WYKŁAD III

REPLIKACJA DNA

REPLIKACJA-PODWAJANIE-DUPLIKACJA DNA

0. Replikacja DNA to proces, w którym podwójna nić DNA ulega skopiowaniu

1. Nie licząc niewielkiego prawdopodobieństwa (ok. 1 błąd na 109 nukleotydów) wystąpienia błędu

obie cząsteczki DNA

będą identyczne.

Replikacja jest semikonserwatywna -

0. w każdej z dwóch uzyskanych podwójnych nici DNA jedna nić będzie macierzysta i jedna nowa.

Substratami tego procesu są:
matryca DNA;
trifosforany deoksyrybonukleotydów (dNTP);

0. W replikacji uczestniczą różne

enzymy, m. in.

POLIMERAZY DNA,

dla których substratami są:

0. TRIFOSFONUKLEOTYDY,

od których odrywają dwie

reszty P

Enzymy te mogą przyłączyć trifisosfonukleotydy tylko do końca 3’

0. Dlatego synteza nowej nici

odbywa się od 5’ do 3’,

natomiast odczytywanie

sekwencji odbywa się

od 3’ do 5’

cząsteczka DNA jest dwuniciowa, a każda z tych nici ułożona jest przeciwrównolegle,

0. tzn. komplementarna nic biegnie w kierunku przeciwnym (ale obie od 5’ do 3’), i to oznacza,

1. że druga nowa nić powstaje w kierunku odwrotnym od lewej do prawej i od prawej do lewej, ale zawsze synteza – obu nici odbywa się od 5’ do 3’.
   
   
   

nici w DNA są ułożone przeciwrównolegle

Polimerazy DNA mogą przyłączać nukleotydy do końca 3’ czyli w pozycji C3’ w cząsteczce cukru, ale tylko do istniejącego już łańcucha polinukleotydowego.

0. Dlatego w miejscu rozpoczęcia syntezy nowej nici potrzebny jest krótki odcinek RNA, 5-10 nukleotydowy zwany starterem albo primerem.

0. Jest on syntetyzowany przez PRIMAZĘ (jest to polimeraza RNA, u bakterii jest to specyficzna polimeraza DNA),

która jest składnikiem kompleksu inicjującego replikację zwanego PRIMOSOMEM.

0. PRIMOSOM - jest to kompleks enzymów i białek niezbędnych do replikacji.

Czy replikacja DNA może się odbywać bez udziału startera?

0. Tak, jednak pod warunkiem, że jest obecna grupa hydroksylowa w pozycji C3’ pentozy.

1. Polimeraza DNA może przyłączyć nukleotyd w miejscu pęknięcia pojedynczej nici DNA, lub na końcu pojedynczego łąńcucha

RNA starterowy

0. zostaje wycięty przez egzonukleazę.

0. Następnie jest zastępowany nowymi fragmentami DNA

1. Nowe odcinki DNA są łączone przez ligazę DNA, która uzupełnia brakujące wiązania fosfodiestrowe w szkielecie nowo-zsyntezowanej nici DNA

Czy startery są zawsze wycinane?

0. Startery u ssaków w genomie jądrowym są wycinane wszystkie lub prawie wszystkie

1. W genomie mitochondrialnym startery nie są wycinane – pozostają w kolistym DNA.

Polimeraza DNA działa jedynie w kierunku od końca 3' do końca 5' (czyli syntetyzuje nową nić w kierunku od 5' do 3').

0. Z tego powodu jedna z nici w cząsteczce DNA jest syntezowana w sposób ciągły, gdyż synteza przebiega zgodnie z kierunkiem powstawania rozwidlenia (widełek).

0. Druga nić, która jest syntetyzowana w kierunku przeciwnym do kierunku powstawania rozwidlenia (widełek) syntezowana jest w sposób nieciągły

1. i powstają odcinki, tzw. fragmenty Okazaki.

