WPROWADZENIE
DO INŻYNIERII
BIAŁEK

dr Paweł Wysocki

Podczas ostatniej dekady, określono sekwencję genomów różnych

organizmów. Ogrom informacji zakodowanej w genomach
dramatycznie zmienił naukę.

Jeśli możesz zidentyfikować gen w strukturze genomowego DNA,

możesz poznać sekwencję aminokwasów białka oraz sekwencje
regulatorowe kontrolujące ekspresję genu. Nie znasz jednak
strukturalnej organizacji białka oraz jakiej podlega regulacji.

Jeżeli nie ma genomowej bazy danych albo nie możesz

zidentyfikować regionu kodującego w genomie, musisz oczyścić
białko aby można było wyizolować gen.

Jeśli nie udało się wyizolować genu kodującego

białko, możesz być zmuszony do izolacji białka
z jednego z poniższych powodów:

- oczyszczone białko może zostać wykorzystane

do określenia sekwencji aminokwasowej.
Sekwencja może posłużyć jako próba
pomagająca w izolacji genu.

- oczyszczone białko może posłużyć do

wytworzenia przeciwciał mogących pomóc w
izolacji genu kodującego białko.

- oczyszczone białko może być poddane analizie

metodą spektrometrii masowej.

Jeśli wyizolowałeś gen kodujący białko, możesz

izolować

białko z jednego z następujących powodów:

-

czyste białko jest niezbędne do analiz

strukturalnych

- czyste białko jest niezbędne do badania funkcji
enzymów.

- oczyszczone białka są konieczne do badania

interakcji

z innymi białkami lub kwasami nukleinowymi

- oczyszczone białka są potrzebne do badań

regulacji

aktywności enzymatycznej (czy posiadają

podjednostki

regulacyjne, czy są regulowane na drodze

modyfikacji

potranslacyjnych, czy podlegają regulacji na

skutek

interakcji z innymi białkami).

Genom i transkryptom nie są wystarczające do

konstruowania modeli układów biologicznych i

przewidywania ich funkcjonowania.

Aktywność biologiczna białek jest bardzo często

regulowana

na

etapie

modyfikacji

potranslacyjnych

(np.

po

proteolizie

ograniczonej czy fosforylacji).

Zawartość białek w komórce nie zawsze

pozostaje

w

bezpośrednim

związku

z

szybkością transkrypcji mRNA. Bardzo istotna

funkcję

regulacyjną

odgrywają

procesy

translacji i degradacji białek.

Dlaczego badać białka ?

Genom człowieka:

• ~3.2 x 10

9

bp (trzydzieści razy większy od genomu

D.melongaster)
• sekwencje kodujące stanowią tylko 5% genomu
• sekwencje powtórzone ponad 50%
• „Tylko” ~32.000 genów
• eksony są relatywnie małe w porównaniu do innych
genomów eukariotycznych
• introny są relatywnie długie
• średnia długość genu ~ 8,000 bp
• średnio 5-6 eksonów/gen
• średnia długość eksonu ~200 bp
• średnia długość intronu ~2,000 bp
• ~8% genów zawiera jeden ekson
• niektóre eksony mogą być złożone z 1 do 3 bp

PROTEOMIKA

If the genome is a list of the instruments in an
orchestra, the proteome is the orchestra playing
a symphony.
R.Simpson

Taki sam GENOM

Inny PROTEOM

Zdarzenia mające miejsce ponad genomem

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

Papers
Reviews

Publikacje dotyczące proteomiki według Medline

Od

220

publikacji w minionym wieku (‘94-’99)

do

21,350

(!!!) publikacji w pierwszych latach tego wieku

(‘00-’05)

• około 1x10

14

komórek

• 250 typów komórek

• szacowana ilość białek 25 000 - 30 000 (120

000)

• 8 000 - 10 000 różnych białek w komórce

• od kilku do kilku milionów kopii danego białka

w komórce (większość białek w komórce to
białka konstytutywne występujące w ponad 10
000 kopii)

