Wykład 1:

Proces biotechnologiczny:

1. Wybór mikroorganizmu:

- najważniejszy etap

- obejmuje odkrycie i wyselekcjonowanie mikroorganizmów o cechach pożądanych w danym procesie

1. Przygotowanie pożywki

- wymagania stawiane podłożom hodowlanym – związane zarówno z potrzebami stosowanego mikroorganizmu jak i rygorami ekonomiki procesu produkcyjnego

1. Hodowla

- związana z wytworzeniem pożądanego metabolitu lub biomasy

1. Wydzielenie produktu

- wydzielenie i oczyszczenie produktów przemian biochemicznych

Sukces – zgranie wszystkich tych elementów

Cel procesu biotechnologicznego:

• Wytwarzanie biomasy mikroorganizmów:

- produkcja drożdży piekarniczych, paszowych

- produkcja kultur startowych dla przetwórstwa mleka

- wytworzenie szczepionek przeciw chorobom zakaźnym

• Wytwarzanie produktów metabolizmu

- rozliczne (??) techniki produkcji metabolitów

• Zużywanie substratu

- utylizacja substratu, a wytworzenie biomasy i innych produktów metabolizmu stanowi efekt uboczny (technologie ochrony środowiska, wykorzystanie mikroorganizmów w technologiach (…)? Hydrobiometalurgia tez tego nie ma :P

Produkty gospodarczo użyteczne:

• Aminokwasy

• Enzymy

• Farmaceutyki

• Kwasy organiczne

• Przetworzona żywność

• Rozpuszczalniki organiczne

Produkty metabolizmu:

Pierwotne (związki potrzebne do wzrostu komórki):

• Aminokwasy

• Nukleotydy

• Produkty końcowe fermentacji

• Enzymy

Wtórne:

• Związki syntetyzowane podczas idiofazy

• Nie maja bezpośredniego związku z synteza składników strukturalnych komórki lub warunkujących jej prawidłowy wzrost (???) nie mam tutaj jeszcze nie pislaysmy razme :P

- antybiotyki

- mikotoksyny

Aminokwasy:

• Budowa

Aminokwasy:

• Syntetyczne

• Naturalne: niebiałkowe (D,L) i białkowe (L)

• Synteza aminokwasów

Właściwości aminokwasów:

1. Właściwości fizyczne:

• Rozpuszczalne (większość w wodzie oraz wodnych i alkoholowych roztworach kwasów organicznych, amoniaku (?)) ja tego w ogóle ni mam :/

• Rola grup funkcyjnych

• Absorpcja światła (nie absorbują światła widzialnego)

1. Właściwości fizjologiczne:

• Zapach i smak

• Toksyczność

Leucyna pelagra (rumień lombardzki)

Typtofan – niacyna – witamina BB

L – fenyloalanina objawy podobne do fenyloketonurii (defekt w metabolizmie fenyloalaniny)

Cysteina, metionina nekroza wątroby i nerek

Aspartam jest to substancja intensywnie słodząca (200x słodsza od sacharozy):

• 2 aminokwasy kwasu asparaginowego oraz fenyloalaniny

• Wykorzystuje się go do produkcji deserów, słodyczy

• Spożywanie w nadmiarze jest przyczyną powstawania stanów depresyjnych

Zastosowanie aminokwasów:

• Jako substancja smakowa

• Dodatki wzbogacające wartość odżywczą pożywienia i pasz

• W farmacji

• W przemyśle kosmetycznym

• Jako substraty do syntezy peptydów

Aminokwasy jako leki

DOPA – 3,4 – dihydroksyl – L – fenyloalanina

Łagodzenie skutków Parkinsona

Tyrozyna (utlenianie)DOPA dopamina

Mieszanki aminokwasów pozbawione fenyloalaniny dla dzieci chorych na fenyloketonurię

Aminokwasy egzo i endogenne!

Otrzymywanie aminokwasów:

1. Kwasowa lub zasadowa hydroliza:

• najstarsza, najprostsza i najbardziej czasochłonna

• bazuje na wykorzystaniu „odpadów” przemysłu mięsnego (kazeiny) oraz zbożowego (gluten)

• Wady:

- niepełna hydroliza niektórych aminokwasów (czyli w mieszaninie nie ma pojedynczych aminokwasów)

- rozkład niektórych aminokwasów

- wysokie koszty oczyszczania

- ograniczenie źródeł i zmienność składu surowca

1. Synteza chemiczna:

• Akroleina D,L-metionina

• Cykloheksan D,L – lizyna

• Indol i kwas nitrooctowy D,L – tryptofan

• Wady:

- konieczność zastosowania wysokiej temperatury i wysokiego ciśnienia

- użycie toksycznych związków chemicznych

- stosowanie drogiej aparatury

- powstawanie racematów (D,L)

1. Synteza enzymatyczna:

• Wady:

- wymaga użycia kosztownych prekursorów

- drogie enzymy

• Zalety:

- większa wydajność

- większe stężenie aminokwasów

1. Biosynteza:

• Zalety:

- tanie surowce

- proces w niskiej temperaturze

- produkt – L-aminokwasy

!!!Wybór właściwego szczepu!!!

Kwas L- glutaminowy:

• Monoglutaminian sodu

• Produkcja (…) nie mam

L – lizyna:

- dodatek zwiększający wartość odżywczą mąki

- w przemyśle farmaceutycznym

L-arginina – farmacja

L – glicyna – słodzik do soków, bakteriostatyk, antyutleniacz

Otrzymywanie L-lizyny:

- 80tysięcy ton rocznie

- Corynebacterium glutamicum

Trudność: pojawienie się mutacji w trakcie na(..)

Dehydrogenaza homoserynowa jest 10x aktywniejsza

Hodowla:

• Kwasowość: 6,9-7,0

• Temperatura: 28-33ºC

• Napowietrzanie

• Czas hodowli – 48h

• Źródła węgla:

-melasa z buraka cukrowego, trzciny cukrowej

-glukoza

-alkohol etylowy

- kwas octowy

- N-paraf(...)

Izolacja i oczyszczanie:

• Zagęszczenie płynu pohodowlanego

• Zakwaszenie i adsorbcja na jonowymieniaczu

• Zagęszczenie

• Krystalizacja (?)

L – glutamina 400tysięcy ton rocznie Corynebacterium glutamicum

Temperatura: 30-35ºC, pH 7-8, czas hodowli:2-3dni, intensywne napowietrzanie

Ograniczenie ilości biotyny

Dodatek detergentów, penicyliny, cefalosporyny, kwasów tłuszczowych

Izolacja i oczyszczanie: oddzielenie biomasy, wytrącanie, otrzymanie i suszenie kryształów

Metabolizm warunki nadprodukcji aminokwasów:

Mechanizmy negatywnej kontroli metabolizmu – regulacja poprzez dostępność prekursorów:

• W warunkach nadmiaru aminokwasów hamowana jest aktywność wszystkich kluczowych enzymów (względnie tylko pierwszego enzymu) w jego odgałęzieniu (…)

Przydatność mikroorganizmów do nadprodukcji:

- grzyby –

- E.coli –

+ tzw. bakterie kwasu glutaminowego +

Eliminacja określonych odgałęzień szlaku oraz określonych mechanizmów regulacji:

• Działanie czynników fizjologicznych

• Trwałe zmiany genetyczne

Nadprodukcja:

• Wzrost przepuszczalności przez błonę plzamatyczną

• Zmiana preferencji metabolicznych

• Dodatek prekursorów

• Zmiana aktywności enzymów

• Mutanty żywieniowe – mutacje w genie kodującym enzym z jakiegoś szlaku metabolicznego, utrata zdolności do syntezy produktu tego szlaku

• Mutanty regulatorowe – mutacja zachodzi w genie regulatorowym lub genomie(?), zakłócenie szlaku metabolicznego, nadprodukcja metabolitu

Wykład 2:

Fermentacja – proces metaboliczny służący do wytworzenia ATP, zachodzi w warunkach beztlenowych

Utleniania całkowite – drobnoustroje w drodze metabolizmu oddechowego utleniają organiczne składniki odżywcze do CO2 i H2O

Utlenianie częściowe (fermentacja oksydatywną) – w wyniku fermentacji zachodzących w warunkach beztlenowych (czasami tlenowych), a produkty końcowe to m.in. kwas octowy, glukonowy, cytrynowy, glutaminowy, mlekowy, fumarowy, oksokwasy i keto kwasy (fermentacja oksydacyjna.

Nazwa fermentacji = dominujący, charakterystyczny produkt fermentacji

Kwasy organiczne: octowy, cytrynowy, mlekowy, glukonowy

Octowy:

- metoda chemiczna

- metoda enzymatyczna

- metoda mikrobiologiczna (fermentacja):

- do celów spożywczych

- ocet winny produkowany jest z odpadów

- naturalne zabarwienie żółte lub brązowe

Zastosowanie:

- przemysł spożywczy

- gospodarstwo domowe

- otrzymywanie estrów

Światowa produkcja – 4mln ton rocznie

Metoda chemiczna:

Acetylen aledehyd octowykwas nadoctowy kwas octowy (utlenianie tlenem z powietrza)

Destylacja (rektyfikacja)

Lodowaty kwas octowy (skłonny do krystalizacji po lekkim ochłodzeniu)

Ciecz, temp. Wrzenia 118ºC, temp. Topnienia 16,7ºC

Fermentacja:

C2H5OH + O2 = CH3COOH + H2O

Surowce:

• Roztwór etanolu

• Woda

• Składniki odżywcze

• Sole amonowe/fosforanowe(?)

