Metody izolowania

komórek z

narządów

limfatycznych

myszy

Katarzyna

Bartosik

Agata Krzywicka

Komórki immunologicznie czynne z płynów i

tkanek litych – podstawowy „substrat”

biologiczny dla szeroko stosowanych

technik immunologii komórkowej, służących

ocenie jakościowej i funkcjonalnej układu

immunologicznego

Udział limfocytów T i B w

narządach limfatycznych

%
limfocytów T

%
limfocytów B

grasica

97

1

węzły
chłonne

77

18

śledziona

35

38

przewód
piersiowy

80

19

1.Pobranie

narządów



śledziona –

przecięcie skóry i

otrzewnej na

lewym boku

zwierzęcia



pachowe i

pachwinowe

węzły chłonne–

przecięcie skóry

wzdłuż ciała,

odchylenie jej na

boki, węzły

widoczne pod skórą



węzeł

mezenteryczny



Węzeł

podkolanowy

grasica – dodatkowe cięcie

żeber wzdłuż mostka

szpik kostny – kość udowa

IZOLACJA KOMÓREK Z NARZĄDÓW

LIMFATYCZNYCH:

2. Uwolnienie komórek immunologicznie

czynnych z otaczającego zrębu

łącznotkankowego

- rozdrobnienie mechaniczne

(np. w homogenizatorze) na kawałki o

objętości 2-3 mm

3

;

w przypadku kości

udowej wymywanie komórek za pomocą

strzykawki z igłą

- przetarcie fragmentów tkankowych i zlepów

komórek przez siatkę nylonową o wielkości

porów 25 – 50 μm

- zawieszenie komórek w standardowym

płynie hodowlanym

Inne metody izolacji komórek układu

odpornościowego:

- izolacja makrofagów z jamy

otrzewnowej lub płuc

- drenaż przewodu piersiowego – cewnik

umieszczony operacyjnie w przewodzie –

kilkanaście godzin, zawiesina komórek

(większość to limfocyty)

Izolacja makrofagów z jamy

otrzewnowej:

• -dootrzewnowe wstrzyknięcie środków

drażniących -tioglikolat, skrobia lub glikogen

• -po kilku dniach przepłukanie jamy

otrzewnowej PBS z EDTA – wysięk zawierający
makrofagi aktywowane

Izolacja

makrofagów płuc:

•perfuzja płuc przez

tchawicę płynem

zawierającym czynnik

antykoagulacyjny

Metody rozdziału wyizolowanych

komórek

- wykorzystujące właściwości:

• fizyczne
- gradienty gęstości
-metody adherencyjne
-eliminacja komórek na drodze szoku

osmotycznego

• biologiczne
- tworzenie rozet
- immunoadsorbenty
- kulki magnetyczne

Wirowanie w gradiencie gęstości

Gradient – najczęściej mieszanina syntetycznych

wysokocząsteczkowych polimerów (lecz może to być także

surowica) o określonej gęstości względnej (g/ml) i lepkości.

Gradient powinien być:

-o niskiej lepkości

-izoosmotyczny z krwią danego

gatunku

- nietoksyczny

-niezdolny do penetracji

przez błony biologiczne

izolowanych komórek

-łatwy do usunięcia

(wypłukania) z

oczyszczanego materiału

ZASADA

ROZDZIAŁU

–

RÓŻNICE

POMIĘDZY

GĘSTOŚCIĄ

WZGLĘDNĄ

GRADIENTU A WIELKOŚCIĄ I MASĄ

IZOLOWANYCH KOMÓREK

Żywotność komórek z interfazy powinna

wynosić około 80 -100%

W

celu

sprawdzenia

żywotności

komórek

przeprowadza się barwienie przyżyciowe: błękitem

trypanu, eozyną, nigrozyną.

Jednorodność uzyskanej populacji komórkowej

sprawdza się w rozmazie barwionym metodą May-

Grunwalda Giemzy lub metodą immunofluorescencji

powierzchniowej (IMF) przy użyciu przeciwciał

monoklonalnych.

