Białka opiekuńcze- funkcja,

struktura, mechanizmy

działania

Biogeneza białek- fałdowanie

białek de novo

Biochemiczne podstawy funkcjonowania organizmów

Plan wykładu

1.

Rola białek opiekuńczych.

2.

Główne rodziny białek opiekuńczych-
struktura, funkcja, mechanizmy działania.

3.

Biogeneza białek w komórkach
prokariotycznych i eukariotycznych:

- rola rybosomów w biogenezie białek;
-

maszyneria chaperonowa zaangażowana
w fałdowanie białek de novo;

-

chaperony zasocjowane z rybosomami.

Rola białek opiekuńczych

1. Pośredniczą w prawidłowym zwijaniu polipeptydów.
2. Chronią białka komórkowe przed inaktywacją (ang. holder

chaperones, holdazy).

3. Uczestniczą w reaktywacji zagregowanych białek (ang. folder

chaperones, foldazy)

4. Kierują też białka do degradacji jeśli naprawa jest niemożliwa.

Białka opiekuńcze występują we wszystkich organizmach, są obecne
zarówno w komórkach bakteryjnych, jak i w komórkach ludzkich.
Co więcej białka opiekuńcze cechuje wysoki stopień homologii struktury
pierwszorzędowej.

Ich funkcje stają się krytyczne w warunkach stresowych,

bez nich komórki nie są w stanie przeżyć niekorzystnych

warunków.

Białka opiekuńcze są centralnym elementem systemu kontroli jakości białek.

Ochrona komórki przed zgubnymi skutkami zmian czynników

zewnętrznych.

Nagłe zmiany czynników środowiskowych często zaburzają

proces fałdowania nowo powstających polipeptydów oraz

naruszają natywną konformację białek, co sprzyja ich agregacji.

Dzięki białkom opiekuńczym każdy żywy organizm może

kontrolować procesy agregacji polipeptydów i przeciwstawiać się

jemu m.in. poprzez zapobieganie niepożądanym oddziaływaniom

międzycząsteczkowym.

Rola białek opiekuńczych

Hsps zależne od ATP

Podjednostki kompleksów proteolitycznych oraz

dezagregazy współpracujące z Hsp70/Hsp40

Hsp100/Clp

E. coli:

ClpA, ClpX, ClpY (HslU),

ClpB

(cytosol)

S. cerevisiae

: Hsp104

(cytosol),

Hsp78

(mitochondria)

Arabidopsis thaliana:

AtHsp101/ClpB1

(cytosol)

Foldazy

Hsp90

E. coli: HtpG (cytosol)
S. cerevisiae: Hsp83 (cytosol/jądro)

Ssaki
Hsp90, Hsp90 (cytosol/jądro komórkowe),

Grp94 (ER)

Hsp70

E. coli: DnaK (cytosol)
S. cerevisiae: Ssa 1-4 i Ssb 1,2 (cytosol)
Kar2 (ER), Ssc1 (mitochondria)

Ssaki
Hsp70 (Hsp72) (cytosol/jądro komórkowe)

Hsc70 (Hsp73) (cytosol/jądro)
Hsp75 (Grp75/mtHsp70) (mitochondria)

BiP (Grp78/Hsp78) (ER)

Hsp60

E. coli: GroEL (cytosol)
S. cerevisiae: Hsp60 (mitochondria)

Rośliny
Cpn60 (chloroplasty)

Ssaki
Hsp60 (mitochondria/cytosol)

Hsp40

(partnerzy Hsp70)

E. coli: DnaJ (cytosol)

S. cerevisiae: Ydj1 (cytosol/jądro)
Ssaki

Hsp40 (cytosol/mitochondria), Hsp47 (ER)

Hsp10

(partnerzy Hsp60)

E. coli: GroES (cytosol)

Rośliny
Cpn10 (chloroplasty)

Ssaki
Hsp10 (mitochondria/cytosol)

Hsps niezależne do ATP (sHsps)

Holdazy

E. coli: IbpA i IbpB

S. cerevisiae: Hsp27 (cytosol)
Ssaki
A- i B-krystaliny (cytosol)
Hsp25/Hsp27 (cytosol/jądro)

Główne rodziny białek

opiekuńczych i ich

przedstawiciele

Hsp90, Hsp70, Hsp40, Hsp60 oraz
Hsp10 występują we wszystkich
organizmach, są one obecne zarówno
w komórkach
bakteryjnych, jak i w komórkach
ludzkich, a ich docelowym miejscem
jest nie tylko cytosol, ale także różne
organella komórkowe, takie jak
siateczka śródplazmatyczna (ER),
chloroplasty czy mitochondria.