• Acetobacter:

- słabo ruchliwe

- zdolne do życia w warunkach niskiego pH

- elipsoidalne pałeczki

- bezwzględne tlenowce

- kwas octowy wydalany do pożywki

- bakterie te wytwarzają dehydrogenazy

Produkcja octu sprowadza się do problemu technologii napowietrzania – celem procesów nie mam(…)

Schemat technologicznego otrzymywania kwasy octowego!!!

1. Metoda klasyczna (stojakowa, orelańska):

- wykorzystanie mikroorganizmów bytujących na wiórkach drzewnych

- proces prowadzony w drewnianych kadziach lub krzemionkowych zbiornikach o podwójnym dnie (dolne do odprowadzania produktu, wyższe – półka dla wiórów bukowych)

- napowietrzanie następuje dzięki konwekcji naturalnej jest to pierwsza przemysłowa wykorzystująca unieruchomionych komórek w procesie biotechnologicznym.

1. Metoda generatorowa:

- wykorzystanie aparatów o pojemności do kilkudziesięciu m3, wypełnionych wiórami

- ciecz odbierana od dołu aparatu przetłaczana jest do zbiornika cyrkulacyjnego a z niego spływa do generatora

- powietrze tłoczone jest od dołu za pomocą dmuchawy

1. Metoda wgłębna:

- wykorzystanie acetatorów (zazwyczaj pełna automatyka)

- początkowe stężenie brzeczki to 7-10% kwasu octowego i 5% etanolu, gdy stężenie etanolu spadnie do 0,3%, cześć octu jest odprowadzana z fermentatora i dodawana jest świeża brzeczka zawierająca 12-15% etanolu i nie mam(…)

Kwas cytrynowy – ciało stałe, krystaliczne, temp. Top. 153ºC, dobrze rozpuszczalny w wodzie

Otrzymywanie:

• Z owoców cytryny – zawartość 7-9%

• Metoda mikrobiologiczna (fermentacja)

Kwas cytrynowy jest pierwotnym produktem metabolizmu

Nie jest wydzielany przez mikroorganizmy w warunkach naturalnych w dużych ilościach

Wydzielanie kwasy cytrynowego w ilościach technologicznych jest wynikiem zakłócenia metabolizmu mikroorganizmu.

Producenci:

• Kropidlaki: Penicillum sp, Aspergillus sp, Trichoderma sp

• Drożdże z gatunku Candida sp

• Bakterie z rodzaju Arthrobacter sp

Media hodowlane:

• Źródło węgla i energii – cukry

• Źródło azotu – sole amonowe

• Kwasowość pożywki: pH 2,3

• Wyeliminować sole metali (Fe, Mn, Zn)

• Intensywne napowietrzanie

• Bardzo ważne – skład musi stwarzać odpowiednie warunki dla wzrostu drobnoustrojów o niezrównoważonym metabolizmie

Hodowla w podłożu stałym:

Nadal popularna w krajach dalekiego wschodu i powszechnie stosowana do otrzymywania preparatów enzymatycznych i specyficznych przypraw

Szczepienie stężoną pożywką składającą się z odpadów przemysłu ziemniaczanego i zbożowego. Wilgotność podłoża 65-70%, a temperatura inkubacji ok.50ºC. hodowla ok.90h. hodowla w fermentatorach tarczowych umieszczonych w napowietrzanych komorach. Wydzielenie kwasu z przerośniętego podłoża przez ekstrakcję wodną.

Hodowla powierzchniowa:

Hodowle grzybów mikroskopowych na powierzchni ciekłej pożywki umieszczonej na tacach w komorach wyposażonych w system cyrkulacji powietrza. Grzybnia tworzy charakterystyczny „kożuch”. Hodowla 6-8dni.

Hodowla wgłębna:

Wykorzystanie tradycyjnych nie mam(...)

Płyn pohodowlany

Filtracja przemywanie i wyciskanie grzybni

Ca(OH)2 pecypitacja szczawianu .

Filtracja osad

Ca(OH)2 wytrącanie cytrynianu .

Filtracja przesącz

H2So4 rozpuszczanie .

Filtracja osad

Sorpcja na węglu aktywnym

Jonity

Krystalizacja (20-25ºC) kwas cytrynowy

Zastosowanie:

• Dodatek do wyrobów spożywczych i cukierniczych (E330, 20% produkcji)

• Dodatek do napoi (45%) produkcji)

• Środek konserwujący (dzięki zdolności kompleksowania metali ciężkich wykorzystywany jest w ochronie olejów jadalnych)

• Stabilizator emulsji

• W przemyśle farmaceutycznym

• Produkcja detergentów

• Przemysł tworzyw sztucznych

• Analiza laboratoryjna

Kwas mlekowy:

Właściwości: ciecz, temp.wrzenia 119, enancjomery L(+) i D(-), fermentacja 70%, chemicznie 30%, roczna produkcja 50tys. Ton.

Mikroorganizmy: szczepy z rodzaju Enterococcus, Lactobacillus, Streptococcus oraz Rh (…)

Hodowla:

• Warunki beztlenowe

• Wysoka temp 45-50

• Dodatek składników buforujących

• Pożywka syntetyczna lub naturalna (zhydrolizowana skrobia, serwatka, skiełkowane zboża)

• Wydajność procesu 90%

W organizmie utylizowany jest jedynie L(+)

Zwykle określony szczep wytwarza jeden z enancjomerów kwasu mlekowego

Produkcja:

• Proces fermentacji w warunkach beztlenowych, 45-50ºC

• Wydzielany kwas mlekowy działa hamująco na wzrost bakterii kwasu mlekowego (środki buforujące)

• Hodowla na pożywkach syntetycznych (sacharoza) lub naturalnych (skiełkowane ziarniaki)

• W większości technologii kwas mlekowy otrzymywany jest w postaci soli wapniowej (podczas hodowli dodaje się do fermentatorów zmieloną kredę – węglan wapnia)

• Filtracja biomasy (podgrzewanie aby zwiększyć rozpuszczalność mleczanu wapnia)

• Wydzielanie kwasu mlekowego w wyniku działania kwasem siarkowym, a wytracony gips oddziela się przez filtrację

• Dalsze oczyszczanie zależna jest od przeznaczenia. Sorpcja na węglu aktywnym, ekstrakcja, elektroliza, oczyszczanie na kolumnach jonowymiennych

• Produkcja handlowa zawiera 50-60% kwasu mlekowego

Zastosowanie:

• Przemysł spożywczy jako środek zakwaszający i konserwujący (zwłaszcza w produkcji konserw owocowych i rybnych)

• Do produkcji napojów, esencji, ekstraktów, soków owocowych

• Farmacja – wykorzystuje się mleczan wapnia i żelaza

• Przemysł skórzany (do namaczania i odwapniania skór)

Konserwowanie w wyniku fermentacji mlekowej:

Kapusta i ogórki kiszone, kiszonki

Następujące po sobie mikroorganizmy:

• Leuconostoc mesenteroides

• Lactobacillus brevis

• Pedicoccus cerevisiae

• Lactocacillus plantarum

Kwas glukonowy

Odzyskiwany z hodowli grzybów strzępkowych A. Niger oraz bakterii Gluconobacter oxydans

Ciało stałe, krystaliczne, temp.top. 130, dobrze rozpuszczalny w wodzie

Fermentacja 24h, intensywne napowietrzanie, temperatura hodowli 30ºC

Zastosowanie:

• Alkaliczny składnik preparatów do czyszczenia szkła (jako glukonian sodu)

• W przemyśle tekstylny (odczynnik maskujący jony wapniowe i żelazowe)

• Składnik preparatów do usuwania rdzy

• W przemyśle mleczarskim

Celuloza bakteryjna

Bakterie ją produkujące:

• Agrobacter

• Acetobacter

• Achromobacter

• Agrobacterium

• Azotobacter

• Pseudomonas

• Rhizobium

• Sarcina

Jednak tylko bakterie fermentacji octowej – Acetobacter produkują jej wystarczające ilości aby wykorzystać ją przemysłwo

Spośród nich szczep Gluconacetobacter xylinus ma największe znaczenie.

Jaką rolę pełni w bakterii?

• Nie ma jednoznacznej odpowiedzi

• Ochrona przed UV

• Utrzymanie bakterii blisko źródła pożywienia

• Utrzymanie bakterii blisko tlenu

• Możliwość interakcji z organizmem symbiotycznym

Produkcja:

Pożywka z glukozą, temp 23-26, przez 6-25dni

Oczyszczanie „kożucha” - 90ºC przez 2h, 1% NaOH przez 2-4dni, neutralizacja w octanie sodu pH 4,5. Przechowywać w 20% etanolu.