Określanie gęstości komórek
– liczenie w komorze Bürkera

Metody adherencyjne

Adherencja – zdolność przylegania do szkła bądź plastiku

części komórek, zwłaszcza szeregu monocyta; zależy od

właściwości błony komórkowej i nie ma cech swoistości.

Dotyczy nie tylko monocytów i makrofagów, ale

także granulocytów i częściowo limfocytów B

Metody:

- rozdział komórek przy użyciu kulek szklanych
- przyleganie komórek adherentnych do powierzchni płytki

Petri'ego (polistyren) w czasie inkubacji (1 godz. w 37ºC,

5%CO

2

)

- kolumny z waty nylonowej lub szklanej
- kolumny z cząsteczek wielocukru lub poliakrylamidu

(Inkubacja zawiesiny komórek w kolumnach, po 30-45 min. w

37º C wypłukanie medium hodowlanym nie przylegających

komórek –

limfocytów T

; następnie inkubacja zawartości

kolumny w 50% FCS – uwolnienie zaadsorbowanych komórek)

Eliminacja komórek na drodze

szoku

osmotycznego

(uszkodzenie błon

komórkowych)

a) woda destylowana (1 część płynu hodowlanego i 2

części wody, pH 4,65)

b) chlorek amonu (0,83%=o,14 M NH

4

Cl z buforem

TRIS, pH 7,4)

- zawieszenie komórek w jednym z ww. roztworów
- inkubacja 15 – 30 sekund
- odwirowanie
- zawieszenie w płynie hodowlanym

Zawiesina komórek zostaje pozbawiona

erytrocytów

Tworzenie rozet

Limfocyty T

posiadają na swej powierzchni

receptory

dla krwinek czerwonych barana (

antygen CD2

) co

umożliwia spontaniczne tworzenie rozet z tymi
krwinkami (rozetki spontaniczne E - bezpośrednie).
Rozetki można oddzielić od pozostałych komórek
poprzez wirowanie w gradiencie Ficoll - Uropolina,
a następnie poprzez usunięcie erytrocytów na
drodze szoku osmotycznego.

Metody wykorzystujące

immunoadsorbenty

- kolumny – przez kolumnę wypełnioną nośnikiem

opłaszczonym

odpowiednim

przeciwciałem

monoklonalnym przepuszcza się zawiesinę komórek,

subpopulacja swoiście reagująca wiąże się z

nośnikiem

; komórki można odzyskać, płukając

immunoadsorbent płynem hodowlanym

- panning – immunoadsorpcja komórek w

fazie stałej

(stosowana np. do frakcjonowania CD4+ od CD8+

ludzkich limfocytów)

- paramagnetyczne cząstki polistyrenu (kulki)

opłaszczone przeciwciałami

kulk

a

przeciwciało

Kulki

paramagnetyczne

Metoda uzyskiwania względnie

czystych

populacji

komórek

z

zawiesiny

zawierającej

wiele

populacji

•inkubacja zawiesiny komórek z

kulkami

magnetycznymi

opłaszczonymi

przeciwciałem

skierowanym

przeciw

powierzchniowym

antygenom

komórek,

których chcemy pozbyć

się z zawiesiny (zubożenie populacji),

np. przeciwciała antyneutrofilowe

dla

populacji

zawierającej

eozynofile

i

neutrofile,

lub

przeciwciała

anty-CD3

dla

mieszaniny limfocytów T i B

•2

możliwości:

naniesienie

mieszaniny

do

kolumny

lub

pozostawienie ich w probówce

•działanie

magnesem

Frakcja komórek,

która została

zatrzymana w

kolumnie

magne

s

Kulki paramagnetyczne

kolumna

magnes

Fagocytoza

• Metody:
• a) karbonylek żelaza

(Fe

2

CO)

9

) lub opiłki

żelaza

• b) lateks (kulki plastiku

łatwo fagocytowane

)

Dziękujemy