• kilkadziesiąt-kilkaset białek specyficznych dla

danego typu komórki lub tkanki

• brak liniowej zależności pomiędzy ilością

mRNA a proteomem

Organizacja proteomu człowieka

DNA

RNA

mRNA

Białko

Transkrypcja

Kontrola
transkrypcji

Dojrzewanie

Splicing
Redagowanie
Alternatywna
poliadenylacja

Translacja

Kontrola

translacji

oraz

degradacji

>200

potranslacyjnyc

h modyfikacji

•aktywność

katalityczna

•oddziaływani

e

•stabilność

•czas życia

•lokalizacja

•aktywność

Genomika

Transkryptomika Proteomika Metabolomika

Zależność pomiędzy genomem oraz proteomem

Dynamika proteomu

Całkowita ilość białek w organizmie 14kg

Dzienny obrót białek 350g

Połowiczne czasy degradacji

Dekarboksylaza ornitynowa

11 min

Oksygenaza tryptofanowa

2 h

Glukokinaza

12 h

Transaminaza alaninowa

1 dzień

Albumina surowicza

3,5 dnia

Dehydrogenaza mleczanowa

16 dni

Mapa połączeń pomiędzy funkcjonalnymi grupami białek

Sygnalizacja komórkowa z udziałem

czynnika wzrostu naskórka (EGF)

Średnia ilość oddziaływań pomiędzy białkami

Człowiek 7 – 10

x 30 000 białek  210 000 - 300 000

Drożdże 5

x 6 000 białek  30 000

Baza danych białek ludzkich HPRD

Ilość oddziaływań

P

ro

ce

n

t

b

ia

łe

k

w

H

P

R

D

Proteomika 886,000 hits
(2004)

4,700,000 hits

(2005)

Genomika 2,070,000 hits
(2004)
16,000,000 hits
(2005)

Proteomika – Google



Olbrzymi zakres ilości

Olbrzymi zakres ilości

analizowanych molekuł

analizowanych molekuł

(

(

od

od

1

1

do

do

10

10

8

8

)

)



Szeroki zakres mas

Szeroki zakres mas

cząsteczkowych

cząsteczkowych

(

(

od

od

750 kDa

750 kDa

do

do

350 Da)

350 Da)



zakres

zakres

pI (3

pI (3

do

do

12)

12)



zakres hydrofobowości



Duże zróżnicowanie stabilności

białek

Proteomika: wyzwania

Proteomika: wyzwania



Kompletny zestaw białek, których

biosynteza i modyfikacje mają miejsce w

określonym momencie funkcjonowania

komórki, narządu lub organizmu.



Białka są „fizycznym” wyrażeniem

interakcji między genomem i środowiskiem.

PROTEOM

Gen A

Gen B

mRNA A

mRNA B

Białko A

Białko B

Białk
a

interakcje

lokalizacja

obieg białek

modyfikacje potranslacyjne

FUNKCJE

SCHEMAT ZALEŻNOŚCI MIĘDZY GENOMEM,

SCHEMAT ZALEŻNOŚCI MIĘDZY GENOMEM,

TRANSKRYPTOMEM I PROTEOMEM

TRANSKRYPTOMEM I PROTEOMEM

GENOM

TRANSKRYPTOM

PROTEOM

GŁÓWNE ZASTOSOWANIA PROTEOMIKI

IDENTYFIKACJA BIAŁEK PROTEOMU
(wykorzystanie metod pozwalających na
identyfikację białek na dużą skalę)

PROTEOMIKA PORÓWNAWCZA LUB
JAKOŚCIOWA

PROTEOMIKA FUNKCJONALNA (opisywanie
interakcji między cząsteczkami białek)

CZYM JESZCZE ZAJMUJE SIĘ
PROTEOMIKA?

-pomiarami ekspresji białek w komórkach – expression
proteomics

- badaniem składu białkowego organelli komórkowych
– cell
map proteomics
- analizą modyfikacji potranslacyjnych
- analizą interakcji białko-białko
- analizą interakcji białko-lek
- określaniem struktury białek (NMR, X-ray, in silico
etc.)