Bawełna:

• Włókna zbudowane z makrofibrylli o szerokości 30-36nm

• Niska zawartość wody

• Struktura krystaliczna

• DP 8000-10000

• Trzeba podczyścić i po tym procesie ma krótsze makrofibrylle niż te bakteryjne

Gluconoacetobacter:

• „kożuch” o grubości 1cm

• Makrofibrylla jest skręcona, o szerokości 40-60nm

• Wygląd żelu

• DP 1000-4000

• Po wysuszeniu tworzy bardzo cienką membranę

Bakterie te wyposażone są w enzym – syntazę celulozową.

W zależności od zastosowanej metody hodowli bakteryjnej produkcji celulozy może być w formie:

• Płata o dowolnej powierzchni

• Rurek o zróżnicowanej średnicy

• Kulek

• Pulp

Dlaczego może być wykorzystywana przemysłowo:

• Odpowiednia struktura

• Brak dodatków, tj. hemicelulozy i ligniny

• Dłuższe, silniejsze włókna

• Może być otrzymywana w dowolnym rozmiarze i kształcie

• Może być produkowana z różnych substratów, a sam proces nie jest wysoce skomplikowany

A dlaczego nie jest:

• Utrudnione warunki hodowli na wysoką skalę – hodowla powierzchniowa

• Wysoka cena (100x droższa od celulozy roślinnej)

W odróżnieniu od celulozy otrzymanej z drewna, celuloza bakteryjna jest: tutaj mam, że może być produkowana z różnych substancji a sam proces produkcji nie jest wysoce skomplikowany, dowolny rozmiar i kształt. :P

• Hypoalergiczna

• Nietoksyczna

• Niedrażniąca

• Niepirogeniczna

• Biodegradowalna

• Wysoce hydrofilna

• Biokompatybilna

Wykorzystanie:

• Opatrunki hydrożelowe

• Membrany akustyczne

• Protezy naczyń krwionośnych

• Czesiowo bioresorbowalne siatki chirurgiczne do beznapięciowego zaopatrywania przepuklin

• Do unieruchamiania komórek

Może znaleźć zastosowanie w wielu technikach:

• Produkcji materiałów filtracyjnych – membran

• Produkcja papierów trwałych, pergaminowych

• W przemyśle spożywczym może służyć jako błonnik pokarmowy, w produkcji żywności dietetycznej

• W przemyśle kosmetycznym

• W medycynie

W pracach eksperymentalnych: właściwości adhezyjne celulozy bakteryjnej umożliwiają wykorzystanie jej jako nośnika nie mam (…)

Jako substytut skóry powinien być:

• Przyczepny do rany

• Przepuszczalny dla pary wodnej

• Elastyczny

• Trwały

• Nieprzepuszczany dla mikroorganizmów

• Biozgodny

• Hemostatyczny

• Łatwy w nakładaniu na ranę i usuwaniu

• Tani

• Można nasączyć antybiotykiem, środkiem przeciwbólowym

Wykład 3:

Enzymy

Intensywnie rozwijający się przemysł wciąż nowych technologii, które powinny:

• Obniżyć koszty produkcji

• Zwiększyć asortyment

• Gwarantować produkt wysokiej jakości

• Rozwiązać dotychczasowe problemy technologiczne

• Zagwarantować niskie nakłady inwestycyjne i łatwość manipulacji procesu

Największe znaczenie praktyczne mają technologie, w których zastosowano enzymy:

• Procesy te mogą być kontrolowane i przerywane na określony, pożądanym etapie

• Zastosowanie preparatów enzymatycznych w różnych technologiach:

- pełniejsze wykorzystanie surowców

- podjęcie produkcji nowych półproduktów i produktów

- przyspieszenie procesów produkcyjnych

-przedłużenie trwałości produktów

-poprawę cech organoleptycznych produktów

-wykorzystanie produktów ubocznych przemysłu (do drugiego myślnika :P nie wiem o co chodzi xD)

• Wzrastające zapotrzebowane na standardowe preparaty enzymatyczne, których produkcja i zastosowanie będzie ekonomicznie uzasadnione, stwarza konieczność poszukania nowych i tanich ich źródeł

Podstawowe cechy decydujące o celowym wykorzystaniu enzymów:

• Naturalne pochodzenie

• Nietoksyczność

• Neutralność wobec własnych organoleptycznych produktów

• Wyjątkowo wysoka aktywność katalityczna, pozwalająca na używanie bardzo niewielkich ilości enzymów względem substratów

Wykorzystanie preparatów enzymatycznych:

• 60% technologia żywności ( 60% proteazy, 30% (?), 5%(?)

• 30% detergenty

• 5% przemysł tekstylny i skórzany

• 5% inne

Poznano 2 tysiące enzymów. Ponad 100 znalazło zastosowanie w technologii

Biotechnologiczny podział enzymów:

1. Ze względu na wytwarzane ilości:

- enzymy produkowane w dużych ilościach

- enzymy specjalne

1. Ze względu na wykorzystywany substrat:

- enzymy amylolityczne

- e. proteolityczne

- e. celulolityczne

- e. pektynolityczne

- e. lipolityczne

- e. różne

1. Ze względu na wykorzystanie w dziale przemysłu:

- enzymy wykorzystywane w biotechnologii żywności

-enzymy wykorzystywane w analityce

- -||- w medycynie

- -||- w bioremediacji

Podział biochemiczny:

- oksydoreduktazy

- transferazy

- hydrolazy

- liazy

- izomerazy

- ligazy

Przemysłowy podział:

1. Enzymy „czyste” (wyizolowane i oczyszczone)

• Występują one zwykle w postaci krystalicznej

• Są głównie przeznaczone do zastosowania w medycynie lub badaniach naukowych

• Nie są one tak ważne w międzynarodowym obrocie towarowym jak koncentraty enzymatyczne i enzymy gotowe

• Występują one zwykle w postaci krystalicznej

1. Koncentraty enzymatyczne:

• Otrzymuje się je zwykle z roztworów wodnych albo ekstraktów rozpuszczalnikowych z organów zwierzęcych, roślin, mikroorganizmów lub hodowli bulionowych (te ostatnie otrzymywane są z bakterii, pleśni itp.)

• Preparaty te, które mogą zawierać kilka enzymów w różnych proporcjach można mianować albo stabilizować

• W koncentratach enzymatycznych może się już znajdować zmienna ilość niektórych czynników stosownie do ich mianowania albo do stabilizacji (…)

1. Preparaty enzymatyczne:

• Uzyskuje się przez dalsze rozcieńczanie koncentratów (B) lub przez zmieszanie wyizolowanych enzymów bądź koncentratów enzymatycznych

Źródła enzymów:

Organy roślinne:

• Ziarniaki – amylazy

• Melonowiec – papaina

• Figowiec – ficyna

• Ananas – bromelaina

Organy zwierzęce:

• Żołądki cieląt – podpuszczkę (proteaza)

• Wątroba bydlęca – pepsyna, trypsyna (proteazy) i katalaza (oksydoreduktaza)

Mikroorganizmy:

• Wyselekcjonowane szczepy – określone rodzaje enzymów

• Baterie, drożdże, grzyby strzępkowe

Produkcja i zastosowanie preparatów enzymatycznych

Białko + składniki niebiałkowe + substrat = produkt

Enzymy:

• Budowa

• Katalizatory przemian biologicznych

• Specyficzność funkcjonalna – enzym katalizuje ściśle określoną przemianę

• Specyficzność substratowa – enzymy katalizują przemiany tylko określonego substratu lub grupy substratów do siebie podobnych

Biotechnologiczny podział enzymów:

• Enzymy produkowane i stosowane w dużych ilościach:

- enzymy hydrolityczne (glukoamylazy, amylazy, proteazy, pektynazy), niskie ceny, produkcja w setkach tysięcy ton

• Enzymy specjalne:

- e. w formie bardzo czystej

- drogie

- e. otrzymywane preparatywnie, w skali laboratoryjnej

Technologia preparatów enzymatycznych:

• Selekcja szczepów (wybór rośliny lub zwierzęcia)

• Media hodowlane (hodowla)

• Najczęściej wykorzystywane preparaty enzymatyczne

• Synteza i nadprodukcja enzymu

• Wydzielanie i oczyszczanie enzymu

Selekcja szczepu i media hodowlane:

• Większość technicznych preparatów enzymatycznych z Bacillus sp. i Aspergillus sp.

• Selekcja szczepów pod względem wydajności otrzymanych określonych produktów, zdolności do rozkładu (utylizacji) tanich źródeł węgla, odporności na warunki hodowli

• Zwiększenie wydajności wytwarzanych enzymów

• Uzyskiwanie tzw. mutantów konstytutywnych (zdolnych do wytwarzania enzymu przy braku induktora)

• Uzyskanie mutantów odpornych(?) na działanie represora

• Uzyskanie szczepów dostosowanych do wzrostu w warunkach przemysłowych

Media hodowlane:

1. Zestawiane sztucznie

2. Naturalne:

• Do hodowli na podłożu stałym

- otręby pszenne

- ryż

- wysłodki buraczane wzbogacone o sole mineralne

• Do hodowli wgłębnej

- melasa

- skrobia kukurydziana

- mąka sojowa

- drożdże piwowarskie

Najczęściej wykorzystywane preparaty enzymatyczne:

• Preparaty enzymów amylolityczych

• Cytolitycznych

• Lipolitycznych

• Pektolitycznych

• Proteolitycznych

• Inne preparaty enzymatyczne

Preparaty enzymów amylolitycznych:

Enzymy słodowe są olbrzymią rodziną enzymów, które wykazują katalityczną aktywność w stosunku do wiązania glikozydowego skrobi i produktów jej rozpadu. W przemyśle znaczną rolę odgrywają przede wszystkim amylazy.

