Modele zwierzęce chorób

autoimmunizacyjnych

Eksperymentalne autoimmunologiczne

zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego

(experimental autoimmune

encephalomyelitis, EAE)

• Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie

mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) - choroba zapalna
ośrodkowego układu nerwowego powszechnie
wykorzystywana

jako

model

stwardnienia

rozsianego (multiple sclerosi, MS).

• Cechuje się okresami pogorszenia oraz remisji,

utratą przewodnictwa nerwowego oraz stałym
postępem niepełnosprawności.

• Makrofagi oraz limfocyty T pośredniczą w destrukcji

osłonki mielinowej otaczającej nerwy, prowadząc do
zakłócenia przewodnictwa impulsów nerwowych.

Główną metodą indukcji EAE u zwierząt jest

immunizacja przy pomocy białka substancji białej

OUN, takiego jak:

• podstawowe białko mieliny (BMP),
• białko proteolipidowe (PLP),
• mielinowa glikoproteina oligodendrocytów (MOG),

co skutkuje powstaniem ostrej postaci choroby o

cechach MS.

Poprzez użycie różnych antygenów i adjuwantów,

można uzyskać przewlekłą, nawracającą postać EAE.

• Wyróżniamy 4 typy EAE (ze względu na

kliniczny przebieg choroby):
- ostre śmiertelne EAE;
- przewlekłe postępujące EAE;
- przewlekłe nawracające EAE;
- przewlekłe EAE z opóźnionym rozwojem.

• Ostre śmiertelne EAE - gwałtowny spadek masy ciała, osłabienie

tylnych kończyn, zaburzony chód zwierzęcia, gwałtownie
przekształcający się w paraliż zaatakowanych kończyn,
nietrzymanie moczu i osłabione oddychanie, śmierć zwierzęcia
krótko po immunizacji.

• Przewlekłe postępujące EAE – powolny rozwój choroby, ale

postępujący w przeciągu dwóch tygodni.

• Przewlekłe nawracające EAE - rozwój ostrej postaci choroby z

różnorodną intensywnością. Objawy choroby łagodne takie, jak
osłabienie kończyn tylnych, zaburzony chód oraz nietrzymanie
moczu lub ostra paraplegia tylnych kończyn. Po całkowitym
wyzdrowieniu, które najczęściej ma miejsce po ok. miesiącu,
obserwuje się nawrót choroby.

• Przewlekłe EAE z opóźnionym rozwojem - utrata wagi i ogólne

osłabienie w dwa tygodnie po immunizacji, z objawami
neurologicznymi rozpoczynającymi się miesiąc lub dwa miesiące
później.

•

EAE jest chorobą wielogenową, więc podatność
oraz przebieg kliniczny mogą się różnić w
zależności od użytego antygenu (np. MBP lub PLP)
oraz

od

szczepu/gatunku

zwierzęcia

wykorzystanego do badań. Tak więc EAE nie jest
pojedynczym modelem choroby, ale wieloma
modelami, które wykazują różnorodny poziom
podobieństwa do MS.

Aktywny model EAE

• W aktywnym modelu EAE podatne szczepy

myszy

immunizowane

są

odpowiednim

antygenem

mielinowym

lub

białkiem

emulgowanym w kompletnym adjuwancie

Freund’a (CFA).

• Myszom zwykle podaje się również toksynę

pałeczki krztuśca (PT) w dniu immunizacji oraz

48h później. Uważa się, że PT odgrywa istotną

rolę w przełamaniu bariery krew-mózg.

• W zależności od wykorzystanego szczepu myszy

oraz rodzaju antygenu, EAE rozwija się 10 do

15 dnia po pierwszej immunizacji.

• Po aktywnej immunizacji zachorowalność wynosi

75% do 80%.

• Bardzo często po aktywnej immunizacji przebieg

choroby jest monofazowy. Istotnym wyjątkiem

jest aktywny model EAE indukowany w myszach

szczepu SJL lub (SJL × SWR) F1 z

wykorzystaniem PLP 139-151 emulgowanego w

CFA. W tym przypadku myszy rozwijają

nawracająco-ustępującą postać choroby, która

rozwija się bez użycia PT.