Do syntezy nieciągłej potrzebne są liczne startery

Nić syntetyzowana na matrycowym łańcuchu DNA jest w sposób ciągły, nazywa się prowadzącą lub wiodącą, a druga powstająca na nici kodującej–nicią opóźnioną

Fragmenty Okazaki

0. W czasie replikacji cząsteczki DNA nawinięte na rdzeniach nukleosomów zostają uwolnione ze struktury nukleosomów, i prawdopodobnie dlatego:

1. fragmenty Okazaki u eukariontów są krótsze (100-350pz, u prokariontów 1-2kpz)

2. liczba przyłączonych nukleotydów w

jednostce czasu u Euk. jest mniejsza.

0. Po przejściu widełek replikacyjnych struktura nukleosomu zostaje odtworzona.

Kopiowanie podwójnej helisy DNA jest procesem złożonym.

0. Proces dzieli się na fazy :

1. inicjacji,

2. wydłużania

3. i terminacji.

Inicjacja replikacji DNA – w specyficznych sekwencjach zasad nazywanych miejscem inicjacji replikacji.

0. W kolistych cząsteczkach DNA replikacja rozpoczyna się w miejscu inicjacji, o długości ok. 200-300 par nukleotydów. Miejsce to oznacza się skrótem ori od ang. origin.

1. W aktywnych chromosomach liniowych przebiegać może wiele (tysiące) jednoczesnych procesów replikacji.

Helikazy DNA. To enzymy, które rozrywają wiązania wodorowe między nićmi matrycowego DNA, rozkręcając helisę i umożliwiając rozpoczęcie procesu; powstają widełki replikacyjne

Widełki replikacyjne

0. to miejsce jednoczesnego rozwijania cząsteczki DNA i syntezowania nowych nici podczas replikacji.

1. Replikacja następuje

tylko w widełkach

replikacyjnych.

Oczko replikacyjne - Z czasem rozpoczyna się również replikacja po stronie przeciwnej rozwidlenia.

Jednoniciowe łańcuchy w widełkach replikacyjnych są usztywniane białkami SSB destabilizującymi heliks – zapobiegają ponownemu skręcaniu.

0. SSB (Single-Strand-Binding-protein) - białka destabilizujące heliks

0. GYRAZA DNA - wprowadza ujemne skręty, przywraca topologię heliksu

1. TOPOIZOMERAZA - relaksuje napięcia pojedynczych nici

REPLIZOM

0. Kompleks enzymów niezbędnych do replikacji to replisom.

0. PRIMOSOM – kompleks inicjacji, składa się z białek rozpoznających ori i prymaz, które syntetyzują startery

1. REPLIKON = REPLIZOM + ori

Etapy replikacji DNA u Procaryota:inicjacja, elongacja, terminacja

0. Inicjacja składa się z 3 etapów:

1. Pierwszy - synteza RNA starterowego przez prymazy

2. Drugi – wiązanie białka inicjatorowego do sekwencji ori, jest tylko jedno takie miejsce

3. Trzeci – dołącza się helikaza i powstaje oczko replikacyjne o wielkości 45-60pz, a widełki stopniowo się przesuwają i następuje elongacja

Replikacja DNA kolistego

Inicjacja replikacji DNA w komórkach wyższych Eucaryota

0. Zamiast miejsc inicjacji są strefy inicjacji

1. Zawierają wiele potencjalnych miejsc inicjacji

2. Składają się z 10 tys. pz

3. Występują w obszarach międzygenowych

4. Strefy inicjacji są kontrolowane przez:

5. -białka struktury chromatyny (nukleosomy)

6. -białka szkieletowe macierzy jądrowej

Terminacja u bakterii

0. Naprzeciwko sekwencji inicjującej znajduje się sygnał terminacji, są nim sekwencje 800pz, sekwencje ter, symetrycznie ułożone po obu stronach, czyli na obu ramionach.

1. Sekwencje te kodują białko terminacyjne, które jest supresorem replikacji i inhibitorem helikazy

TERMINACJA

0. U Eucaryota brak jest sekwencji terminacyjnych. Replikacja każdego replikonu kończy się wraz z zetknięciem się widełek replikacyjnych podążających z przeciwnych kierunków ku sobie.

Typy replikacji

POLIMERAZY DNA