Niektóre z omawianych białek syntetyzowane są na poziomie

konstytutywnym, inne indukowane są pod wpływem działania

różnych czynników stresogennych, jak np.: Hsp70(Hsp72) i

Hsp90.

Hsp90, Hsp70/Hsp40 oraz Hsp60/Hsp10 działają przede

wszystkim jako tzw. foldazy (ang. folder chaperones),

ponieważ pośredniczą one w fałdowaniu i w reaktywacji białek

inaktywowanych pod wpływem stresu, przywracając im

właściwą konformację oraz właściwości biologiczne.

Mechanizm działania tej grupy białek opiekuńczych jest

zależny od ATP.

Są to białka o niskiej masie

cząsteczkowej (12-43 kDa), takie jak

-krystaliny, mysie Hsp25/ ludzkie Hsp27
czy bakteryjne białka IbpA, IbpB. Białka te

funkcjonują w komórkach jako tzw.

holdazy (ang. holder chaperones),

ponieważ wiążą się one do nienatywnych

konformacji białek (niezależnie

od ATP) i tworząc z nimi stabilne

kompleksy zapobiegają ich agregacji. Nie

posiadają one

jednak aktywności refałdujących.

Tworzą one struktury multimeryczne, np.

ssacze sHsps tworzą kompleksy

składające się z 32 podjednostek (Mr=

800 kDa).

Występują one w większości komórek i

tkanek także w nieobecności czynników

stresogennych.

sHsps

sHsp16.9 sHsp 16.5

Rodzina Hsp100

ATPazy o strukturze przypominającej heksameryczny pierścień, zaliczane
do tzw. ATPaz AAA+. W środku tego pierścienia znajduje się centralny
kanał, przez który przeciągany jest substrat białkowy.

Model heksameru ClpA

Guo F et al. J. Biol. Chem. 2002;277:46743-46752

monomer
ClpB

domena N-
terminalna

domena środkowa

(MD)

NBD-
1

NBD-
2

ATP

NBD-1

,

NBD-2

- moduły

wiążące i hydrolizujące ATP

MD

Większość ATPaz Hsp100, z wyjątkiem ClpB/Hsp104, tworzy
kompleksy proteolityczne współpracujące z podjednostkami
peptydazowymi (ClpP lub ClpQ (HslV)) odpowiedzialne w komórce
bakteryjnej za degradację nieprawidłowo zwiniętych polipeptydów.
ClpB/Hsp104, w przeciwieństwie do innych przedstawicieli ATPaz Clp,
nie jest zaangażowane w degradację białek, lecz wraz z systemem
DnaK/DnaJ (Hsp70/Hsp40) bierze udział w dezagregacji i
reaktywacji białek. Aktywność tego dwuskładnikowego systemu białek
opiekuńczych jest krytyczna dla przeżywalności bakterii, drożdży i roślin
w warunkach stresu.

Do tej pory, nie zidentyfikowano homologów białek ClpB/Hsp104
w cytosolu ssaków. Przypuszcza się, że ich funkcję w komórkach
ssaczych przejęły inne ATPazy AAA+, m.in. białko VCP (ang.
valosin-containing protein) znane także, jako p97, którego
dysfunkcje prowadzą m.in. do akumulacji nierozpuszczalnych i
ubikwitylowanych białek.

Model dezagregacji i reaktywacji białek przy

udziale

ATPazy ClpB/Hsp104 (mechanizm translokacyjny)

Do dezagregacji białek z udziałem ClpB/Hsp104 może zachodzić
w wyniku translokacji pojedynczych polipeptydów przez
centralny kanał ClpB. Translokacja substratu jest napędzana
przez hydrolizę ATP.

System Hsp70/Hsp40 jest niezbędny do zapoczątkowania
procesu rozwijania polipeptydów czyli wyekstrahowania ich z
dużych agregatów.

substrat systemów

Hsp70/40 i

Hsp60/Hsp10

Przynajmniej 75% termicznie zagregowanych białek w
komórkach E. coli jest reaktywowanych w wyniku współpracy
ClpB z systemem DnaK.