• Dawka i rodzaj immunizacji oraz szczep

wykorzystany do badań decydują o ciężkości

przebiegu indukowanej choroby, który może

wahać się od łagodnego do śmiertelnego.

• Nie wszystkie szczepy gryzoni są jednakowo podatne na

indukcję EAE. Klasycznymi szczepami podatnymi na
immunizację MBP oraz PLP są szczury Lewisa i DA oraz
myszy SJL/J i PL/J. Immunizacja MOG wywołuje EAE u
kilku dodatkowych szczepów, przede wszystkim u
szczurów BN i u myszy C57BL/6 i BALB/c, które są
odporne na immunizację MBP czy PLP.

• Aktywnie indukowane EAE nie dotyczy wyłącznie

gryzoni, można je wywoływać u naczelnych, np. u rezusa
czy małpy szerokonosej (Callithrix jacchus). Tak jak u
gryzoni, dawka, rodzaj autoantygenu i adjuwant
wykorzystane do immunizacji decydują o charakterze
choroby. Obecnie większość badań nad EAE u
naczelnych

opartych

jest

na

immunizacji

rekombinowanym ludzkim MOG w CFA, co skutkuje
indukcją choroby neurologicznie i histologicznie
podobnej do ludzkiego MS.

Bierny model EAE

• W biernym modelu EAE jest indukowane poprzez wstrzyknięcie

do myszy aktywowanych komórek T mielinospecyficznych. Te
aktywowane komórki T są generowane poprzez immunizację
myszy (donorów) za pomocą białka mieliny lub peptydu
emulgowanego w CFA. Węzły chłonne są usuwane, a komórki T
aktywowane ponownie in vitro przy pomocy odpowiedniego
antygenu. Tak aktywowane komórki T są przenoszone do myszy
(biorców), które następnie rozwijają EAE.

• Najczęściej w biernym modelu EAE stosuje się myszy SJL lub

(PL x SJL) F1 oraz białko MBP jako antygen indukujący. W tym
modelu EAE myszy rozwijają nawracająco-ustępującą formę
choroby.

• Po

uzyskaniu

linii

komórkowych

monospecyficznych

limfocytów T ze szczurów Lewis, a następnie z myszy, okazało
się, że autoimmunologicznymi komórkami efektorowymi
przenoszącymi EAE są limfocyty T pomocnicze (CD4+), które
rozpoznają autoantygenne epitopy białka w kontekście
determinant MHC klasy II.

• Wiele z tych komórek odpowiada na aktywację wydzielając

interferon-γ i TNF-α, ale nie IL-4 czy IL-5, i dlatego zostały
sklasyfikowane jako komórki Th-1.

• Niedawno odkryto jednak, że ta populacja zawiera szczególny

podzbiór komórek T CD4+, które wydzielały IL-17 zamiast
interferonu-γ , były to komórki Th17. Obecnie komórki T Th17
uznaje się za „prawdziwe” patogenne mediatory.

• Bierny model EAE był również wywoływany u naczelnych. Z krwi

małej grupy rezusów wyizolowano MBPspecyficzne komórki T, z
których stworzono linię komórkową. Te komórki były ponownie
aktywowane in vitro i wstrzyknięte do donora. W jednym przypadku
na trzy komórki T spowodowały łagodne zapalenie OUN.

• Transfer komórek T pomiędzy osobnikami nie hodowanymi wsobnie

nie przyniesie spodziewanych rezultatów z powodu niezgodności
tkankowej.

• Inaczej jest w przypadku małp szerokonosych, które rodzą się jako

bliźnięta dzielące to samo łożysko. Rodzeństwo posiada
immunologiczną tolerancję na siebie nawzajem, co pozwala na
wzajemne transplantacje tkanek. Kiedy linia komórek T
mielinospecyficznych wyprowadzona od jednego z bliźniąt była
wprowadzana do drugiego, wywoływało to EAE.

Spontaniczny model EAE

• Dwa zespoły badawcze (Krishnamoorthy i wsp. oraz Bettelli i

wsp.) wyhodowały podwójnie transgeniczne myszy u których
ekspresji ulegają receptory komórek B i T rozpoznające to samo
białko mielinowe. Myszy te powstały ze skrzyżowania dwóch linii
transgenicznych.

