Ćwiczenie 9-12
cz.1

Obserwacja wzrostu
drobnoustrojów
na podłożach

POŻYWKI I PODŁOŻA

Pożywkami lub podłożami nazywa się mieszaniny
różnych związków chemicznych, które stwarzają
optymalne warunki dla rozwoju drobnoustrojów in vitro.

Pożywka powinna odpowiadać następującym
wymogom:



Odpowiednia wartość odżywcza



Odpowiednia izotoniczność podłoża



Odpowiedni odczyn pH



Klarowność



Sterylność

Odpowiednia wartość odżywcza

Podłoża powinny zawierać wszystkie konieczne składniki
zapewniające wzrost: źródło energii, węgla i azotu, jony, a także
pierwiastki śladowe.



pierwiastki biogenne – węgiel, tlen, wodór, azot, fosfor, siarka
(C, O, H, N, P, S),



mikroelementy,



źródło węgla - cukry (glukoza, maltoza, laktoza, celuloza,
skrobia),



źródło azotu



związki nieorganiczne (NaNO

, NH

, NO

)



związki organiczne (enzymatyczny hydrolizat kazeiny,

pepton - produkt trawienia białka pepsyną, aminokwasy)

Zawartość cukru i substancji białkowych w pożywce wynosi 0,5 - 2

Odpowiednia izotoniczność podłoża

Ciśnienie osmotyczne musi być takie samo jak w
komórkach drobnoustrojów.
Uzyskuje się je przez dodanie do podłożą NaCl do uzyskania
stężenia 0,5 %.

Podłoże hipotoniczne (o niższym ciśnieniu osmotycznym niż
komórkowe), powoduje pęcznienie, a nawet pękanie komórek.

Podłoże hipertoniczne ( o wyższym ciśnieniu osmotycznym niż
komórkowe) następuje kurczenie się plazmy i oddzielenie od
ściany komórkowej.

Odpowiedni odczyn pH

Musi odpowiadać danej grupie drobnoustrojów, dla której
przygotowane jest podłoże.
Dla bakterii optymalny jest odczyn słabo alkaliczny pH = 7
(7,2 - 7,4), dla grzybów pH = 5,5 - 6,5.

Klarowność

Konieczna do wizualnego stwierdzenia wzrostu kultury (określenie
stopnia zmętnienia).
Nie dotyczy to podłóż zawierających składniki nierozpuszczalne np.
CaCO

Sterylność

Warunkuje prawidłową pracę w laboratorium, umożliwia poprawne
określenie cech morfologicznych, fizjologicznych i biochemicznych.

PODZIAŁ PODŁOŻY MIKROBIOLOGICZNYCH

Wg właściwości fizycznych

(konsystencja):

Płynne

Półpłynne

Stałe

II. Ze względu na charakter

składników:

Naturalne

Półsyntetyczne

Syntetyczne

III. Ze względu na wartość

użytkową:

Proste

Wzbogacone

Wybiórczo-

namnażające

Różnicujące

Kombinowane

Specjalne

I. Podział pożywek ze względu na właściwości

fizyczne (konsystencję):

1. Płynne:



bulion,



mleko,



brzeczka (półprodukt stosowany przy produkcji piwa
przygotowywany ze słodu jęczmiennego, chmielu i innych
dodatków).

2. Półpłynne:



bulion z dodatkiem 0,15 - 0,5% agaru

3. Stałe:



podłoża żelatynowe (bulion + 10 - 15% żelatyny)



agarowe (bulion + 1,5 - 2% agaru)



ścięta surowica



ścięte podłoże jajowe

Rodzaj użytego podłoża zależy od naturalnego środowiska
drobnoustroju oraz celu w jakim jest hodowany.

Agar



wielocukier pęczniejący w wodzie,



składa się w 70% z agarozy i agaropektyny,



otrzymywany z glonów morskich (krasnorostów),



nie zawiera składników odżywczych,



nie jest na ogół przyswajany przez drobnoustroje,



rozpuszcza się w temp. ok. 96

C, schłodzony krzepnie w

temp. ok. 46



produkowany w postaci włókien lub proszku.

Żelatyna



produkt degradacji kolagenu,



rozpuszcza się i krzepnie w temp. 20-25



może być przyswajany przez drobnoustroje wytwarzające
enzymy proteolityczne,



używana do pożywek dla bakterii psychrofilnych; do
wykazania enzymu żelatynazy bakterii chorobotwórczych.

Żel krzemionkowy



stosowany do zestalania podłoży nie zawierających
składników organicznych.

II. Podział pożywek ze względu na charakter

składników

1. Naturalne

(wyłącznie składniki naturalne)



mleko, serwatka, bulion, brzeczka, wyciągi z gleby, ziemniaków,
drożdży, jaja, krew.

2. Półsyntetyczne

(syntetyczne związki chemiczne + składniki naturalne)



mleko z lakmusem,



agar ziemniaczany z tiaminą.