Badania te w konsekwencji prowadzić mają do
określenia funkcji białka

STRUKTURA BIAŁEK

DNA/RNA

Białka

Cząsteczki stabilne

Przechowywanie i procedury

postępowania tanie i proste
Minimalne modyfikacje cząsteczek
Dobrze opanowane procedury

izolacji

Cząsteczki labilne, podatne

na denaturację
Przechowywanie i procedury

zależne od konkretnego białka
Liczne modyfikacje cząsteczki
Interakcje międzycząsteczkowe
zależne od lokalizacji

Dobrze opanowane

sekwencjonowanie

Problemy z

sekwencjonowaniem

Testy DNA / genotypowanie/

ekspresja/

Protein Chip (nie

opanowane)
Antibodies array (nie
opanowane)

Funkcje białek są zależne od

kontekstu, w jakim są rozpatrywane

Określono całkowitą sekwencję białka.
Nadal nie wiemy nic o:

Cechach struktury ????????

Lokalizacji ????????

Interakcjach z małymi cząsteczkami ?????????

Interakcjach z innymi białkami ?????????

Typach/dynamice modyfikacji ?????????

Czasie funkcjonowania cząsteczki ?????????

Schemat żelu

elektroforetycznego

ilustrujący procedurę

izolacji białka

Procedura

Objętość
frakcji
(ml)

Białko
całkowite
(mg)

Aktywnoś
ć
(jednostki
)

Aktywnoś
ć
właściwa
jedn/mg

Ekstrakt
komórkowy

1400

10000

100000

10

Sączenie
molekularne

90

400

80000

200

Chromatografia
jonowymienna

80

100

60,000

600

Tabela oczyszczania białka enzymatycznego

Współczynn
ik
oczyszczeni
a

Odzysk

100%

20

80%

60

60%

1

Rodzaj i kolejność etapów jest opracowywana
indywidualnie dla każdego białka. Efektywna
procedura izolacji daje wysoki odzysk (minimalną
stratę aktywności enzymatycznej) i wysoki
współczynnik oczyszczenia (duży wzrost
aktywności właściwej).

IZOLACJA BIAŁKA

Próba

Technika

separacyjna

Frakcjonowanie

OCZYSZCZANIE BIAŁKA JEST PROCEDURĄ WIELOETAPOWĄ

Czy jest aktywność?

Start od

początku

NI
E

Połączenie frakcji

TAK

Sprawdzenie czystości

Pomiar zawartości białka

Pomiar aktywności

enzymu

Czyste?

Przygotowanie do technik analitycznych

Tak

Nie

Przeprowadzaj

rozdziały

innymi

technikami

separacyjnymi

do uzyskania

czystości

preparatu

Pierwsze etapy



1. Źródło materiału. Dobre źródło materiału jest tanie i łatwo dostępne. Wiele
białek występuje w zwiększonych ilościach w specyficznych tkankach np.
hemoglobina we krwi. Z tego powodu, tkanki te mogą być doskonałym źródłem
naszego białka



2. Pomiar zawartości: Większość pomiarów wykorzystuje reakcje chemiczne
katalizowane przez określone enzymy. Białka nie wykazujące aktywności
enzymatycznej mierzy się najczęściej z wykorzystaniem elektroforezy SDS-
PAGE.

33

Przygotowanie próby

Główne wskazania:



Wybierz procedurę ekstrakcji kierując się
źródłem i lokalizacją białka



Używaj, w miarę możliwości łagodnych
procedur aby minimalizować ryzyko zmiany pH
i uwolnienia enzymów proteolitycznych



Pracuj szybko w obniżonej temperaturze



Używaj buforów aby zachować wartość pH i
siły jonowej

CEL: stabilizacja białka

34

Czystość

Etap

Wstępna

Faza(y) pośrednia

Końcowa

Izolacja,

koncentracja, stabilizacja

Usunięcie głównych

zanieczyszczeń

Osiągnięcie końcowej
czystości, usunięcie
zanieczyszczeń
śladowych, wariantów
strukturalnych
białka,agregatów,
wirusów itd.