• Pierwsza linia myszy transgenicznych została wygenerowana za

pomocą

technologii

knock-in,

poprzez

wstawienie

rekombinowanego

łańcucha

ciężkiego

demielinizacyjnego

przeciwciała anty-MOG w region J immunoglobuliny. Dzięki temu
uzyskano myszy których 20-30% krążących komórek B wytwarza
przeciwciała anty-MOG oraz wykazuje ekspresję receptora
(BCR) rozpoznającego białko MOG. Myszy te nazwano IgH

MOG

.

• Druga linia, nazwana TCR

MOG

, została stworzona poprzez

ekspresję

TCR,

który

rozpoznaje

immunodominującą

determinantę białka MOG. Myszy te spontanicznie rozwijały
zapalenie nerwu wzrokowego, typowy wczesny objaw MS.

• Ponad połowa z tych myszy w wieku 8 tygodni

spontanicznie rozwinęła autoimmunizacyjną
demielinizację w ich rdzeniu kręgowym i nerwach
wzrokowych, co jest symptomem przypominającym
ludzkie stwardnienie rozsiane.

• Krishnamoorthy i wsp. nazwali ten model OSE. W

rdzeniu kręgowym uszkodzenia znajdowały się przede
wszystkim pod oponą miekką, tak jak w aktywnym
modelu EAE. W przeciwieństwie do OSE, spontaniczne
EAE występuje w większości powszechnie
wykorzystywanych modeli tylko w niewielkim zakresie,
lub po ekspozycji na drobnoustroje ewentualnie poprzez
eliminację komórek regulatorowych.

• Badania nad OSE wykazały, że ostry przebieg EAE oraz

zachorowalność nie są zakłócane przez takie czynniki,
jak płeć czy warunki hodowli.

(„A mighty mouse: building a better model of multiple sclerosis”

Richard M. Ransohof

)

Patogeneza EAE

• Komórki T odgrywają istotną rolę w przełamaniu

bariery krew-mózg oraz w patogenezie EAE. Za
indukcję procesu autoimmunizacji w EAE
odpowiadają

aktywowane

autoreaktywne

limfocyty T CD4+ swoiste względem składników
mieliny, wydzielające IFN-γ, IL-2, TNF-β. W
patogenezie EAE biorą udział również limfocyty
Th2, limfocyty T CD8+, makrofagi, limfocyty B,
limfocyty Th17 i prawdopodobnie komórki NK.

• Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i

rdzenia rozwija się wskutek infiltracji OUN przez limfocyty
Th1 uwalniające cytokiny prozapalne (IFN-γ, IL-2, TNF-β)
oraz makrofagi.

• Autoreaktywne komórki T rozpoznają antygeny mieliny,

które mogą być prezentowane przez okołonaczyniowe
makrofagi bariery krew-mózg. Po aktywacji limfocyty T
uwalniają cytokiny i chemokiny, które zmieniają ekspresję
molekuł adhezyjnych na otaczających komórkach, zwiększa
się przepuszczalność bariery krew-mózg i dochodzi do
rekrutacji komórek z krążenia do mózgu.

• Następstwem

autoimmunizacyjnego

zapalenia

jest

uszkodzenie mieliny i oligodendrocytów, jak również
aksonów, co prowadzi do utraty ich funkcji.

Podobieństwa i różnice między MS i

EAE

• Główną różnicą między MS i EAE jest to, że MS jest chorobą

spontaniczną, podczas gdy EAE jest indukowana poprzez

immunizację antygenami tkanki mózgowej.

• Ponadto, w większości protokołów, silny adjuwant jest

wykorzystywany do indukcji choroby. Nie wydaje się, że

podobnie silny immunologiczny czynnik występuje w

fizjologicznych warunkach, nawet w chorobach zakaźnych.

• Dla zapewnienia powtarzalności uzyskanych wyników, EAE

jest badane u osobników wsobnych lub homogennych

genetycznie. W ten sposób, genetyczna heterogenność,

która jest bardzo ważna w populacji osób ze stwardnieniem

rozsianym, jest odzwierciedlana tylko, kiedy różnorodne

modele EAE są badane równolegle.

• Podobnie jak w MS, EAE jest związane z wczesnym

naruszeniem bariery krew-mózg i ogniskowym przenikaniem

okołonaczyniowych jednojądrzastych komórek.