3. Syntetyczne

- każdy składnik znany jest jakościowo i ilościowo;

Zazwyczaj stosowane w postaci płynnej, konsystencję stałą nadaje się
poprzez zestalenie żelem krzemionkowym lub bardzo dokładnie
oczyszczonym agarem



pożywka Kozera,



pożywka Sołtysa

III. Podział pożywek ze względu na wartość

użytkową

1. Podłoża proste



pozwalają na rozwój większości bakterii



najszersze zastosowanie



podstawa do przygotowania innych typów pożywek



zaliczamy:



bulion odżywczy,



agar odżywczy,



żelatynę odżywczą

Hodowla E. coli

Do podłoży prostych

Przygotowanie wody mięsnej
Mięso oczyszczone z błon i tłuszczu, zmielone, zalewa się zimną wodą
wodociągową wzgl. destylowaną (1:2) i ekstrahuje w temp. 4 – 8

(10 – 12h) lub w 12 – 18

C (2 – 4h). Następnie gotuje się przez 45 – 60

min i sączy przez płótno, bibułę lub watę szklaną. Otrzymany
przesącz dopełniamy do pierwotnej objętości i wyjaławiamy w
autoklawie stanowi wodę mięsną, którą można przechowywać w
chłodni, wzgl. używać bezpośrednio do przygotowania bulionu czy
agaru odżywczego.

Bulion odżywczy
Zawiera wodę mięsną z dodatkiem 0,5% NaCl i 1-2% peptonu.
Chlorek sodu stwarza w podlożu odpowiednie ciśnienie osmotyczne, a
pepton (produkt trawienia białka pepsyną), zawierający polipeptydy i
wolne aminokwasy, wzbogaca pożywkę i umożliwia pobieranie azotu
bakteriom nie posiadającym enzymów rozkładających cząsteczki
białka.

2. Podłoża wzbogacone



służą do hodowli drobnoustrojów o znacznych
wymaganiach odżywczych



substancje wzbogacające:



krew 5-10%,



surowica,



wyciąg drożdżowy,



glukoza,



żółtko jaja.

Agar z krwią

3. Podłoża wybiórczo - namnażające



używane do wyosobniania tylko określonego gatunku
drobnoustroju z materiału silnie zakażonego inną florą,



podłoże podstawowe + czynnik wzmagający wzrost
danych bakterii + odczynnik hamujący wzrost
niepożądanych drobnoustrojów



Np. pożywka Müller-Kauffmanna:



żółć wzmaga namnażanie pałeczek rodzaju
Salmonella



zieleń malachitowa lub brylantowa hamuje wzrost
E.coli



pożywka SF wg Leifsona: dla Salmonella i Shigella -
inhibitorem wzrostu dla innych bakterii jest kwaśny
selenin sodowy.

4. Podłoża różnicujące



zawierają substancję, która musi być rozłożona
enzymatycznie przez określone szczepy bakterii, a przez
inne nie naruszona; takimi substancjami mogą być np.
cukry, alkohole, glikozydy,



stosowane do odróżniania poszczególnych gatunków
bakterii na podstawie ich odmiennych właściwości
biochemicznych,



do stałych pożywek różnicujących zaliczamy:



podłoże Krumwieda (Salmonella, Shigella, Escherichia,
Klebsiella),



podłoże Kliglera;



do płynnych: barwny szereg pożywek

5. Podłoża kombinowane (wybiórczo – różnicujące)



stosowane w odróżnianiu poszczególnych gatunków bakterii
na podstawie odmiennych właściwości biochemicznych,



ogólny skład:



podłoże odżywcze



substancja diagnostyczna



wskaźnik (indykator)



inhibitor (barwniki, antybiotyki, sole kwasów
organicznych)

Przykłady pożywek wybiórczo - różnicujących

Podłoże Chapmana



stosowane do izolacji gronkowców (Staphylococcus aureus i St.
epidermitis)



skład:



podłoże odżywcze - bulion + pepton + agar



substancja diagnostyczna - mannitol (rozkładany przez St. aureus)



wskaźnik - czerwień fenolowa (kolor różowy lub żółty, w zależności
od pH)



inhibitor - 7,5% NaCl

St. aureus rozkłada mannitol, co powoduje
zakwaszenie pożywki. Pod wpływem obniżonego
pH następuje zmiana barwy wskaźnika (czerwieni
fenolowej) z różowej na żółtą. Szczepy St. aureus
wyrastają w postaci dużych kolonii, średnicy 1-3
mm, otoczonych wyraźną żółtą strefą. Szczepy St.
epidermitis rosną w postaci kolonii białych. NaCl
spełnia tu rolę hamującą wzrost innych
drobnoustrojów.

