej za pomocą mikropipety szklanej o średnicy 0,1 mikrometra
- zabieg wykonuje się pod mikroskopem
- jest powszechnie stosowany w celu uzyskiwania zwierząt zmodyfikowanych genetycznie
HODOWLE IN VITRO KOMÓREK I TKANEK
BARWIENIE KOMÓREK
Struktura/składnik komórkowy
Barwnik
Efekt barwny
Ściana komórkowa celulozowa
Karmin ałunowy
Czerwony
Ściana komórkowa zdrewniała
Zieleń jodowa
Zielony
Jądro komórkowe
Czerwień jądrowa
Jasnoczerwony
Ziarna skrobi
Płyn Lugola
Fioletowo-niebieski
Krople tłuszczu
Sudan III i IV
Czerwony
MIKROMANIPULACJE