WYKŁAD III

WYKŁAD III

REPLIKACJA DNA

REPLIKACJA DNA

REPLIKACJA-PODWAJANIE-

REPLIKACJA-PODWAJANIE-

DUPLIKACJA DNA

DUPLIKACJA DNA



Replikacja DNA

Replikacja DNA

to proces, w którym

to proces, w którym

podwójna nić

podwójna nić

DNA

DNA

ulega skopiowaniu

ulega skopiowaniu



Nie licząc niewielkiego

Nie licząc niewielkiego

prawdopodobieństwa (ok. 1 błąd na

prawdopodobieństwa (ok. 1 błąd na

109 nukleotydów) wystąpienia błędu

109 nukleotydów) wystąpienia błędu

obie cząsteczki DNA

obie cząsteczki DNA

będą identyczne.

będą identyczne.

Replikacja jest

Replikacja jest

semikonserwatywna -

semikonserwatywna -



w każdej z dwóch uzyskanych

w każdej z dwóch uzyskanych

podwójnych nici DNA jedna nić

podwójnych nici DNA jedna nić

będzie macierzysta i jedna nowa.

będzie macierzysta i jedna nowa.

Substratami tego procesu są:

Substratami tego procesu są:

matryca DNA;

matryca DNA;

trifosforany

trifosforany

deoksyrybonukleotydów (dNTP);

deoksyrybonukleotydów (dNTP);



W replikacji uczestniczą różne

W replikacji uczestniczą różne

enzymy, m. in.

enzymy, m. in.

POLIMERAZY DNA,

POLIMERAZY DNA,

dla których substratami są:

dla których substratami są:



TRIFOSFONUKLEOTYDY,

TRIFOSFONUKLEOTYDY,

od których odrywają dwie

od których odrywają dwie

reszty P

reszty P

Enzymy te mogą przyłączyć

Enzymy te mogą przyłączyć

trifisosfonukleotydy tylko do

trifisosfonukleotydy tylko do

końca 3’

końca 3’



Dlatego synteza nowej nici

Dlatego synteza nowej nici

odbywa się od 5’ do 3’,

odbywa się od 5’ do 3’,

natomiast odczytywanie

natomiast odczytywanie

sekwencji odbywa się

sekwencji odbywa się

od 3’ do 5’

od 3’ do 5’

cząsteczka DNA jest dwuniciowa, a

cząsteczka DNA jest dwuniciowa, a

każda z tych nici ułożona jest

każda z tych nici ułożona jest

przeciwrównolegle,

przeciwrównolegle,



tzn. komplementarna nic biegnie

tzn. komplementarna nic biegnie

w kierunku przeciwnym (ale obie

w kierunku przeciwnym (ale obie

od 5’ do 3’), i to oznacza,

od 5’ do 3’), i to oznacza,



że druga nowa nić powstaje w

że druga nowa nić powstaje w

kierunku odwrotnym od lewej do

kierunku odwrotnym od lewej do

prawej i od prawej do lewej, ale

prawej i od prawej do lewej, ale

zawsze synteza – obu nici

zawsze synteza – obu nici

odbywa się od 5’ do 3’.

odbywa się od 5’ do 3’.

nici w DNA są ułożone

nici w DNA są ułożone

przeciwrównolegle

przeciwrównolegle

Polimerazy DNA mogą przyłączać

Polimerazy DNA mogą przyłączać

nukleotydy do końca 3’ czyli w

nukleotydy do końca 3’ czyli w

pozycji C3’ w cząsteczce cukru, ale

pozycji C3’ w cząsteczce cukru, ale

tylko

tylko

do istniejącego już łańcucha

do istniejącego już łańcucha

polinukleotydowego.

polinukleotydowego.



Dlatego w miejscu rozpoczęcia syntezy

Dlatego w miejscu rozpoczęcia syntezy

nowej nici potrzebny jest krótki odcinek

nowej nici potrzebny jest krótki odcinek

RNA, 5-10 nukleotydowy zwany

RNA, 5-10 nukleotydowy zwany

starterem

starterem

albo

albo

primerem.

primerem.