N
D

NBD-1

MD

NBD-
2

NBD-1

MD

NBD-
2

Val149

ClpB9
5

ClpB8
0

domena

N-terminalna

Gen clpB E. coli koduje dwie formy

białka ClpB,

ClpB95 i ClpB80

NBD-1, NBD-2- moduły wiążące ATP

MD- domena środkowa

Dwie izoformy ClpB, ClpB80 i ClpB95,
współdziałają in vivo tworząc bardzo
wydajny
system dezagregacji i reaktywacji białek.

gttatg

ggagg

agtt

atg

cgtctggatcgtcttactaataaattccagcttgctcttgcc

M R L D R L T N K F Q L A L A
gatgcccaatcacttgcactcgggcacgacaaccaatttatcgaaccacttcatttaatg
D A Q S L A L G H D N Q F I E P L H L M
agcgccctgctgaatcaggaagggggttcggttagtcctttattaacatccgctggcata
S A L L N Q E G G S V S P L L T S A G I
aatgctggccagttgcgcacagatatcaatcaggcattaaatcgtttaccgcaggttgaa
N A G Q L R T D I N Q A L N R L P Q V E
ggtactggtggtgatgtccagccatcacaggatctggtgcgcgttcttaatctttgcgac
G T G G D V Q P S Q D L V R V L N L C D
aacgtggcgcaaaaacgtggtgataactttatctcgtcagaactgttcgttctggcggca
N V A Q K R G D N F I S S E L F V L A A
cttgagtctcgcggcaccgtggccgacatcctgaaagcagcaggggcgaccaccgccaac
L E S R G T V A D I L K A A G A T T A N
attactcaagcgattgaacaaatgcgt

ggagg

tgaaagc

gtg

aacgatcaaggtgctgaa

I T Q A I E Q M

R G G E S V N D Q G A E

gaccaacgtcaggctttgaaaaaatataccatcgaccttaccgaacgagccgaacagggc

D Q R

Q A L K K Y T I D L T E R A E Q G

Gen clpB zawiera alternatywne miejsce inicjacji translacji

Oddziaływania ClpB80/95 zachodzą

wewnątrz mieszanego heksameru a nie

pomiędzy heksamerami ClpB80 i ClpB95

heksamer
ClpB80

heksamer
ClpB95

mieszany heksamer
ClpB80/95

Rodzina Hsp90

1. Uczestniczą w kontroli cyklu komórkowego, przeżywalności

komórek.

2. Odgrywają istotną rolę w utrzymaniu homeostazy.
3. Fałdowanie i stabilizacja białek.
4. Hsp90 stało się głównym celem terapeutycznym w terapiach

anty-nowotworowych.

5. Hsp90 posiada aktywność ATPazy, wiązanie i hydroliza ATP

wywołują zmiany konformacyjne tego białka.

Wiązanie ATP skutkuje dimeryzacją NBDs, co
prowadzi do tworzenia struktur cyklicznych.
Oddziaływanie NBDs jest niezbędne do
hydrolizy ATP. Hsp90 w obecności ATP
stabilnie wiąże
się do substratów białkowych. W wyniku
hydrolizy ATP dochodzi do uwolnienia
substratu (prawdopodobnie poprzez otwarcie
dimeru Hsp90).

Eukariotyczne białko Hsp90 (cytosol) oddziałuje z różnymi co-chaperonami.
Tworzy z nimi kompleksy multichaperonowe. Co-chaperony regulują funkcję
Hsp90.

Cykl ATPazowy
Hsp90

Działanie
cytosolowego białka
Hsp90 jest zależne od
innych białek
opiekuńczych.

Co-chaperony regulują
aktywnośc ATPazową
Hsp90 i jego
oddziaływania z
substratami
białkowymi.

Rodzina Hsp70

Cykl ATP-azowy regulujący wiązanie się substratów do białek Hsp70.
Wiązanie ATP do domeny ATP-azowej (NBD) Hsp70 otwiera „wieczko” nad
domeną substratową i umożliwia wiązanie substratu. Hydroliza ATP,
katalizowana przez co-chaperony prowadzi do zamknięcia „wieczka” i
uwięzienia substratu w kieszeni domeny substratowej. Działanie czynników
wymieniających nukleotyd (NEFs) ADP na ATP prowadzi do uwolnienia
związanego substratu i rozpoczęcia kolejnego cyklu.

Aktywność ATP-azowa pozwala
na prawidłowe fałdowanie
białek

(Hsp40
)

Wiązanie ATP do domeny N-terminalnej (NBD) Hsp70 powoduje zmiany
konformacyjne w domenie C-terminalnej („wieczko”, ang. lid) i tym
samym zmienia powinowactwo Hsp70 do substratów białkowych. Cykl
ATP-azowy Hsp70 można przedstawić jako alternatywę między 2
stanami: związany z ATP (ATP-bound state) z niskim powinowactwem i
szybkim tempem wymiany substratów (otwarte wieczko) i stan związany
z ADP (ADP-bound state) z wysokim powonowactwem i wolnym tempem
wymiany substratów (zamknięte wieczko).

