Zastosowanie

spektroskopii NMR

w chemii i biologii

Początki

•

Pierwszym biologicznym zastosowaniem metody NMR
były badania żywych komórek oraz wycinków tkanek
zwierzęcych przeprowadzone przez szwedzkich
uczonych Erika Odeblada i Gunnara Lindströma

•

W następnych latach przeprowadzono wiele badań
relaksacji, dyfuzji i chemicznej wymiany wody w
różnych komórkach i tkankach, spostrzegając duże
zróżnicowanie tych parametrów).

•

Zauważono między innymi interesujące różnice
czasów relaksacji między wycinkami normalnej i
nowotworowej tkanki ludzkiej

Spektroskopia NMR służy do:

• określania i potwierdzania postulowanej

struktury

chemicznej

nieznanych

cząsteczek oraz oznaczania struktury nowo
syntetyzowanych związków.

• dostarcza

informacji

o

przestrzennym

ułożeniu atomów i ich ruchu w ważnych
biologicznie cząsteczkach oraz kompleksach
molekularnych.

• Umożliwia wyjaśnienie mechanizmu działania

enzymów oraz śledzenie przebiegu reakcji
chemicznych.

Zaletą tej metody jest jej

nieinwazyjność!

/Stosowane są impulsy o wysokiej

częstości, lecz niskiej energii rzędu 4x10

-

25

J - znacznie niższej od energii koniecznej

do rozerwania wiązania kowalencyjnego,

która wynosi 10

-17

J. Nie jest to zatem

metoda inwazyjna w przeciwieństwie do

metod wykorzystujących promieniowanie

jonizujące/

Zastosowanie spektroskopii NMR w
biochemii dla małych cząsteczek:

 analiza chemiczna

 określenie nieznanej struktury chemicznej

 nieinwazyjne oznaczanie stężenia

 badanie mechanizmów i produktów reakcji

 oznaczanie stałych wiązania

 oznaczanie stałych szybkości reakcji

 określanie konformacji substratów w centrum
aktywnym enzymu

Dla dużych cząsteczek:

 badanie zmian konformacyjnych wywołanych
czynnikami zewnętrznymi (pH, temperatura, siła
jonowa, ciśnienie)

 badanie zmian konformacyjnych wywołanych
przyłączeniem substratu

 badanie struktury centrum aktywnego enzymu,
przestrzennego ułożenia łańcuchów bocznych w
stosunku do substratu, jonizacji grup funkcyjnych

 oznaczanie stałych czasowych (czasów korelacji) i
rodzajów ruchu w przypadku zmian konformacyjnych

 analiza oddziaływań między cząsteczkami: enzym-
substrat, białko-białko, białko – kw. nukleinowy

 oznaczanie struktury drugo- i trzeciorzędowej w
roztworze

Widma

1

H NMR

Wzorzec: tetrametylosilan (TMS)

(CH

3

)

4

Si

Znakowanie izotopowe jest tu niepotrzebne, ze

względu na bardzo dużą czułość detekcji i

wysoką naturalną abundancję jąder

1

H

Z drugiej strony mały zakres przesunięć

chemicznych, obejmujący częstości

rezonansowe cząsteczek biologicznych

utrudnia rozdzielenie poszczególnych

rezonansów

Intensywny sygnał od wody zakłóca obserwowanie

sygnałów od interesujących nas metabolitów.

Na widmie NMR in vivo linie rezonansowe silnie się

nakładają. Aby uzyskać potrzebną informację

można celowo uprościć widmo (edycja

spektralna)

Sekwencja echa spinowego powoduje zmianę

sygnałów w zależności od ich multipletowości

(widma echa zawierają sygnały dodatnie i

składowe ujemne).