Jest on syntetyzowany przez PRIMAZĘ

Jest on syntetyzowany przez PRIMAZĘ

(jest to polimeraza RNA, u bakterii jest

(jest to polimeraza RNA, u bakterii jest

to specyficzna polimeraza DNA),

to specyficzna polimeraza DNA),

która jest składnikiem kompleksu

która jest składnikiem kompleksu

inicjującego replikację zwanego

inicjującego replikację zwanego

PRIMOSOMEM.

PRIMOSOMEM.



PRIMOSOM - jest to kompleks enzymów

PRIMOSOM - jest to kompleks enzymów

i białek niezbędnych do replikacji.

i białek niezbędnych do replikacji.

Czy replikacja DNA może się

Czy replikacja DNA może się

odbywać bez udziału startera?

odbywać bez udziału startera?



Tak, jednak pod warunkiem, że jest

Tak, jednak pod warunkiem, że jest

obecna grupa hydroksylowa w

obecna grupa hydroksylowa w

pozycji C3’ pentozy.

pozycji C3’ pentozy.



Polimeraza DNA może przyłączyć

Polimeraza DNA może przyłączyć

nukleotyd w miejscu pęknięcia

nukleotyd w miejscu pęknięcia

pojedynczej nici DNA, lub na końcu

pojedynczej nici DNA, lub na końcu

pojedynczego łąńcucha

pojedynczego łąńcucha

RNA starterowy

RNA starterowy



zostaje wycięty przez

zostaje wycięty przez

egzonukleazę.

egzonukleazę.



Następnie jest zastępowany nowymi

Następnie jest zastępowany nowymi

fragmentami DNA

fragmentami DNA



Nowe odcinki DNA są łączone przez

Nowe odcinki DNA są łączone przez

ligazę

ligazę

DNA,

DNA,

która uzupełnia brakujące wiązania

która uzupełnia brakujące wiązania

fosfodiestrowe w szkielecie nowo-

fosfodiestrowe w szkielecie nowo-

zsyntezowanej nici DNA

zsyntezowanej nici DNA

Czy startery są zawsze

Czy startery są zawsze

wycinane?

wycinane?



Startery u ssaków w genomie

Startery u ssaków w genomie

jądrowym są wycinane wszystkie

jądrowym są wycinane wszystkie

lub prawie wszystkie

lub prawie wszystkie



W genomie mitochondrialnym

W genomie mitochondrialnym

startery nie są wycinane – pozostają

startery nie są wycinane – pozostają

w kolistym DNA.

w kolistym DNA.

Polimeraza DNA działa jedynie w

Polimeraza DNA działa jedynie w

kierunku od końca 3' do końca 5' (czyli

kierunku od końca 3' do końca 5' (czyli

syntetyzuje nową nić w kierunku od 5'

syntetyzuje nową nić w kierunku od 5'

do 3').

do 3').



Z tego powodu jedna z nici w

Z tego powodu jedna z nici w

cząsteczce DNA jest syntezowana w

cząsteczce DNA jest syntezowana w

sposób ciągły, gdyż synteza przebiega

sposób ciągły, gdyż synteza przebiega

zgodnie z kierunkiem

zgodnie z kierunkiem

powstawania

powstawania

rozwidlenia (widełek).

rozwidlenia (widełek).



Druga nić, która jest syntetyzowana

Druga nić, która jest syntetyzowana

w kierunku przeciwnym do

w kierunku przeciwnym do

kierunku powstawania

kierunku powstawania

rozwidlenia (widełek)

rozwidlenia (widełek)

syntezowana jest w sposób

syntezowana jest w sposób

nieciągły

nieciągły



i powstają odcinki, tzw.

i powstają odcinki, tzw.

fragmenty Okazaki.

fragmenty Okazaki.