N

Pi

J

J

J

J

K-ATP

K-ATP

K-ATP

K-ATP

K-ADP

K-ADP

GrpE

ADP +
GrpE
DnaJ ?

K

K

ATP

GroEL

J

J

R

I

II

III

IV

Model działania systemu DnaK/DnaJ/GrpE w procesie

fałdowania polipeptydów

(I) W pierwszej kolejności do rozwiniętego polipeptydu przyłącza się DnaJ,
które następnie przekazuje substrat białku DnaK związanemu z ATP. (II)
DnaJ i polipeptyd stymulują aktywność ATPazową DnaK. Powstaje stabilny
kompleks polipeptyd-DnaK-DnaJ. (III) Przyłączenie GrpE do DnaK prowadzi
do uwolnienia ADP i destabilizacji tego kompleksu. Możliwe, że na tym
etapie dochodzi do odłączenia się białka DnaJ. (IV) Przyłączenie kolejnej
cząsteczki ATP (nie hydroliza) do DnaK uwalnia polipeptyd. Jeżeli
polipeptyd nie zostanie prawidłowo sfałdowany w pojedynczym cyklu
działania systemu DnaK/DnaJ/GrpE, może on być ponownie wiązany przez
DnaJ lub przekazany innemu systemowi białek opiekuńczych
(GroES/GroEL).

N- białko natywne

R- białko rozwinięte

Model strukturalny białka GroEL oraz kompleksu GroEL–GroES–
(ADP)

7

http://dx.doi.org/10.1016/S0092-
8674(00)80928-9

Rodziny Hsp60 i Hsp10 (chaperoniny I

grupy)

heptameryczn

e pierścienie

GroEL (Hsp60)

tworzące

cylindryczną

strukturę

GroES

7

(Hsp10)

GroEL+ GroES działają razem

pierścień
cis
pierścień
trans

184Å

Chaperoniny- duże, mulitmeryczne, cylindryczne kompleksy białkowe
składające się z 2 pierścieni stykających się ze sobą. Każdy z pierścieni
składa się z 7-9 podjednostek. Na podstawie homologii sekwencji
aminokwasowej chaperoniny dzielimy na 2 grupy, I i II.

ADP

ADP

7AT
P

ADP

ADP

ATP

ATP

I

II

III

7Pi,
7ADP
GroES

7ATP
GroES

ATP

ATP

ADP

ADP

7Pi

7AT
P

7AD
P

7Pi,
7ADP
GroES
GroES

N

R

ADP

ADP

ATP

ATP

IV

V

VI

GroEL

GroES

7AD
P

Model działania białek opiekuńczych GroES/GroEL w

procesie

fałdowania polipeptydów

(I) Asymetryczny kompleks GroES-GroEL-ADP wiąże substrat białkowy w
wolnym pierścieniu GroEL. (II, III) Wiązanie i hydroliza ATP w tym pierścieniu
powoduje uwolnienie ADP i GroES z drugiego pierścienia. (IV-V) GroES i ATP
ponownie wiążą się z domeną GroEL zawierającą substrat, co prowadzi do
jego zamknięcia. Hydroliza ATP w pierścieniu GroEL związanym z GroES
„utrwala” oddziaływania między GroEL i GroES. (VI) Przyłączenie i hydroliza
ATP w sąsiednim pierścieniu prowadzą do otwarcia kompleksu GroEL-GroES i
uwolnienia sfałdowanego polipeptydu. Polipeptydy, które nie uzyskały
natywnej konformacji ulegają kolejnym cyklom przyłączania i uwalniana aż do
uzyskania prawidłowej konformacji.

N- białko natywne

,

R- białko rozwinięte

.

http://dx.doi.org/10.1016/j.str.2012.03.0
07

Eukariotyczne chaperoniny grupy II- asymetryczny

kompleks białkowyTRiC/CCT

Organizacja strukturalna
TRiC

Heterooligomer w przeciwieństwie do
białka GroEL, które jest
homooligomerem (14 podjednostek).

Brak kofaktora naśladującego białko
GroES.

Wykorzystują hydrolizę ATP w procesie
fałdowania białek (10%, np. białka
cytoszkieletu, białka regulujące cykl
komórkowy).

Jest on niezbędny dla przeżywalności
komórek.

Termosom (cytosol) odpowiednikiem
kompleksu TRiC u archebakterii

Biogeneza białek- fałdowanie

białek de novo

Jedna z fundamentalnych reakcji w całej biologii, poprzez

którą dokonuje się realizacja informacji genetycznej

Rola rybosomów w biogenezie białek

Rybosomy syntetyzują białka na podstawie informacji genetycznej
dostarczonej im przez mRNAs.
Rybosomy nie tylko stanowią maszynerią w syntezie białek, ale także
zaangażowane są w procesy fałdowania białek i ich translokację.