Trzy fazy oczyszczania białek:

35

Zawsze ograniczaj ilość etapów izolacji

Utrzymuj wysoki odzysk na każdym z
etapów

Ilość etapów izolacji

Odzysk (%)

95% / step

90% / step

85% / step

80% / step

75% / step

0

20

40

60

80

100

1

2

3

4

5

6

7

8

Dodatnio naładowane domeny zasadowe

Ujemnie naładowane domeny kwaśne

Region hydrofobowy

Miejsce wiążące ligand

ok. 40 Å

Rozmiar cząsteczki:

Białka są cząsteczkami amfipatycznymi

Obecność ładunków, regionów hydrofobowych, wielkość oraz rozpuszczalność wpływają

na właściwości biofizyczne białka i determinują strategię oczyszczania

37

Chromatografia

Przepływ cieczy

Przepływ

cieczy

Czas

1

2

3

4

5

Rozdział ze względu na:
-masę cząsteczkową
-ładunek
-hydrofobowość
-powinowactwo

Próba zawierająca
białka lub peptydy



Schemat kolumny
chromatograficznej z mieszaniną
białek naniesioną na powierzchni



Ekstrakt jest nanoszony na
powierzchnię żelu w kolumnie
(w tym przypadku jest to
mieszanina 4 różnokolorowych
białek)



Białka przesuwają się w dół
kolumny z różnymi
prędkościami w zależności od
właściwości białka i złoża
chromatograficznego.



Frakcjonowanie

Podczas separacji na kolumnie

bufor wypływający z kolumny
jest zbierany do kolejnych
probówek , które przesuwane
są z odpowiednią prędkością.
Zawartość probówek
nazywana jest frakcjami
chromatograficznymi.



W rzeczywistości, białka
nie są kolorowe a więc
musimy znaleźć
odpowiedź na 3 pytania:

1.

Skąd mamy wiedzieć
która z frakcji zawiera
białka?

2.

Która z frakcji
białkowych zawiera to
białko, które chcemy
izolować?

3.

Jak zmierzyć czystość
frakcji?

???



Całkowita zawartość białka może
zostać oszacowana po pomiarze
absorbancji roztworu przy 280 nm
z użyciem spektrofotometru.
Może to być wykonane podczas
trwania rozdziału
chromatograficznego.

Pytanie 1. Skąd mamy wiedzieć która z frakcji zawiera białka

?

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20



Na podstawie uzyskanych
wartości sporządza się
tzw. Profil elucyjny

A

280

0 0 0 2 5 2 0 0 0 2 5 8 5 2 0 0 2 5 2 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Fraction
#

A

280

0 0 0 2 5 2 0 0 0 2 5 8 5 2 0 0 2 5 2 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Fraction
#

A

280

Kolejne frakcje

„Piki białkowe”



Aktywność enzymu może
zostać określona przez
przeprowadzenie oznaczania
aktywności enzymu w każdej
z frakcji zawierających białko.

Pytanie 2. Która frakcja zawiera interesujące nas białko?

A

280

0 0 0 2 5 2 0 0 0 2 5 8 5 2 0 0 2 5 2 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Fraction
#

A

280

Fraction #

Fraction
#

A

280

0 0 0 2 5 2 0 0 0 2 5 8 5 2 0 0 2 5 2 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Fraction
#

A

280

Fraction #

EnzAssa
y
Results

A

280

0 0 0 2 5 2 0 0 0 2 5 8 5 2 0 0 2 5 2 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Fraction
#

A

280

Fraction #

EnzAssa
y
Results

Zbierz frakcje z zawartością białka i aktywnością enzymatyczną

1.

Frakcje zostają zebrane.

Popatrz na żel. Nawet jeżeli naniesione jest zbyt
dużo materiału, jeżeli widoczna jest jedna
frakcja, prawdopodobnie białko jest czyste, i jest
monomerem, homo-dimerem lub homo-
multimerem. Jeżeli to nie jest jeden prążek,
dochodzi prawdopodobnie do równoczesnej
izolacji innego białka. Jest taka możliwość, że to
podjednostka izolowanego białka.
Oblicz aktywność właściwą przez
przeprowadzenie dokładnego jakościowego
pomiaru aktywności enzymu i ilości białka.

Czy zebrana próba jest czysta? Jak obserwować postęp izolacji?

Standardy | Ekstrakt | zebrane frakcje

Procedur

e

Obj.

frakcji
(ml)

Zawartoś

ć białka
(mg)

Aktywnoś

ć
(U)

Aktywno

ść

właściwa
Units/mg

Ekstrakt

wyjściowy

1400

10000

100000

10

Etap 1

90

400

80000

200

Tabela oczyszczania

Wyniki:
1.

Na żelu widoczna więcej niż jedna frakcja.