Źródłem enzymu dla tych przemysłów mogą być zarówno rośliny ( w tym przed wszystkim ziarniaki zbóż, jak i mikroorganizmy.

W przemyśle znaczącą rolę odgrywają przede wszystkim amylazy.

Skrobia – węglowodan – polimer cząstek α-glukozy

Frakcje skrobi:

• Amyloza – liniowy polimer wielu tysięcy reszt glukozy połączonych wiązaniem α(1-4)

• Amylopektyna – rozgałęziony polimer glukozy połączony z łańcuchem głównym wiązaniami α….

Amylazy – rozkład skrobi wg. Schematu

Skrobia dekstryna maltoza ( proces stopniowy)

Maltoza – tzw. cukier słodowy, dwucukier zbudowany z 2 cząsteczek α-glukozy

Podział dekstryn (o coraz mniejszej masie cząsteczkowej i coraz mniejszych zdolnościach adsorbowania jodu:

• Amylodekstryny – barwiące się jodem na niebieskofioletowo

• Erytrodekstryny – jodem na czerwono

• Achrodekstryny – nie barwią się jodem

• Maltodekstryny – nie barwią się jodem, lecz o niż achrodekstryny

Zmniejszenie zdolności adsorbowania jodu, wzrost właściwości redukujących pośrednich produktów rozpadu skrobii.

Do grupy amylaz należą m.in.:

• α-amylaza

• β – amylaza

• glukoamylaza

• α-D-glukozydaza

• pullulanaza

• izoamylaza

• transferaza glukozowa cyklodekstryn

Podział amylaz:

Amylazy (biorąc pod uwagę rozszczepiane wiązanie):

1. atakujące wiązanie α(1-4)-glikozydowe skrobii np. α i β – amylazy, glukoamylazy

2. atakujące wiązanie α(1-6)-glikozydowe skrobii np. izoamylazy, pullulanazy, glukoamylazy

Amylazy (biorąc pod uwagę położenie rozszczepianego wiązania w skrobi):

1. Endoamylazy np. α – amylazy, amylazy, cyklodekstryny (?)

2. Egzoamylazy np. β – amylazy, glukoamylaza

Z technicznego punktu widzenia rozróżniamy:

• Amylazy upłynniające tj. izoamylazy, α-amylazy, pullulanazy, cyklodekstrylazy

• Amylazy scukrzające tj. niektóre α-amylazy, β-amylazy, glukoamylazy

• Amylazy biorące pod uwage położenie rozszczepionego wiązania skrobii: 1) endoamylazy np. α-amylazy, amylazy, cylkodekstryn, 2) egzoamylazy np. β-amylazy, glukoamylazy

Upłynnianie skrobi:

1. Działanie wysoką temperaturą

2. Działanie enzymów

SKROBIA

Termostabilna α – amylaza

Ogrzewanie gorącą parą wodną (etap konieczny)

Produkty upłyniania: oligosacharydy zbudowane z 10-13 reszt glukozy, dekstryny graniczne (posiadające wiązania α-1,6- glikozydowe, które nie są rozkładane przez α-amylazy.

Wzrostowi lepkości zolu skrobiowego podczas upłynniania zapobiega szybkie rozszczepienie cząsteczek amylozy i amylopektyny na mniejsze fragmenty – rola α – amylazy (endogenna)

Wykorzystanie produktów upłynniania:

• Składnik ograniczający wysychanie wyrobów cukierniczych

• Składnik zapobiegający wzrostowi kryształów lodu w mrożonej żywności

• Substytut lipidów w niskokalorycznej żywności

• Produkt pośredni służący do otrzymania silnie scukrzonych syropów glukozowych oraz maltozowych

Scukrzanie skrobi:

Proces upłynniania:

• Oligosacharydy

• Dekstryby graniczne

Obniżenie pH i temperatury

Glukoamylaza, β- amylaza – odszczepiają glukozę i/lub maltozę od strony . nieredukującego końca

Tworzenie silnie scukrzonych syropów glukozowych oraz maltodekstryn

Wykorzystanie – piekarnictwie do intensyfikacji wytwarzania dekstryn ułatwiających formowanie odpowiedniej tekstury i zapachu skórki chleba.

Scukrzanie jest utrudnione formowaniem dekstryn granicznych (de)

Glukoamylaza działa na wiązanie α-1,6-glikozydowe ale:

• Szybkość reakcji jest niewielka

• Po przekroczeniu 30-35% stężenia glukozy w syropie nasila się reakcja odwrotna

Pululanaza – likwiduje rozgałęzienia cząsteczek

Podatność skrobi na hydrolizę jest różna i zależy od pochodzenia:

• skrobia kukurydziana

• skrobia sojowa

• skrobia ziemniaczana – nie za dobrze

Zastosowanie preparatów amylilitycznych:

• w przemyśle piwowarskim - w procesie zacierania słodu do upłynniania i scukrzania skrobi w celu przygotowania jej do fermentacji przez drożdże; użycie enzymów pozwana na obniżenie temperatury kiełkowania skrobi (drożdże nie są w stanie rozkładać skrobi)

• w gorzelnictwie – do scukrzania zacierów

• w przemyśle zbożowym – do produkcji dekstryn, krystalicznej glukozy, tzw. syropu zbożowego

• w cukiernictwie – do odzyskiwania cukru z odpadów cukierniczych, produkcji cukierków i chałwy

• w przemyśle ziemniaczano-krochmalnym- do produkcji środków zagęszczających, dodatków do sosów, bydyniu, skład odżywek dla dzieci, do produkcji dekstryn i amylaz służących jako materiał do opakowań środków spożywczych( np. tabletki powlekane, witaminy)

• w przemyśle tekstylnym – do usuwania skrobi z włókien roślin (tzw. odklejanie) przed bieleniem i barwieniem

• do produkcji detergentów i chemikaliów ( w 1914 roku Weizman wyizolował Clostridium acetobutyricum – bakterie zdolne do przetwarzania skrobi w aceton i butanol – znaczenie militarne do produkcji nitrogliceryny)

• biodegradacja – jako środek przyspieszający biodegradacje odpadów spożywczych, w oczyszczalniach ścieków.

Źródła enzymów wykorzystywanych przemysłowo:

Enzymy amylolityczne ziarniaka – znajdują się głównie w warstwie bielma przylegającej bezpośrednio do warstwy komórek aleuronowych oraz tarczce

Warstwa komórek aleuronowych i okrywa owocowa-nasienna nie zawierają amylaz.

Amylazy roślinne mają odmienne optymalne działania tj. temperatura i pH środowiska:

• α – amylaza jest najbardziej aktywna w środowisku mało kwaśnym (pH 4,7-5,0) i w temperaturze 51-66ºC

• β – amylaza – bardzo kwaśnie, niższa temperatura (48 - 51ºC)

Zawartość enzymów w suchym ziarniaku jest niewielka natomiast po rozpoczęciu procesu kiełkowania aktywności tych enzymów jest bardzo duża: ma to znaczenie w biochemii żywności:

- produkcji piwa ziarniaki muszą być skiełkowane

- w produkcji mąki suchej

Od aktywności amylaz zależy w głównej mierze siła fermentacyjna mąki, warunkująca odpowiednie spulchnienie pieczywa i przy niesprzyjających warunkach pogodowych podczas zbioru zbóż, ziarno w skutek podwyższonej wilgotności może kiełkować już na polu w snopkach lub później w magazynie, jeśli uprzednio nie zostało podsuszone. Zachodzi w tym przypadku zjawisko ? porastania przy czym zostaje uaktywniona amylaza. Powśnięcie? W początkowej jego fazie może nie być widoczne gołym okiem i może być wykazane tylko metodą chemiczną (tzw. Porost ukryty). W późniejszym stadium porośnięcie jest już widoczne w postaci kiełka.

Mikrobiologiczne amylazy

Ze względu na koszt, wydajność produkcji i możliwość uzyskania enzymów o pożądanych właściwościach kinetycznych na coraz większą skalę prowadzone są badania nad amylazami wydzielanymi przez mikroorganizmy

Źródłem tych enzymów mogą być drożdze mlekowe, bakterie i promieniowce, jednak przemysłowe zastosowanie znajdują głównie amylazy pleśniowe i bakteryjne. Uzyskiwanie zwłaszcza z bakterii Bacillus subtilis oraz pleśni.