Widmo

1

H etanolu

Rodzaj protonu

Przesuniecie

• Cyklopropanu

0,2

• Pierwszorzędowy RCH3

0,9

• Drugorzędowy

R2CH2 1,3

• Trzeciorzędowy R3CH

1,5

• Winylowy C-C-H

4,6-5,9

• Aromatyczny Ar-H

6-8,5

• Benzylowy

Ar-C -H 2,2-3

• Allilowy

C=C-CH3

1,7

• Fluorków HC-F

4-4,5

• Chlorków HC-Cl

3-4

• Bromków H-Br

2,5-4

• Jodków HC-I 2-4

• Alkoholi HC-OH

3,4-4

• Eterów HC-OR

3,3-4

• Estrów RCOO-CH

3,7-4,1

• Estrów HC-COOR

2-2,2

• Kwasów HC-COOH 2-2,6

• Związków karbonylowych HC-C=O 2-2,7

• Aldehydowy RCHO

9-10

• Wodorotlenowy ROH1-5,5

• Fenolowy

ArOH

4-12

• Enolowy

C=C-OH15-17

• Karboksylowy

RCOOH 10,5-12

• Aminowy

RNH~

1-5

Widmo

1

H mózgu in vivo

NAA N-acetylo-
asparaginian

Lip lipidy

Lac mleczan

GABA kwas
aminomasłowy

GLN glutaminian

Glu glutamina

Asp asparaginian

Cr kreatyna

PCr fosfokreatyna

Cho cholina

Tau tauryna

Ins inozytol

Lip

NAA

Cr
+PCr

Interpretacja widm

1

H NMR

mózgu

Linia

Choroby

NAA
2.02 ppm

Neurony, aksony,
dendryty
„Marker neuronów”

udar, nowotwory,
stwardnienie rozsiane
(MS), choroba
Alzheimera,
stany niedotlenienia

Odwracalne zmiany
natężenia linii NAA:
MS, AIDS, epilepsja

Cholina
3.24 ppm
sygnał grupy
N(CH

3

)

3

Błony komórkowe
(tworzenie i
degradacja),
mielinizacja,
komórki rakowate

Nowotwory,
aktywna demielinizacja

dieta może zmieniać
poziom choliny

Kreatyna,
fosfokreatyna
3.02 ppm

Metabolizm

energetyczny

(ATP)

Choroby wątroby,
nowotwory

Suma PCr+Cr=const
w różnych obszarach
mózgu co daje
możliwość
„ilościowej
standaryzacji linii
NMR”

Mleczan

1.33 ppm

Zaburzony
metabolizm
energetyczny

udar, nowotwory,
choroby
mitochondrialne,
choroba Parkinksona.

Nie obserwowany w
zdrowym mózgu

Mioinozytol
3.56 ppm

Funkcja nieznana

Nowotwory (marker
komórek glejaka),
choroba Alzheimera,
demielinizacja

Glutamina,
glutaminian

Aminokwasy

Choroby wątroby,
syndromy Retta i Reye

Trudno rozseparować
obie linie

Rezonans fluorowy

19

F

Wzorzec CFCl

3

(C

6

F

6

)

Szeroki zakres przesunięć chemicznych od 100 do

–300 ppm
Selektywna metoda badania wielu leków takich,

jak: cytostatyki (5FU), leki antydepresyjne (Prozac),

nowoczesne leki antybakteryjne fluorochinolony

(Ciprinol), anestetyki (sevofluran, halotan),
pomocnicze:

- tomografia PET (fluorodezoksyglukoza)

- w badaniach pO2 -ciśnienia parcjalnego tlenu

- w tkankach- perfluorowęglan czyli sztuczna krew

Rezonans fosforowy

31

P

• Wzorzec H

3

PO

4

,

• zakres przesunięć chemicznych od 230 do –

200 ppm,

• Stosunkowo małe problemy z nakładaniem

się linii rezonansowych, gdyż w większości

badań występuje jednocześnie jedynie kilka

cząsteczek zawierających fosfor.

• charakterystyczne widmo z liniami: ATP

(ADP), fosfokreatyny (PCr), fosforu

nieorganicznego (P

i

), fosfoestrów (PME i PDE)

oraz glicerylofosfocholiny (GPC) i

glicerylofosfoetanolaminy (GPE),

• pomiar pH in vivo,

• ocena wewnątrzkomórkowego stężenia

poziomu jonów magnezu.

Rezonans węgla

13

C

• Wzorzec TMS,
• zakres przesunięć chemicznych od 240 do

–10 ppm

• obserwacja sygnałów: glukozy,

13

C –

glikogenu, glutamatu, tłuszczów,
mleczanów, mioinozytolu.

• choroby: nowotwory prostaty, choroba

Alzheimera, cukrzyca.