Ponieważ próba nie jest czysta potrzeba dodatkowej techniki separacyjnej

Czy próba jest czysta? Jak oceniasz postęp izolacji?

Standard | Ekstrakt | Zebrane frakcje

Procedura

Objętość

próby
(ml)

Całkowit

a

zawartoś

ć białka
(mg)

Aktywnoś

ć
(units)

Aktywno

ść

właściwa
Units/mg

Ekstrakt
komórkowy

1400

10000

100000

10

Metoda
separacyjna 1

90

400

80000

200

Metoda

separacyjna
2

8

4

60000

15000

Tabela oczyszczania

Wyniki:
1.

Na żelu widoczna 1 frakcja

2.

Aktywność właściwa wynosi 15 000

Kryteria czystości
preparatu białkowego:

Jednorodności

– obserwujemy

jedną frakcję po elektroforezie
PAGE i SDS – PAGE. Im bardziej
czułą metodę barwienia
zastosujemy, tym większą mamy
pewność, że białko jest czyste.
Inne wyniki można uzyskać po
rozdziale białek enzymatycznych
zbudowanych z heterogennych
podjednostek np.

PAGE

SDS-PAGE



Molekularne – podczas
analizy sekwencji N-
końcowej wykazywana jest
obecność jednego rodzaju
aminokwasu. Podczas analiz
stwierdza się jeden rodzaj
aminokwasu N-końcowego i
C-końcowego.



Katalityczne (enzymy) – nie
wykazywana jest żadna inna
aktywność enzymatyczna



Immunologiczna – po
immunizacji uzyskuje się
jednorodną frakcję
przeciwciał, dających jedną
linię precypitacyjną w
testach immunodyfuzji.

Rozbicie komórek:



Jest konieczne z wyjątkiem przypadków, gdy źródłem
białka jest płyn fizjologiczny (surowica krwi, mocz,
płyn mózgowo-rdzeniowy, pożywka hodowlana itd..)



Jeżeli białko występuje w jakimś oraganellum
komórkowym (mitochondrium, błonach, jądrze itd.)
najlepiej najpierw izolować określoną część komórki,
potem dopiero poddawać ją rozbiciu.



Najczęściej stosowane metody rozbijania komórek:

-

Szok osmotyczny – komórki umieszcza się w
środowisku hipo- lub hipertonicznym, co powoduje
uszkodzenie błon komórkowych (np. liza erytrocytów)

-

Zamrażanie-rozmrażanie – tworzące się kryształy lodu
powodują uszkodzenia błon komórkowych

-

Rozbijanie mechaniczne z zastosowaniem różnego
typu homogenizatorów mechanicznych, młynków,
mikserów itp.

-

Rozcieranie tkanek w ciekłym azocie.

-

Rozbicie ścian i (lub) błon komórkowych odpowiednimi
enzymami (np. lizozym podczas rozbicia komórek
bakterii).

-

Traktowanie tkanek odczynnikami silnie denaturującymi
białka (8M mocznik, 6 M chlorowodorek guanidyny, SDS,
NaOH itd.) Możliwe tylko wtedy, gdy interesujące nas
białko nie podlega denaturacji. Jest to tzw. denaturacja
wybiórcza.

Podczas rozbicia komórek dochodzi do uwolnienia

proteinaz z lizosomów, które mogą hydrolizować białka.
Hydrolizie enzymatycznej można zapobiec przez:

-

Pracę w obniżonej temperaturze np. w chłodni lub z
wykorzystaniem lodu

-

Dodatek inhibitorów proteinaz serynowych (PMSF,
benzamidyna, inne), metaloproteinaz (EDTA)



Pierwsze etapy



1. Źródło materiału. Dobre źródło materiału jest tanie i łatwo dostępne. Wiele
białek występuje w zwiększonych ilościach w specyficznych tkankach np.
hemoglobina we krwi. Z tego powodu, tkanki te mogą być doskonałym
źródłem naszego białka.



2. Pomiar zawartości: Większość pomiarów wykorzystuje reakcje chemiczne
katalizowane przez określone enzymy. Białka nie wykazujące aktywności
enzymatycznej mierzy się najczęściej z wykorzystaniem elektroforezy SDS-
PAGE.