Skrobia dekstryny maltoza

Glukoza glukoamyloza – Aspergillus Niger, Rhizopus niveus

Fruktoza

Izomeraza glukozowa

• Bacillus coaguians

• Streptomyces rubiginosus

• Actinoplanes missouriensis

• Fluvobacterium arborescens

Wykład 4:

Preparaty enzymów cytolitycznych

Celuloza jest najbardziej rozpowszechnionym w przyrodzie i całkowicie biodegradowalnym polimerem (β-1,4-glukoza)

• Inkrustacja innymi związakami np. ligniną, żywicami

• Towarzyszy jej hemiceluloza (nierozpuszczalne w wodzie homo i heteropolisacharydy)

Celuloza i hemiceluloza – jako składnik drewna (tkanka przewodząca) oraz włókien sklerenchymatycznych (tkanka wzmacniająca)

Pozyskiwanie celulozy:

• Pnie drzew

• Źdźbła traw

• Łodygi krzewów

• Korzenie, liście

• Inne części roślin

• Niemal czystą celulozę zawierają len, bawełna, konopie

Enzymy zdolne do hydrolizy:

• Egzo – β – (1-4)glukanaza – odszczepia celobiozę od nieredukującego końca łańcucha celulozy

• Endo – β – (1-4)glukanaza – rozszczepia wiązanie β - (1-4) – glikozydowe wewnątrz łańcucha

• Β-glukozydaza (celobioza) – rozszczepia celobiozę do glukozy

Enzymatyczną degradację celulozy utrudniają jej właściwości oraz znajdujące się w biomasie hemicelulozy i lignina.

Szybkość hydrolizy celulozy uzależniona jest od wielkości powstałych włókien celulozy, dostępnej dla tworzenia kompleksu z enzymem.

Konieczna jest więc wstępna obróbka surowca, usuwająca barierę ligninową oraz zwiększająca porowatość i udział amorficznych obszarów włókien celulozowych. Schemat struktury fibryli celulozowych. Szybkość hydrolizy celulozy uzależniona jest od wielkości powierzchni włókien celulozy, dostępnej dla tworzenia kompleksu z enzymem.

Wstępna obróbka surowca:

• Środki spęczniające np. roztwory NaOH

• Ogrzewanie materiału pod ciśnieniem w temperaturze ok 250ºC ekspandowanie – gwałtowne rozprężenie materiału w chwili momentalnego przejścia do ciśnienia atmosferycznego „odklejanie” ligniny oraz wzrost powierzchni włókien

Wykorzystanie enzymów cytolitycznych:

• Produkcja sosów

• Intensyfikacja ekstrakcji białek

• Jako preparaty ułatwiające przyswajanie pasz

• Do rozluźniania tkanek roślinnych prze poddaniem ich ekstrakcji lub tłoczeniu

• W przemyśle farmaceutycznym i winiarskim

• Do usuwania zmętnień w sokach owoców cytrynowych

• Do hydrolizowania celulozy i ligniny w konserwowanych lub zamrażanych warzywach

• Jako źródło węgla dla rozwoju drożdży – wytwarzanie biopaliw zawierających etanol

Producenci celulaz:

• Bakterie mezofilne i termofilne z rodzaju Cellulomonas i Clostridium

• Promieniowce z rodzaju Streptomyces, Actinomyces, Therromodrospda[?]

• Grzyby z rodzaju Trichoderma, Sporotrichum, Fusarium, Aspergillus

• Trichoderma – przemysłowo

Hemiceluloza – mieszanina nierozpuszczalnych w wodzie homo i heteropolisacharydów np. ksulany, mannany, galaktany

Hemicelulazy

1. Producenci hemicelulozy:

• Aspragillus Niger, Trichoderma reesei, T. viride, T. emersoni

Wykorzystanie:

• Przemysł piwowarski, obróbka ziarna kawowego

• Razem z celulazami

Enzymy zdolne do hydrolizy hemicelulozy ?(…) :

• Egzohemicelulazy – odszczepiają sukcesywnie pojedyncze lub podwójne reszty cukrowe od nieredukujacego końca cząsteczki

• Endohemicelulazy – hydrolizują wiązanie glikozydowe łańcuchów hemicelulozy w sposób przypadkowy ?(…)

Otrzymywane metodami syntezy z wykorzystaniem: Humicola insolens i Aspergillus Niger

Preparaty enzymów lipolitycznych – należą do klasy hydrolaz

Lipidy – tłuszcze, woski, sterole, rozpuszczalne w tłuszczach witaminy (A,D,E,K) monoalcyloglicerole, diacyloglicerole, triacyloglicerole, fosfolipidy

Funkcja lipidów:

• Magazynowanie energii

• Tworzenie błon biologicznych

• Udział w przesyłaniu sygnałów

Triacyloglicerol

Hydroliza przez odpowiednią lipazę

Kwasy tłuszczowe glicerol

Lipazy dzielą się na 3 grupy (ze względu na specyficzność działania):

• Działające na wszystkie wiązania estrowe w cząsteczce triacyloglicerolu

• Lipazy hydrolizujące wiązanie 1-3 w triacyloglicerolu

• Lipazy hydrolizujące wiązanie 2 w triacyloglicerolu

Lipazy

Cholesteroloesterazy

Enzymy lipolityczne lipazy są stosowane do:

• Odtwarzania zapachu mlecznego w niektórych produktach spożywczych

• Poprawy cech organoleptycznych (smaku i zapachu) serów, lipoliza tłuszczu mleka nadaje specyficzne właściwości serom typu cheddar, ementalski, bre, camembert, rogueford

• Podukcja koncentratów zapachowych z tłuszczu mlekowego – wykorzystywane podczas produkcji sosów i przypraw do zup

• Polepszanie smaku w wyrobach cukierniczych (cukierki, czekolada)

• Produkcja pełnego mleka w proszku, przeznaczone do produkcji czekolady

• Odtłuszczania skór i kości

• Synteza substancji powierzchniowo czynnych (detergenty, proszki do prania)

• Synteza tłuszczów teksturyzowanych

Lipazy cechuje ogromna różnorodność ze względu na:

• Rodzaj drobnoustroju użytego do syntezy

• Warunki hodowli

Producenci:

• Aspergillus Niger

• Rhizopus arrhizus

• Rhizomucor niehei

• Candida rugosa

Otrzymywanie lipaz

Hodowla powierzchniowa lub wgłębna:

• Źródło węgla:

-proste lub złożone węglowodany

-mąka sojowa

-glicerol

-pepton

-nafta

• Źródło azotu – sole amonowe

• Inne: olej z oliwek lub trójbutytyny

• Kwasowość pH 6,0-9,0

• Temperatura 30-50ºC

• Intensywne napowietrzanie

• Czas hodowli: 2-3dni

Preparaty enzymów pektynolitycznych

Pektyny są jednym z podstawowych składników budulcowych ścian komórkowych roślin oprócz funkcji budulcowej, regulują również gospodarkę wodną i pełnią rolę międzykomórkowej substancji łącznej.

Pektyny – mieszanina węglowa – są to generalnie polisacharydy i oligosacharydy o zmiennym składzie, główny składnik to kwas galaktourynowy

Pektyny dla ludzi pod względem odżywczym są związkami balastowymi. Pod względem ????

1. Wyróżnbiamy dwie funkcje pektyny, w zależności od stopnie ekstrakcji:

• Wysokometylowane w którym zestryfikowanych 250% [?] grup karboksylowych reszt kwasu galakturonowego

Związki niskometylowane (NM) w których stopień estryfikacji jest mniejszy do 50 %

Wspólną cechą pektyn jest zdolność do tworzenia żeli w warunkach kwaśnych.

Zdolność żelowania zależna jest od stanu zmetylowania pektyn:

• Pektyny wysokometylowane zelują przy pH 3,0, stężeniu cukru 65% oraz zawartości pektyn 0,3-2%

• Żele pektyn niskometylowanych powstają przy niższym stężeniu cukru (30-40%) oraz szerszym zakresie pH 3-6

• !!! niezbędnym czynnikiem utworzenia trójwymiarowej siatki żelu jest obecność jonów wapnia, w stężeniu 0,01-0,1%

Zawartość pektyn w różnych roślinach:

• Pożeczki, jabłka – 1-1,5%

• Morela zwyczajna – 1%

• Czereśnia – 0,4%

• Pomarańcza – 0,5 – 3,5%

• Marchew – 1,4%

• „skórki” owoców cytrusowych – 30%

Preparaty pektynolityczne – rozkład fragmentów nierozgałęzionych:

• Pektynoesteraza – odłączenie metanolu od grupy karboksylowej, kwasu poligalakturonowego, pH 4 (pleśniowa) i 7 (bakteryjna)

• Depolimeraza

-transeliminaza pektyn

-transeliminaza kwasu pektynowego

-poligalaktouranaza

?????????