Model zwierzęcy

Podobieństwa do MS

Różnice z MS

Szczur Lewis

Aktywny model EAE

udział komórek T w

zapaleniu,słaba odpowiedź

przeciwciał

choroba jednofazowa, niewielka

demielinizacja

Bierny model EAE

udział komórek T w zapaleniu,

topografia choroby

choroba jednofazowa, niewielka

demielinizacja

Aktywny lub bierny model

EAE + wzajemny transfer

przeciwciał anty-MOG

udział komórek T w zapaleniu,

demielinizacja

tylko krótkotrwała demielinizacja

Szczur kongeniczny

Lewis, DA, BN

Aktywny model EAE

choroba nawracająco-ustępująca,

może naśladować histopatologię

SM

nie jest chorobą spontaniczną

Mysie EAE

Aktywny model EAE

choroba nawracająco-ustępująca

lub przewlekła postępująca,

demielinizacja i uszkodzenie

aksonów

nie jest chorobą spontaniczną

Myszy transgeniczne lub

typu knockout

szczegółowe określenie roli

badanych molekuł

immunologicznych/ cytokin

neurotroficznych/ szlaków

neuroanatomicznych

sztucznie stworzone zwierzęta

transgeniczne lub knock out

Eksperymentalna

autoimmunologiczna miastenia

rzekomoporaźna (experimental

autoimmune myasthenia gravis,

EAMG)

• Miastenia

rzekomoporaźna

(MG)

jest

chorobą

autoimmunologiczną nerwowo-mięśniową, w której uczestniczą

przeciwciała skierowane przeciwko nikotynowym receptorom

acetylocholinowym (AChR). Przeciwciała po połączeniu się z

AChR aktywują kaskadę dopełniacza.

• Główny mechanizm zaangażowany w destrukcję AChR jest

związany z aktywnością przeciwciał i dopełniacza.

• Również wiązanie krzyżowe AChR przez przeciwciała prowadzi

do antygenowej modulacji i może przyczyniać się do

zredukowania liczby tych receptorów w płytce nerwowo-

mięśniowej (neuromuscular junction, NMJ).

• Niewielka liczba przeciwciał anty-AChR może również wiązać

się z AChR i w ten sposób może zakłócać przewodnictwo

nerwowo-mięśniowe.

• Powyższe zjawiska patologiczne mogą prowadzić do defektów

w przekaźnictwie nerwowo-mięśniowym, objawiających się

osłabieniem i zmęczeniem mięśni szkieletowych u pacjentów z

MG.

• Eksperymentalna

autoimmunologiczna

miastenia

rzekomoporaźna zazwyczaj jest indukowana poprzez
immunizację

zwierząt

za

pomocą

AChR

drętwy

kalifornijskiej lub węgorza elektrycznego z adjuwantem.
EAMG może być również indukowana u szczurów i myszy
poprzez podanie surowicy od gryzoni z EAMG lub od
pacjentów,

lub

poprzez

podanie

przeciwciał

monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwko AChR.

Model aktywny EAMG

• W modelu aktywnym EAMG króliki, szczury i myszy

immunizowane są rybim, szczurzym, mysim lub ludzkim
AChR emulgowanym w CFA i rozwijają przewlekłą
postać EAMG, która w dużym stopniu przypomina ludzką
MG.

• W przewlekłej EAMG, typowe cechy patologiczne są

bardzo podobne do tych obserwowanych w MG i
obejmują redukcję

NMJ, znaczny spadek zawartości

AChR na błonie postsynaptycznej oraz odkładanie się
IgG i dopełniacza w NMJ.

• W tej formie EAMG nie obserwuje się żadnej znacznej

infiltracji komórkowej w lub blisko NMJ.

• Immunizacja szczurów Lewis za pomocą AChR w CFA

razem z toksyną pałeczki krztuśca (PT) prowadzi do
indukcji ostrej postaci EAMG, 7-11 dni po immunizacji,
charakteryzującej

się

odkładaniem

przeciwciał

i

dopełniacza oraz inwazją komórek fagocytarnych do NMJ.

• Małpy również rozwijają EAMG poprzez immunizację

AChR. Co jest ważne, małpy z EAMG wykazują
charakterystyczne opadanie powiek często obserwowane
w ludzkiej MG, natomiast nieobecne u gryzoni.