DETERGENTY:



Niejonowe: Tween 80, Triton X-100, Lubrol, Triton X-114



Jonowe :SDS, deoxycholan sodu, CTAB



Obojętne dwujonowe (zwitterionic): CHAPS, CHAPSO, lizolecytyna

Używane są podczas izolacji białek błonowych, gdyż powodują dyspersję

lipidów i fosfolipidów. Każdy detergent ma określoną koncentrację
(CMC; critical micelle concentration), powyżej której cząsteczki tworzą
struktury zwane micellami. Są one trudne do usunięcia podczas
dalszych etapów izolacji.

Niskie stężenia detergentów mogą skutecznie chronić białka podczas

przechowywania.



Pierwsze etapy – opracowanie metody pomiaru



Pomiar enzymu jest metodą określającą jego
aktywność enzymatyczną .



Ponieważ pomiary będą przeprowadzane
wielokrotnie istotne jest, aby procedura była
prosta. Aktywność enzymatyczna jest mierzona
zwykle na podstawie zmian absorbancji
mierzonych przy pomocy spektrofotometru. Na
przykład pomiar aktywności rybonukleazy mierzy
zmianę absorbancji roztworu RNA spowodowaną
jego hydrolizą do rybonukleozydów.

Po co izolować enzymy?

􀂄

Aby zrozumieć i opisać strukturę enzymu, kinetykę

aktywności, mechanizm działania, regulację
aktywności i jego udział w funkcjonowaniu złożonych
systemów biologicznych niezbędne jest badanie
enzymów w prostym, ściśle zdefiniowanym systemie,
złożonym wyłącznie z małych jonów, soli
buforujących, kofaktorów.

􀂄Izolacja czystych enzymów jest szczególnie istotna
w przypadku ich wykorzystania do celów
przemysłowych i medycznych.

Objectives of enzyme
purification

Objectives : maximum possible
yield + maximum catalytic activity
+ maximum possible purity
􀂄

Metody homogenizacji

􀂄

Metody mechaniczne

Homogenizatory wysokociśnieniowe* (55 MPa) :

istotne jest chłodzenie układu

Rozcieranie „na mokro” z wykorzystaniem

różnorodnych młynków lub szklanych kulek

􀂄

Inne metody

􀂄 Suszenie (odwadnianie) komórek
􀂄 Liza z wykorzystaniem szoku osmotycznego,

detergentów lub enzymów

􀂄 Ultradzwięki* (istotne chłodzenie próby)
􀂄

Metody wstępnej separacji
enzymów

3. Solubility
􀂄 Change in pH
􀂄 Enzymes are least soluble at pI because there is no
repulsive force between enzymes
􀂄 Enzyme must not be inactivated in a range of pH
􀂄 Change in ionic strength
􀂄 Large charged molecules are only slightly soluble
in pure water; Addition of ion promotes solubility
(Salting in)
􀂄 Beyond a certain ionic strength, the charged
molecules
are quickly precipitated (Salting out)
􀂄 Ammonium sulfate is popularly used 10-fold
increase in purity
􀂄 Fructose-bisphosphate aldolase from rabbit muscle
can
be purified in high purity by ammonium sulfate

2.6 Methods of separation
3. Solubility
􀂄 Decrease in dielectric constant
􀂄 Addition of water-miscible organic solvent
(ethanol or
acetone)
􀂄 Decrease dielectric constant
􀂄 Sometimes deactivate the enzyme
􀂄 Work at low temperature
􀂄 PEG (poly ethylene glycol) ~ Mr 4000 to 6000 is
commonly used

2.6 Methods of separation
5. Choice of method
􀂄 Time/Large scale -> Precipitation by ethanol or
ammonium sulfate or purification based on
solubility
􀂄 Small scale/high purity -> Column
chromatography or electrophoresis
􀂄 FPLC or HPLC -> Fast and high purity,
expensive

2.7 How to know the success of purification
􀂄 Tests for catalytic activity
- By enzyme assay
- Check cofactors and inhibitors
􀂄 Stabilizing factors
- Neutral pH, storage in 50% glycerol may help
- 2-mercaptoethanol or DTT(Dithiothreitol)*
- Protease inhibitor PMSF (Phenylmethylsulfonyl
flouride)
􀂄 Active site titrations
􀂄 Checking the proportion of active enzyme in
the purified enzyme