1. Transaminoza pektyn – rozszczepienie wiązania glikozydowego w sąsiedztwie grupy karboksylowej zestryfikowanej metanolem

Treeliminaza[?] kwasu pektynowego- rozszczepiają wiązania glikozydowe w sąsziedztwie wolnej grupy karboksylowej z niskometylowanej pektynie

Poligalaktoamidaza[?]- rozszczepiająca wiązania glikozydowe w sąsiedztwie wolnej grupy karboksylowej pH 4-4,5

Wymienione enzymy degradują tylko nierozgałęzione fragmenty pektyn, co w konsekwencji prowadzi do powstania niestabilnych zmętnień podszas przechowywania(?) soków oraz trudności w zastosowaniu procesu ultrafiltracji

Producenci:

• A. Niger

• Coniothrium dipiodela

Zastosowanie preparatów:

• Produkcja niskocukrowych dżemów i galaretek

• Stabilizatory do napojów i lodów

• W winiarstwie

• W uzyskiwaniu klarownych soków

• Do depektynizacji miazgi i moszczu

• W produkcji soków zagęszczonych

Innym z najważniejszych obszarów stosowania preparatów pektynolitycznych jest przemysł sokowniczy:

Enzymatyczne upłynnianie wytłoków – hydroliza polimerów ściany komórkowej owoców i warzyw do prostych związków, głównie cukrów i kwasów organicznych, prowadząca do wysokich uzysków

Preparaty enzymów proteolitycznych:

Podział ze względu na budowę centrum aktywnego:

• Proteinazy serynowe (trypsyna, chymotrypsyna, subtilizyna)

• Proteinazy tiolowe (papaina, ficyna, bromelaina)

• Proteinazy kwaśne (pepsyna, chymozyna)

• Metaloproteinazy (metaloproteinazy mikrobiologiczne)

Proteinazy chrakteryzujące się specyficznością działania:

• Proteinazy serynowe – hydrolizują wiązanie peptydowe w miejscach przyległych do aminokwasów aramoatycznych

• Proteinazy tiolowe - – hydrolizują wiązanie peptydowe w miejscach przyległych do aminokwasów zasadowych

• Proteinazy kwaśne – m.in. przylegające do reszt aminokwasów aromatycznych lub

• Proteazy kwaśne hydrolizują wiązania peptydowe m.in. przylegające do reszt aminokwasowych aromatycznych lub dwukarboksylowych (kwasy asparaginowy i glutaminowy. Proteinazy tiolowe hydrolizują(…)

Podpuszczka (fragment laboratoryjny, chymozyna, renina) – otrzymuje się ze świeżego lub suszonego żołądka cieląt lub w wyniku hodowli drobnoustrojów

Podpuszczka jest również w żołądku człowieka, ale jedynie w okresie niemowlęcym, zanika u dzieli ok 3 roku życia – powoduje denaturację białka z mleka matki

Podpuszczka katalizuje rozkłada rozpuszczalnego kazeinianu wapnia do nierozpuszczalnego parakazainianu (twaróg), który może być następnie trawiony przez pepsynę.

Występuje w stanie ciekłym, w postaci proszku lub tabletek.

Pepsyna – jest czynna postacią pepsynogenu, enzymu (endopeptydazy) wydzialanego przez komórki gruczołowe żołądka

- otrzymuje się błony śluzowej żołądka świń lub bydła

Pepsyna :

1. występuje w stanie ciekłym, w postaci proszku lub tabletek

2. pepsynę otrzymuje się z błony śluzowej żołądka świń lub bydła

3. Pierwszy odkryty enzym trawienny, uaktywnienie z pepsynogenu w obecności tlenu (działanie pH 6) e leczeniu nieżytu żoładka, niedokwaśności, braku łaknienia

W celu osiągnięcia jej stabilności, przechowuje się ją czasami w nasyconym roztworze siarczanu magnezu lub uciera z sacharozą lub laktozą (sproszkowana pepsyna) lub w pH 11

Enzymy trzustkowe

Do ważniejszych enzymów wydzielanych przez trzustkę:

• Trypsyna i chymotrypsyna (rozszczep białka) pH 8

• α – amylaza (rozszczepia skrobie)

• lipaza (rozszczepianie tłuszczu)

• (…)

Papaina – enzym trawiący białka, otrzymywany z owoców papai (Curica papaya), jest to substancja podobna do ludzkiej pepsyny

Termin papaina obejmuje zarówno suszone mleczko kauczukowe ??

Papaina trawi białka strukturalne pasożytów obecnych w przewodzie pokarmowym do albuminoz i peptonów. Dodatek witaminy C i amigdaliny katalizuje aktywność papainy:

Środek przeciwpasożytniczy (np. Lambliozie) działając na zasadzie stawienia ciała pasożyta

Bromelina – izolowana z ananasa jadalnego, wstępnie trawi białko

2 rodzaje:

• Bromelina pędowa

• Bromelina z owocostanu (+ kombinacje innych składników tj. (…))

Zastosowanie:

1. Zmiękczanie mięsa w warunkach domowych

2. W medycynie:

• Działanie przeciwzapalne

• Leczenie urazów sportowych, problemów trawiennych, zapalenia żył, zapalenia zatok, wspomaganie gojenia po zabiegach chirurgicznych

Pomaga zwalczyć przekrwienie zatok, infekcje przewodu moczowego intensyfikacje działanie antybiotyków, w chorobach autoimmunologicznych, w AIDS, głównie obszary w medycynie do leczenia nawozów sportowych, problemów trawiennych, zapalenie żył, zapalenie zatok, gojenie po zabiegach chirurgicznych.

Ficyna – otrzymywana z mleczka figi Ficus carica, proteolityczny enzym roślin nasiennych należący do proteinaz, wykorzystanie: medycyna i przemysł kosmetyczny

Aktynidyna – otrzymywana z owoców kiwi, proteaza cysteinowa, nie wykorzystywana na skalę przemysłową – silne właściwości alergiczne, w fotografii – usuwanie zeatyny ze starych filmów

Proteazy bakteryjne:

Zasadowe:

• Składniki aktywne proszków do prania (stężenie od 0,015% do 0,025%)

• Wysoka aktywność w podwyższonych temperaturach

• Niska specyficzność

• Odporność na inne składniki proszków: detergenty, alkalina, wybielacze

Kwaśne:

Używane do hydrolizy białek (produkcja sosu sojowego i innych hydrolizatów mleka i jaj w proszku), używane w piekarnictwie, przemyśle rybnym, tekstylnym, skórzanym (zmiękczanie i usuwanie włosów ze skór) (produkcja sosu sojowego innych hydrolizatów, mleka i jaj w proszku)

Wykorzystanie enzymów proteolitycznych:

1. Przemyśl mleczarski:

• Koagulacja mleka w procesie wyrobu serów i późniejszej degradacji parakazeinianu wapniowego

• Do produkcji hydrolizatów kazeiny i „mleka sojowego”

• Do stabilizacji i poprawienia zwilżalności mleka w proszku

1. Serowarstwo

• Kwaśne proteazy grzybowe do wytracania kazeiny zamiast preparatu podpuszczkowego (…)

1. Przemysł piwowarski

• Zastosowanie poprawia stabilizację i klarowność piwa (rola podczas chłodzenia gotowego produktu)

• Rola w (?) jęczmienia i w początkowej fazie (…)

1. Chemia gospodarcza

• Zastosowanie proteaz bakteryjnych jako składników proszków do prania

1. Przemysł tekstylny

• Wzmacnianie wytrzymałości przędzy

Wykład 5:

Inne preparaty enzymatyczne:

1. β-galaktozydaza

2. Oksydaza glukozowa

3. Izomeraza glukozowa

β-galaktozydaza = laktaza:

• Hydrolizuje wiązanie β-(1-4)glikozydowe laktoza miedzy glukozą i galaktozą

• Enzym zależnie od pochodzenia jest zewnątrz lub wewnątrzkomórkowy

• Producenci: A. niger, A. oryzae, A.flavis

• Wykorzystanie: produkcja mleka pozbawionego laktozy

Oksydaza glukozowa:

• Katalizuje utlenianie β-D-glukozy do D-glukono-lantanu (kwas glukonowy i nadtlenek wodoru)

• Producenci: A.niger

• Wykorzystanie:

- stabilizacja piwa, win, soków

- usuwanie glukozy i tlenu z paczkowanej żywości

- odcukrzanie masy jajkowej przed suszeniem

Izomeraza glukozowa:

• Katalizuje przekształcanie D-glukozy do D-fruktozy

• Producenci: Bacillus, Microbacterium, Arthrobacter, Streptomyces

Fosfolipidy – to lipidy, w których skład wchodzą: glicerol, kwas tłuszczowy, kwas fosforowy związany (…), stanową istotny składnik budowy błon komórkowych

Fosforylacja lipidów do fosforylowa (…)

Lecytyna – (fosfatydylocholina) – jest estrem gliceryny, w której 2 grupy OH są zestryfikowane kwasem tłuszczowym, a trzecia ma zamiast atomu H resztę kwasu ortofosforowego zestryfikowaną choliną. Lecytyna jest integralną częścią błon komórkowych. Jest niezbędna do funkcjonowania układu nerwowego zwierząt.

Lecytynę wykorzystuje się do tworzenia liposomów.

Liposomy są to zamknięte struktury pęcherzykowate zdolne do zamykania roztworów wodnych, powstające z fosfolipidów.

Są one zbudowane z jednej do kilkunastu koncentrycznie ułożonych dwuwarstw lipidowych, analogicznie do lipidowego zrębu błon biologicznych.

Stosując kryterium wielkości i warstwowości liposomów, wyróżniamy:

• Liposomy wielowarstwowe – MLV – zbudowane z kilku do kilkuset warstw lipidów, średnica 300nm-20μm

• Duże jednowarstwowe liposomy – LUV – duże pęcherzyki otoczone pojedynczą błoną liposomową, średnica 80-1000nm

• Małe jednowarstwowe liposomy – SUV – średnica 20-80nm

• Olbrzymie jednowarstwowe liposomy – GUV osiągające 1-2 mikrometrów średnicy.