Do syntezy nieciągłej potrzebne są

Do syntezy nieciągłej potrzebne są

liczne startery

liczne startery

Nić syntetyzowana na matrycowym

Nić syntetyzowana na matrycowym

łańcuchu DNA jest w sposób ciągły,

łańcuchu DNA jest w sposób ciągły,

nazywa się

nazywa się

prowadzącą

prowadzącą

lub

lub

wiodącą

wiodącą

, a

, a

druga powstająca na nici kodującej–

druga powstająca na nici kodującej–

nicią

nicią

opóźnioną

opóźnioną

Fragmenty Okazaki

Fragmenty Okazaki



W czasie replikacji cząsteczki DNA

W czasie replikacji cząsteczki DNA

nawinięte na rdzeniach nukleosomów

nawinięte na rdzeniach nukleosomów

zostają uwolnione ze struktury

zostają uwolnione ze struktury

nukleosomów, i prawdopodobnie dlatego:

nukleosomów, i prawdopodobnie dlatego:



fragmenty Okazaki u eukariontów są

fragmenty Okazaki u eukariontów są

krótsze (100-350pz, u prokariontów 1-

krótsze (100-350pz, u prokariontów 1-

2kpz)

2kpz)



liczba przyłączonych nukleotydów w

liczba przyłączonych nukleotydów w

jednostce czasu u Euk. jest mniejsza.

jednostce czasu u Euk. jest mniejsza.



Po przejściu widełek replikacyjnych

Po przejściu widełek replikacyjnych

struktura nukleosomu zostaje odtworzona.

struktura nukleosomu zostaje odtworzona.

Kopiowanie podwójnej helisy DNA jest

Kopiowanie podwójnej helisy DNA jest

procesem złożonym.

procesem złożonym.



Proces dzieli się na fazy :

Proces dzieli się na fazy :



inicjacji,

inicjacji,



wydłużania

wydłużania



i terminacji.

i terminacji.

Inicjacja replikacji DNA – w

Inicjacja replikacji DNA – w

specyficznych sekwencjach zasad

specyficznych sekwencjach zasad

nazywanych

nazywanych

miejscem inicjacji

miejscem inicjacji

replikacji.

replikacji.



W kolistych cząsteczkach DNA

W kolistych cząsteczkach DNA

replikacja rozpoczyna się w miejscu

replikacja rozpoczyna się w miejscu

inicjacji, o długości ok. 200-300 par

inicjacji, o długości ok. 200-300 par

nukleotydów. Miejsce to oznacza się

nukleotydów. Miejsce to oznacza się

skrótem

skrótem

ori

ori

od ang.

od ang.

origin

origin

.

.



W aktywnych chromosomach liniowych

W aktywnych chromosomach liniowych

przebiegać może wiele (tysiące)

przebiegać może wiele (tysiące)

jednoczesnych procesów replikacji.

jednoczesnych procesów replikacji.

Helikazy DNA.

Helikazy DNA.

To enzymy, które

To enzymy, które

rozrywają wiązania wodorowe między

rozrywają wiązania wodorowe między

nićmi matrycowego DNA, rozkręcając

nićmi matrycowego DNA, rozkręcając

helisę

i

umożliwiając

rozpoczęcie

helisę

i

umożliwiając

rozpoczęcie

procesu; powstają widełki replikacyjne

procesu; powstają widełki replikacyjne

Widełki replikacyjne

Widełki replikacyjne



to miejsce jednoczesnego rozwijania

to miejsce jednoczesnego rozwijania

cząsteczki DNA i syntezowania

cząsteczki DNA i syntezowania

nowych nici podczas replikacji.

nowych nici podczas replikacji.



Replikacja następuje

Replikacja następuje

tylko w widełkach

tylko w widełkach

replikacyjnych.

replikacyjnych.

Oczko replikacyjne - Z czasem

Oczko replikacyjne - Z czasem

rozpoczyna się również replikacja po

rozpoczyna się również replikacja po

stronie przeciwnej rozwidlenia.

stronie przeciwnej rozwidlenia.

Jednoniciowe łańcuchy w widełkach

Jednoniciowe łańcuchy w widełkach

replikacyjnych są usztywniane białkami SSB

replikacyjnych są usztywniane białkami SSB

destabilizującymi heliks – zapobiegają

destabilizującymi heliks – zapobiegają

ponownemu skręcaniu

ponownemu skręcaniu

.

.