Rezonans azotu

15

N

• Naturalna abundancja wynosi 0.37%
• Wyniki w postaci dobrze rozdzielonych

widm

• Badanie wbudowywania się atomów azotu

do komórek bakterii na pożywce NH

4

Cl (po

pewnym czasie na zewnątrz komórek
można zarejestrować Ala znakowaną

15

N,

która została wydalona przez bakterie w
przeciwieństwie do innych aminokwasów).

Pierwiastki rezonansowe

identifikowane

w układach biologicznych in vivo

Pierwiastek

Częstość
rezonansu (MHz)
w polu 1.41 T

Czułość
względem

1

H

Spin
jądra

Naturalna
abundancja
%

1

H

60

1

1/2

99.98

31

P

24,34

6.63.10

-2

1/2

100

19

F

56,45

0.83

1/2

100

13

C

15,09

1.59.10

-2

1/2

1.10

7

Li

23,33

0.29

3/2

92.58

15

N

23

Na

6,08
15,6

1.04.10

-3

9.25.10

-2

1/2
3/2

0.37
100

Spektroskopia NMR białek

Za pomocą widma

1

H NMR może być

śledzone

przejście

białka

od

konformacji natywnej do całkowicie

zdenaturowanej.

•

Gdy białko znajduje się w stanie

pofałdowania widmo jest silnie rozbudowane

i

nie

ma

możliwości

precyzyjnego

przewidzenia kształtu białka, nawet gdy

znana jest struktura przestrzenna cząsteczki.

• W stanie denaturacji widmo NMR jest w

przybliżeniu odbiciem składu aminokwasów.

Denaturacja czynnika

III lac wraz ze
wzrostem pH. E, E’,
F, F’ to linie
rezonansowe Tyr w
cząsteczce
natywnej i
częściowo
zdenaturowanej.
Proces
denatuturacji jest
szczególnie
widoczny dla dwóch
linii rezonansowych
G i H.

Za pomocą spektroskopii NMR można
śledzić zmiany konformacyjne enzymów
po przyłączeniu substratu lub efektora
allosterycznego.

/np. obserwowane są znaczne zmiany widma NMR
ludzkiej kinazy adenylowej po przyłączeniu do niej
analogu substratu./

Aminokwasem, który bierze udział w
wielu procesach katalitycznych, a jego
sygnały są łatwe do rozróżnienia nawet
dla dużych białek, jest His. Fosforylacja
His prowadzi do typowych zmian jej
częstości rezonansowych.

Jeżeli do badanej próbki zostanie
wprowadzona np. deuterowana Leu, to
jądra deuteru nie dadzą sygnałów na
widmie

1

H NMR. W związku z tym

wszystkie linie rezonansowe, których
brak

w

porównaniu

z

widmem

początkowym, pochodzą od jąder
wodoru Leu. W podobny sposób można
uzyskać informacje porównując dwa
białka o zbliżonej sekwencji. Brakujące
linie

rezonansowe

pochodzą

od

zamienionych aminokwasów.

Spektroskopia NMR kwasów

nukleinowych

 Opiera się w zasadzie na tych samych regułach co NMR

białek.

 Określenie struktury przestrzennej jest tu łatwiejsze,

ponieważ parowanie zasad redukuje znacznie liczbę

możliwych struktur przestrzennych.

 Problemem może być stosunkowo silne, zależne od

konformacji przesunięcie chemiczne wynikające z faktu,

że części zasadowe nukleotydów są pierścieniami

aromatycznymi, co prowadzi do silnego wzbogacenia

struktury widma NMR.

 Główny łańcuch DNA i RNA składa się z diestrów kw.

fosforowego, dlatego spektroskopia

31

P NMR okazała

się równie przydatna w ich badaniu jak spektroskopia

1

H

NMR.

Spektroskopia NMR

polisacharydów

Za pomocą NMR można określić
strukturę monosacharydu, np. w
przypadku heksozy: krzesełko lub
łódeczka.

Dwuwymiarowa

spektroskopia

NMR

umożliwia

określenie

czy

poszczególne

monosacharydy połączone są ze
sobą

wiązaniem

α

czy

β-

glikozydowym.

Spektroskop
NMR