Powstawanie tych struktur z lipidów opisują 2 główne modele:

• Model „pączkowania” – pęcherzyki powstają w czasie stopniowego uwadniania suchych lipidów błonowych. Podczas uwadniania warstwy lipidów cząsteczki wody wnikają pomiędzy poszczególne dwuwarstwy, powodując ich rozpulchnianie, rozdzielanie (…)

Jedne liposomy można przekształcić w inne, mogą w siebie przechodzić w odpowiednich warunkach.

Cechą charakterystyczna liposomów jest spontaniczne tworzenie pęcherzyków, w których można zamknąć różne roztwory. Dzięki temu liposomy znalazły zastosowanie w kosmetyce i medycynie. Są (…)

Taki sposób dostawy leku, bądź innej substancji, jest o wiele bezpieczniejszy dla organizmu oraz chroni substancję przed szybką degradacją

Najnowsze technologie mają na celu stworzenie metody dostarczania leku w odpowiedniej ilości, nietoksycznej dla organizmu, a (…)

Wady liposomów:

• Liposomy mają krótki okres trwania w układzie – szybkie przechwytywanie przez system retikulum endoplazmatycznego

• Krótki czas cyrkulacji we krwi

• Gwałtowne wychwytywanie przez komórki wątroby i śledziony, co zmniejsza ilość liposomów docierających do celu

Liposomy Stealth:

• Są mniej wykrywalne dla układu immunologicznego, a co za tym idzie dłużej krążą we krwi. W taki sposób substancja w nich zawarta (lek) może być obecny w ustroju dłużej, wymagana jest zatem jego mniejsza jednorazowa dawka

• Można je „zaadresować” – nadać im kierunek gdzie mają się ulokować

Ich znaczącymi zaletami są:

• Dostarczanie leków do miejsc docelowych w dużej ilości, co chroni lek przed degradacją, a organizm przed interakcjami z lekiem poza miejscem docelowym

• Lek trafia do miejsca przeznaczenia bez pośrednictwa układu ER

• W połączeniu z kontrolowanym utrwalaniem mogą lek uwalniać szybko jak i powoli

• Dodatkowo można kontrolować uwalnianie leku w danym miejscu poprzez modyfikacje błony liposomów

Regulacja syntezy i nadprodukcja enzymów

Zasady koordynacji metabolizmu jakie występują u drobnoustrojów:

1. Metabolizm drobnoustrojów ma charakter zbilansowany – zapewnia niezależnie od środowiska najbardziej ekonomiczną gospodarkę źródłami energii, prekursorami do procesów syntezy komórki, jonami

2. Metabolizm drobnoustroju ma charakter skoordynowany – w komórce funkcjonują układy „autonomicznej” regulacji szybkości poszczególnych procesów na poziomie uzasadnionym bieżącymi potrzebami komórek, zaleznymi od warunków zewnętrznych (np. Ph, temp.)

Mechanizmy regulacji:

1. Kontrola ilości enzymów (np. szybkość syntezy, procesy hydrolitycznego rozkładu białek, resynteza białek, akumulacja RNA)(enzymy konstytutywne i indukcyjne)

2. Kontrola aktywności enzymu (aktywacja lub hamowanie)

3. Kontrola transportu komórkowego

Enzymy konstytutywne – syntetyzowane są w komórce stale, niezależnie od fazy hodowli i warunków środowiska, czyli są względnie na stałym poziomie

Enzymy indukcyjne – syntetaza jest ściśle regulowana na stałym poziomie

Regulacja syntezy i nadprodukcji enzymów

Modyfikacja metabolizmu

Mutanty mikroorganizmy zmodyfikowane genetycznie (GMM)

Regulacja syntezy:

1. Czynniki środowiskowe

2. Czynniki fizjologiczne:

- szybkość wzrostu drobnoustrojów

- obecność substancji indukujących i/lub wywołujących represję

Schemacik:

1. Regulacja syntezy i nadprodukcja enzymów modyfikacje metabolizmumutanty mikroorganizmy modyfikowane (GMM)

2. Regulacja syntezy(…)

Substrat (indukcja) enzym(indukcja)produkt

Produkt (represja) enzym

Związki enzym

Biosynteza przemysłowa:

1. Skala wielkoprzemysłowa

• Proteazy

• α-amylazy

• izomeraza glukozowa

• (przemysł spożywczy i koncerny)

1. Skala małoprzemysłowa

• Aminoacylaza

• Acylaza penicylinowa

• Katalaza

• (przemysł farmaceutyczny i politechniki)

1. Skala laboratoryjna

• Enzymy restrykcyjne

• (uniwersytety)

Wykład 6:

Etapy izolacji i oczyszczania konieczne do uzyskania preparatu enzymatycznego lub czystego enzymu

Zróżnicowanie metod wyodrębniania enzymu z materiału wyjściowego wynika ze źródła enzymu. W przypadku enzymów mikrobiologicznych zależy od:

• Typu hodowli (na podłożu stałym lub hodowla wgłębna)

• Od lokalizacji komórkowej enzymu

Tkanka roślinna lub zwierzęca:

• Dezintegracja komórki

• Wydzielenie enzymu

• Oczyszczenie enzymu

• Standaryzacja

Komórki mikroorganizmu

oddzielenie biomasy

biomasa enzym wydzielony do

enzymy środowiska hodowlanego

wewnątrzkomórkowe

Surowiec do dalszego przerobu

Dezintegracja komórek

Oczyszczanie enzymu

i standaryzacja

Metody wydzielania i oczyszczania enzymu muszą zapewnić:

• Zachowanie aktywności biologicznej enzymu

• Przeciwdziałanie dezaktywacji enzymu

• Prowadzenie procesów w warunkach jałowych

Operacje jednostkowe określone mianem wydzielania i oczyszczania obejmują:

• Wydzielanie enzymu z pozostałości po zdeintegrowanej biomasie

• Koncentrację enzymu tj. usunięcie wody

• Wstępne oczyszczanie np. strącanie enzymu w wyniku zmiany warunków środowiska

• Właściwe oczyszczanie tj. wydzielenie enzymu z wykorzystaniem szeregu technik

• Utrwalanie enzymu

Wydzielanie biomasy

Metody technologiczne stosowane do oddzielania komórek od środowiska:

• Zależą od natury szczepu

• Określane są przez ostateczny cel produkcji

Wydzielenie i zagęszczenie biomasy jest prowadzone z uwzględnieniem:

• Różnic w wielkości

• Różnic w gęstości

• Różnic w dyfuzyjności

Metody wydzielania można podzielić na:

• Wirowanie

• Filtrację i mikrofiltrację

• Sedymentację i flokulacje

Sedymentacja i flokulacja:

• Najprostsza technika – prowadzona w odstojnikach – w przypadku bakterii i komórek– konieczna jest wstępna obróbka w celu powstawania aglomeratów

• Rodzaje:

- odwracalna – neutralizacja ładunku na powierzchni komórki

- nieodwracalna – powstawanie powiązań między poszczególnymi komórkami

• Zależy od: temperatury, pH, siły jonowej roztworu, właściwości komórek i ich stanu fizjologicznego

• Czynniki flokujace: sole nieorganiczne, hydrokoloidy mineralne, organiczne polielektrolity (np. polimeraza na bazie akrylamidów)

Filtracja biomasy:

1. Rodzaje filtracji:

• Plackowa – do wydzielania grzybni i drożdży, bakterii poddanych flokulacji oraz krystalicznych metabolitów i precypitatów (chodzi o osad)

• Objętościowa – do jałowienia powierzchni oraz klaryfikacji zawiesin drobnych (w metodzie chodzi o czystość filtratu, a nie wydzielenie osadu)

• Dynamiczna – do zagęszczania zawiesin bakterii (szybkoobrotowe mieszadło lub obracający się filtr nie dopuszcza do powstania placka następuje zatężenie a nie osadzanie)

• Filtracja biomasy (schemat) metoda wykorzystująca separacyjny efekt występujący podczas przepływu zawiesiny przez odpowiednią przegrodę.