SSB (Single-Strand-Binding-

SSB (Single-Strand-Binding-

protein) - białka destabilizujące

protein) - białka destabilizujące

heliks

heliks



GYRAZA DNA - wprowadza

GYRAZA DNA - wprowadza

ujemne skręty, przywraca

ujemne skręty, przywraca

topologię heliksu

topologię heliksu



TOPOIZOMERAZA - relaksuje

TOPOIZOMERAZA - relaksuje

napięcia pojedynczych nici

napięcia pojedynczych nici

REPLIZOM

REPLIZOM



Kompleks enzymów niezbędnych do

Kompleks enzymów niezbędnych do

replikacji to replisom.

replikacji to replisom.



PRIMOSOM – kompleks inicjacji,

PRIMOSOM – kompleks inicjacji,

składa się z białek rozpoznających

składa się z białek rozpoznających

ori

ori

i prymaz, które syntetyzują startery

i prymaz, które syntetyzują startery



REPLIKON = REPLIZOM +

REPLIKON = REPLIZOM +

ori

ori

Etapy replikacji DNA u

Etapy replikacji DNA u

Procaryota:inicjacja, elongacja,

Procaryota:inicjacja, elongacja,

terminacja

terminacja



Inicjacja

Inicjacja

składa się z 3 etapów:

składa się z 3 etapów:



Pierwszy - synteza RNA starterowego

Pierwszy - synteza RNA starterowego

przez prymazy

przez prymazy



Drugi – wiązanie białka inicjatorowego

Drugi – wiązanie białka inicjatorowego

do sekwencji

do sekwencji

ori,

ori,

jest tylko jedno takie

jest tylko jedno takie

miejsce

miejsce



Trzeci – dołącza się helikaza i powstaje

Trzeci – dołącza się helikaza i powstaje

oczko replikacyjne o wielkości 45-60pz,

oczko replikacyjne o wielkości 45-60pz,

a widełki stopniowo się przesuwają i

a widełki stopniowo się przesuwają i

następuje

następuje

elongacja

elongacja

Replikacja DNA kolistego

Replikacja DNA kolistego

Inicjacja replikacji DNA w

Inicjacja replikacji DNA w

komórkach wyższych

komórkach wyższych

Eucaryota

Eucaryota



Zamiast miejsc inicjacji są strefy inicjacji

Zamiast miejsc inicjacji są strefy inicjacji



Zawierają wiele potencjalnych miejsc

Zawierają wiele potencjalnych miejsc

inicjacji

inicjacji



Składają się z 10 tys. pz

Składają się z 10 tys. pz



Występują w obszarach międzygenowych

Występują w obszarach międzygenowych



Strefy inicjacji są kontrolowane przez:

Strefy inicjacji są kontrolowane przez:



-białka struktury chromatyny

-białka struktury chromatyny

(nukleosomy)

(nukleosomy)



-białka szkieletowe macierzy jądrowej

-białka szkieletowe macierzy jądrowej

Terminacja u bakterii

Terminacja u bakterii



Naprzeciwko sekwencji inicjującej

Naprzeciwko sekwencji inicjującej

znajduje się sygnał terminacji, są nim

znajduje się sygnał terminacji, są nim

sekwencje 800pz, sekwencje

sekwencje 800pz, sekwencje

ter,

ter,

symetrycznie ułożone po obu

symetrycznie ułożone po obu

stronach, czyli na obu ramionach.

stronach, czyli na obu ramionach.



Sekwencje te kodują białko

Sekwencje te kodują białko

terminacyjne, które jest supresorem

terminacyjne, które jest supresorem

replikacji i inhibitorem helikazy

replikacji i inhibitorem helikazy

TERMINACJA

TERMINACJA



U Eucaryota brak jest sekwencji

U Eucaryota brak jest sekwencji

terminacyjnych. Replikacja każdego

terminacyjnych. Replikacja każdego

replikonu kończy się wraz z

replikonu kończy się wraz z

zetknięciem się widełek

zetknięciem się widełek

replikacyjnych podążających z

replikacyjnych podążających z

przeciwnych kierunków ku sobie.

przeciwnych kierunków ku sobie.

Typy replikacji

Typy replikacji

POLIMERAZY DNA

POLIMERAZY DNA