Istnieje kilka czynników, które pozwalają rybosomom aktywnie
uczestniczyć w tych dodatkowych procesach.

http://dx.doi.org/10.1016/S0960-9822(02)00437-2

Po syntezie pierwszych 35-40 reszt aminokwasowych, rosnący łańcuch
wyłania się z tunelu rybosomu. Na tym etapie różne czynniki, które
bezpośrednio są związane z rybosomami, oddziałują z wyłaniającym się i
dojrzewającym łańcuchem polipeptydowym.

Chaperony zaangażowane w fałdowanie de

novo białek cytosolowych

I grupa: chaperony, które dynamicznie wiążą się zarówno do
rybosomu, jak i wyłaniającego się z niego polipeptydu (ang. rybosome-
associated chaperones); kontrolują one wczesne etapy fałdowania
podczas translacji.
W bakteriach jest to trigger factor (TF), podczas gdy

w

komórkach eukariotycznych obecne są 2 różne typy systemów
chaperonowych zasocjowanych z rybosomami

. W komórkach drożdży

jeden z tych systemów składa się z: kompleksu

RAC

(rybosome-

associated complex)

oraz z białka Ssb

(Hsp70). RAC jest stabilnym

kompleksem składającym się z białka Zuo (chaperone zuotin, Hsp40)
i białka Ssz (Hsp70).
Drugi system stanowi heterodimeryczny kompleks NAC (nascent
polypeptide-associated complex), który jest silnie zachowany w ewolucji.
Natomiast ssaczy kompleks RAC (mRAC) składa się z MPP11 (homolog Zuo) i
Hsp70L1 (an Szs-like protein) i pozbawiony jest białka Ssb. W zamian, ssacze
białko Hsp70 (cytosol) jest zaangażowane poprzez mRAC w oddziaływania z
powstającymi polipeptydami.

Chaperony zaangażowane w fałdowanie de

novo białek cytosolowych

II grupa: chaperony, które oddziałują z nowo syntetyzowanymi białkami;
Cytosolowe chaperony Hsp70/Hsp40, rodziny Hsp60/Hsp10, które występują

w

Komórkach pro- i eukariotycznych. Do tej grupy należą także prefoldyny,

które są

obecne u Archaea i organizmów eukariotycznych.

Chaperony zasocjowane z rybosomami oraz chaperony

zlokalizowane w

cytosolu współpracują ze sobą i tworzą „rozbudowaną” maszynerię
uczestniczącą w fałdowaniu białek de novo.

rybosome- associated chaperones + cytosolic chaperones of the
Hsp70/Hsp40 and Hsp60/10 families = a robust network for de
novo protein folding

Maszyneria chaperonowa uczestnicząca w fałdowaniu
białek de novo

.

http://dx.doi.org/10.1016/j.tibs.2012.03.002

TRiC, TCP-1 ring complex; CCT, chaperonin containing TCP-1

Protein folding in the cytosol

Vabulas R M et al. Cold Spring Harb Perspect Biol

2010;2:a004390

©2010 by Cold Spring Harbor Laboratory Press

Podsumowanie

Białka opiekuńcze są białkami cytoplazmatycznymi, które obecne są
we wszystkich organizmach.
Są one centralnym elementem system kontroli jakości białek.
Odgrywają one istotną rolę w procesie fałdowania białek.

W fałdowaniu białek de novo oprócz białek opiekuńczych
zlokalizowanych w cytosolu bądź specyficznie związanych
z organellami komórkowymi, uczestniczą także białka opiekuńcze
zasocjowane z rybosomami.
Białka te działają na wczesnych etapach fałdowania,
zapobiegają niewłaściwemu fałdowaniu polipeptydów oraz ich
agregacji (stabilizują one wydłużające się na rybosomach łańcuchy
polipeptydowe).

Dalsze etapy fałdowania białek są realizowane z udziałem maszynerii
takiej jak chaperoniny bakteryjne GroEL/ES, czy eukariotyczne

TRiC/CCT.

Literatura

S. Kędzierska (2005) Rola białek opiekuńczych Escherichia coli w ochronie komórki

bakteryjnej

Przed nieodwracalną agregacją białek indukowaną termicznie. Postępy Biochemii,

51: 146-153.

S. Preissler and E. Deuerling (2012) Ribosome-associated chaperones as key
players in proteostasis. Trends in Biochemical Sciences, 37: 274-283.

J. Rassow and N. Pfanner (1996) Protein biogenesis: Chaperones for nascent

polypeptides.

Current Biology, 6: 115-118.