Podłoże Chapmana

Wzrost gronkowców na podłożu Chapmana

Rozkład mannitolu

i wzrost na podłożu

(żółte kolonie)

Brak wzrostu i

rozkładu

mannitolu

Brak rozkładu

mannitolu i wzrost

na podłożu (kolonie

białe)

Podłoże MacConkey’a



stosowane do izolacji Shigella, Salmonella



skład:



podłoże odżywcze - bulion + pepton + agar



substancja diagnostyczna - laktoza (rozkładana przez bakterie
laktozo – dodatnie)



wskaźnik - czerwień obojętna (kolor czerwony lub buraczkowy)



inhibitor - sole kwasów żółciowych - dezoksyholan sodu

Wszystkie pałeczki Enterobacteriaceae rosną
obficie. Drobnoustroje, rozkładające laktozę,
powodują zakwaszenie pożywki, wskutek czego
następuje zmiana barwy wskaźnika czerwieni
obojętnej na czerwoną lub buraczkową.
Dodatkowo wokół wyrosłych kolonii wytrąca się
kwas dezoksyholowy. Kolonie drobnoustrojów
laktozo-ujemnych są bezbarwne, przejrzyste.
Rozwój drobnoustrojów Gram-dodatnich zostaje
zahamowany przez dezoksyholan sodu.

Podłoże MacConkey’a

Wzrost bakterii na podłożu MacConkey’a

E. Coli

(laktozo - dodatnia)

Proteus

(laktozo - ujemny)

Pożywka Levine’a



stosowana dla pałeczek Enterobacteriaceae



skład:



podłoże odżywcze - bulion + pepton + agar



substancja diagnostyczna - laktoza i sacharoza



wskaźnik - eozyna



inhibitor - błękit metylenowy

Bakterie nie fermentujące laktozy lub
fermentujące ją z opóźnieniem tworzą kolonie
przejrzyste lub opalizujące. Drobnoustroje
fermentujące laktozę i sacharozę tworzą kolonie
intensywnie zabarwione na kolor
czerwonofioletowy z metalicznym, zielonkawym
połyskiem. Niektóre pałeczki, rozkładające
laktozę, tworzą kolonie przejrzyste z zabarwionym
środkiem. Do tej grupy należą również: pożywka
Wilsona-Blaira, Endo, Sołtysa, SS i inne.

Pożywka Levine’a

Wzrost bakterii na podłożu Levine’a

Podłoże EMB (Eosin methylene blue agar)

Podłoże
Levine’a

E. coli

E. coli silnie
rozkładająca
laktozę

Kolonie słabiej
rozkładające laktozę

6. Podłoża specjalne



przeznaczone do hodowli drobnoustrojów o szczególnych
wymaganiach odżywczych



do tej grupy zalicza się:



pożywkę Löfflera (maczugowce błonicy) - zawiera
surowicę cielęcą lub baranią



pożywka Löewensteina-Jensena (prątki gruźlicy) -
zawiera białka i żółtka jaj



pożywka Tarozziego-Wrzoska (hodowla beztlenowców)
- zawiera zmieloną wątrobę, pokryta jest warstwą
płynnej parafiny



agar czekoladowy (hodowla małych pałeczek)

Ważne terminy:



Kolonia – charakterystyczne dla rodzaju lub gatunku skupienia dużej
ilości komórek wyrosłych na pożywce zestalonej przy założeniu, że
rozmnożyły się one z jednej komórki bakteryjnej. Kolonie są najczęściej
widoczne gołym okiem.



Podstawowym wymaganiem w badaniach fizjologii i morfologii
drobnoustrojów jest praca z czystymi kulturami. Pod pojęciem tym
rozumie się hodowlę wyprowadzoną z jednej komórki bakteryjnej. Do
wyosabniania czystych kultur wykorzystuje się pożywki proste lub
wzbogacone. Uzyskana którymś z tych sposobów pojedyncza kolonia
bakteryjna stanowi jeden klon.



Kulturą mieszaną nazywamy hodowlę z różnymi gatunkami
drobnoustrojów.



Różne klony, należące do tego samego gatunku, izolowane niezależnie od
siebie nazywamy w mikrobiologii szczepami. Szczepy zachowują zwykle
literowe i numeryczne oznaczenia zaproponowane przez badacza, który
je izolował i zidentyfikował

Metody stosowane do wyosabniania czystych

kultur

Metody bezpośrednie

1. za pomocą mikromanipulatorów

Izolowanie pojedynczej komórki z wykorzystaniem mikromanipulatorów.
Badany materiał rozcieńcza się i pobierając z niego jedną kroplę
umieszcza się ją w specjalnej komorze aparatu, a następnie za pomocą
specjalnej pipetki wychwytuje się jedną komórkę, którą przenosi się do
kropli pożywki. Cała manipulacja musi przebiegać w warunkach
sterylnych.

2. kropelkowa – Lindnera

Badany płyn rozcieńcza się w takim stopniu, by w pobieranych kropelkach
znajdowały się komórki w ilości od 1 do kilku. Kropelki przenosi się za
pomocą mikropipetki pasterowskiej na szkiełko przykrywkowe i ogląda się
w komorze wilgotnej pod mikroskopem. Następnie wyszukuje się takie
kropelki, w których obecna jest tylko jedna komórka.