Model bierny EAMG

• EAMG może być również efektywnie indukowane u

gryzoni poprzez bierny transfer patogennych przeciwciał
(np. podanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych
przeciwko głównemu regionowi immunogennemu (MIR)
AChR) lub poprzez podanie surowicy zwierząt z EAMG.

• Bierny transfer EAMG z użyciem przeciwciał może

powodować osłabienie mięśniowe w ciągu 1 dnia. Próbki
mięśni

wykazały

infiltrację

NMJ

przez

komórki

jednojądrzaste, podobnie jak w ostrej postaci EAMG
indukowanej przez szczepienie receptorem ACh i PT.
Podobnie do modelu ostrej EAMG, bierny model nie jest
dokładnym

odzwierciedleniem

ludzkiej

miastenii

i

reprezentuje tylko efektorowy (czynny) etap choroby.

Patogeneza EAMG

• W EAMG i MG, wytwarzanie przeciwciał przeciwko AChR

jest zależne od komórek T i B.

• Różnorodne cytokiny wspomagają rozwój odpowiedzi

immunologicznej przeciwko AChR poprzez indukcję

ekspresji molekuł kostymulujących, dojrzewania komórek

T i B oraz produkcji przeciwciał i dopełniacza.

• Co ciekawe, zarówno cytokiny typu Th1, jak i Th2

odgrywają ważną rolę w indukcji EAMG i nieprawidłowe

funkcjonowanie jednego z tych systemów sprawia, że

myszy są bardzo odporne na indukcję choroby.

• Przeciwciała anty-AChR aktywują kaskadę dopełniacza i

formowanie

kompleksu

atakującego

błonę

(MAC),

wzmagając destrukcję NMJ pierwotnie dokonywaną przez

przeciwciała anty-AChR.

• Pomimo, że komórkowa infiltracja tkanki mięśniowej

wydaje się być istotnym czynnikiem przyczyniającym się do
rozwoju osłabienia mięśniowego w ostrej postaci EAMG u
gryzoni, niewielkie ilości komórek są obserwowane w
tkance mięśniowej przewlekłej postaci EAMG u gryzoni czy
ludzkiej MG. Prawdopodobnie, w przewlekłej postaci
EAMG, komórki jednojądrzaste wspomagają indukcję
osłabienia

mięśniowego

nie

poprzez

bezpośrednie

uszkodzenie komórek mięśniowych czy NMJ, ale poprzez
pomoc w wytworzeniu silnej odpowiedzi komórek T i B
przeciwko AChR.

Przeciwciała anty-AChR odgrywają istotną rolę w
patogenezie EAMG i MG poprzez blokowanie
receptora ACh, przez zwiększanie jego endocytozy lub
przez aktywowanie przebiegającego przy udziale
dopełniacza zapalnego niszczenia NMJ. Szczególnie
przeciwciała wiążące się do MIR na podjednostce α
cząsteczki AChR (ponad 50% wszystkich przeciwciał
anty-AChR w EAMG i MG) mają znaczenie
chorobotwórcze.

(„Unraveling myasthenia gravis immunopathogenesis using

animal models”

E. Tüzün, P. Christadoss

)

Podobieństwa i różnice między

EAMG i MG

• Podobieństwa:

- uogólnione osłabienie mięśniowe i męczliwość
zmieniające się w ciągu dnia
- predyspozycja genetyczna przynajmniej częściowo
kontrolowana przez cząsteczki MHC klasy II
-

zmniejszenie

amplitudy,

ale

nie

częstości

miniaturowych potencjałów płytki nerwowo-mięśniowej
- słabnąca odpowiedź na powtarzające się stymulacje
- zmniejszająca się wrażliwość na acetylocholinę
- przeciwciała anty-AChR, dopełniacz C3, MAC, IgG w
NMJ
- utrata AChR w płytce nerwowo-mięśniowej
- choroba immunologiczna związana z komórkami T i B

• Różnice:

- mięśnie gałki ocznej nie zmienione chorobowo, brak
podwójnego widzenia, brak opadania powiek
- brak zmian chorobowych w obrębie grasicy
- choroba monofazowa
- nie jest chorobą spontaniczną
- węzły chłonne, a nie grasica, są miejscem
autouczulania