Wirowanie:

1. Zastosowanie siły odśrodkowej zwiększa efekt separacyjny

2. Zastosowanie wirówek sedymentacyjnych i filtracyjnych:

• Separatory do otrzymania zagęszczonej zawiesiny biomasy

• Końcowe wydzielanie biomasy i stałych produktów biomasy

Wady wirowania:

• Wysokie koszty

• Niezbyt duża dokładność odwirowania (supernatant)

Dezintegracja ścian komórkowych:

• Usunięcie ściany komórkowej bez konieczności zachowania struktur

• Usuniecie ściany komórkowej przy jednoczesnym zachowaniu struktur i składników wewnątrzkomórkowych

• Częściowe rozluźnienie ściany komórkowej i zwiększenie jej przepuszczalności

Wybór metody dezintegracji należy uzależnić od:

• Właściwości materiału biologicznego

• Wrażliwości interesującego nas składnika na temperaturę, ciśnienie, siły sciągające

• Miejsce występowania składnika w komórce

• Kosztów i czasu realizacji procesu

Dezintegracja komórki:

1. Metody mechaniczne:

• W fazie ciekłej

- ultradźwięki

- ciśnienie

- mieszanie

• W fazie stałej:

- rozcieranie

1. Metody niemechaniczne:

• Odwadnianie:

- suszenie powietrzem

- suszenie próżniowe

- rozpuszczalniki

• Liza:

- fizyczna

- chemiczna

- biologiczna

- enzymatyczna

Oczyszczanie i zagęszczanie:

• Zagęszczanie termiczne

• Ekstrakcja

• Metody membranowe

• Metody dializy

• Metody chromotograficzne

• Metody elektroforetyczne

• Precypitacja

• Krystalizacja

Zagęszczanie termiczne:

• Termiczna wrażliwość wielu produktów

• Zagęszczanie termiczne możliwe jest w aparatach o krótkim czasie kontaktu zagęszczonego roztworu z powierzchnią grzejną lub w aparacie próżniowym

• Stosowane do roztworów otrzymywanych w wyniku ekstrakcji

Ekstrakcja:

• Wada – znaczna część aktywnych substancji biologicznych ulega denaturacji w rozpuszczalnikach organicznych

• Metoda skuteczna w przypadku zagęszczania substancji trwałych w środowisku bezwodnym

• Metoda stosowana w produkcji antybiotyków

• Ekstrahenty – wodne mieszaniny glikolu polietylenowego i dekstranu.

Metody membranowe:

• Różne typy membran

• Metody stosowane do rozdzielania i oczyszczania roztworów ciekłych

Rodzaje:

• Ultrafiltracja

• Odwrócona osmoza

• Nanofiltracja

Zastosowanie metod membranowych:

• Zagęszczenie: krwi, jajek, żelatyny, skrobi

• Klarowanie: soków, piwa

• Odzyskanie piwa z brzeczki piwnej

• Koncentracja – zagęszczanie enzymów

• Odzysk produktu z wody procesowej

• Standaryzacja mleka na produkty fermentowane

• Oczyszczanie mleka z drobnoustrojów

• Frakcjonowanie białek

• Obróbka serwatki

Ultrafiltracja:

• Służy do rozdzielania/zagęszczania związków o średnicy cząsteczek 1-100nm

• Konieczność zastosowania ciśnienia (0,1-1,0 MPa)

• Membrany – pochodne celulozy, polimerów syntetycznych i spieków ceramicznych

• Wykorzystanie: koncentracja białek, biomasy wirusów lub bakterii, jako etap pośredni przy zagęszczaniu

Odwrócona osmoza:

• Polega na przepływie rozpuszczalnika w kierunku przeciwnym do działania ciśnienia osmotycznego

• Efektywność zależy od budowy membrany oraz jej oddziaływania z separowanym składnikiem

• Stosowanie membrany – modyfikowana celuloza lub monetyczne [?] poliamidy

Metody dializy:

• Wykorzystywana do odsalania preparatów

• Rodzaje:

1. Diafiltracja – zastosowanie układu ultrafiltracyjnego z cyrkulacją roztworu oczyszczonego i stałym uzupełnianiu tego roztworu czystą wodą, siłą napędową jest różnica ciśnień

2. Dializa – wykorzystanie przegród półprzepuszczalnych, przebiega pod wpływem różnicy stężeń między roztworem oczyszczanym, a czystym rozpuszczalnikiem

3. Elektroliza – wykorzystanie ruchu jonów w polu eklektycznym i przegód półprzepuszczalnych dla rozdziału cząsteczek o określonym ładunku (anionów i kationów)

Metody chromograficzne:

• Wykorzystywane do rozdziału

• Zasada rozdzielenie polega na różnicowaniu rozdzielanego materiału na podstawie różnych parametrów i właściwości

Podział ze względu na ilość materiału poddanego rozdziałowi:

1. Analityczna (10^-9 – 10^-2g)

2. Preparatywna (10^-2 – 10²g)

3. Przemysłowa ( >10²g)

Ze względu na rodzaj oddziaływań pomiędzy rozdzielaną mieszaniną wyróżnia się kilka rodzajów chromatografii:

• Chromatografia jonowymienna i wymienniki jonowe

• Chromatografia powinowactwa?

Chromatografia adsorpcyjna:

• Najprostsza i najmniej dokładna

• Wykorzystywana do rozdziału substancji chemicznych takich jak lipidy, związki barwne

• Chromatografia wykorzystuje różnice powinowactwa różnych związków do powierzchni aktywnego sorbentu

• Sorbenty: bentonit, węgiel aktywny, dekstran, hydroksyapanat, fosforan wapnia, szkło porowate,szyki kożel[?]

Filtracja żelowa:

• Zasada opiera się na różnej dyfuzji cząsteczek przez fazę nieruchomą (złoże)

• Najszybciej z kolumny są eluowane cząsteczki o dużych wymiarach, które nie dyfundują do wnętrza złoża, jako ostatnie zaś cząsteczki najmniejsze

• Nośniki – Sephadex, sephacryl

• Wykorzystywanie – w skali przemysłowej do wydzielania i oczyszczania białek np. z serwatki, do usuwania soli oraz małocząsteczkowych zanieczyszczeń, w skali laboratoryjnej do rodzielania białek enzymatycznych i odsolania prób.

Chromatografia jonowymienna:

• Chromatografia o największym znaczeniu i wykorzystaniu

• Bazuje na wykorzystaniu oddziaływań różnoimiennych ładunków

• W zależności od wymienianych jonów prowadzi się chromatografię na wypełnieniach anionowymiennych (DEAE – celuloza, sephadex, sepharose, mono Q) i kationowymiennych (np. dowex, amberlite, kaboksymetyloceluloza – CM)

• Metoda ta wymaga zmiany warunków procesu (stężenia soli, pH) koniecznie jest więc zastosowanie systemu gradientowego

Chromatografia powinowactwa:

• Metoda wykorzystuje specyficzne połączenia, które mogą tworzyć się pomiędzy cząsteczkami enzymów a ligandami nośnika

• Interakcja substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej i unieruchomionym ligandem może mieć różny charakter, może to być oddziaływanie pomiędzy:

- hormonem i receptorem

- enzymem i substratem

- enzymem i inhibitorem

- przeciwciałem i antygenem

- komplementarnymi odcinkami kwasów nukleinowych

- kwasami nukleinowymi i białkami

• Metoda bardzo selektywna

• Chromatografia z wykorzystaniem – przeciwciał monoklonalnych

• Zastosowanie – w przemyśle farmaceutycznym, do reparacji DNA, RNA

• Wykrywanie z kolumny odbywa się przy użyciu roztworów o odpowiednio dużej lub małej kwasowości czynnej

Metody elektroforetyczne:

• Zjawisko elektroforezy polega na oddziaływaniu pola elektrycznego na naładowane cząsteczki

• Ruchliwość elektroforetyczna rozdzielanych składników jest uzależniona od:

- wielkości cząsteczek

- punktu izoelektrycznego

- Wielkości cząsteczek

- Punktu izolelktrycznego

- Siły jonowej

• Rodzaje

- elektroforeza: pionowa, pozioma, kapilarna,

- elektroforeza: stałoprądowa, pulsacyjna

- elektroforeza: natywna, z SDS

Precypitacja:

• Najczęściej stosowana technika oczyszczania, frakcjonowania i zatężania białek

• Wykorzystuje zależności pomiędzy rozpuszczalnością białek a temperatura i stężeniem innych substancji tzw. precypitatów

• Precypitaty:

- siarczan sodu i amonu

- rozpuszczalniki organiczne (etanol, izopropanol, metanol)

- Polimery (glikol polietylenowy, polietyloimina)

Sposoby wytrącania:

• Wysalanie – dodatek soli obojętnej np. (NH4)2SO4 (wzrost oddziaływań hydrofobowych)

• Rozpuszczalnikiem – dodatek acetonu, etanolu (obniżenie stałej dielektrycznej)

• Flokulacja polimerem niejonowym (blokowanie dostępu wody do białka)

• Flokulacja polimerem jonowym (neutralizacja ładunków i wytrącania)

Schemat wydzielania przez precypitację:

1. Dodanie precypitatu w celu strącenia białek balastowych – oddzielenie przez filtrację

2. Dodanie do przesączu kolejnej porcji precypitatu, doprowadzając do wytrącenia pożądanego białka, oddzielenie przez filtrację

Krystalizacja:

• Stosowana do oczyszczania związków o małej masie cząsteczkowej np. kwasów organicznych, aminokwasów, antybiotyków(?)

• Polega na wytracaniu związków przez chłodzenie bądź odparowanie

• Etapy:

- powstawanie zarodków

- wzrost kryształów

Od wzajemnej szybkości tych dwóch etapów zależy wielkość i ilość powstałych kryształów.

Metody utrwalania enzymów:

• Utrwalanie/przedłużanie trwałości to przede wszystkim ograniczenie ilości wody

• Odwadnianie ze względów ekonomicznych należy prowadzić dwuetapowo:

1. Usuwanie wody bez zmian jej stanu fizycznego (np. wirowanie, filtracja, strącanie)

2. Przemiana fazowa wody zawartej w materiale biologicznym (zagęszczanie, suszenie, wymrażanie)

• Stabilizacja aktywności katalitycznej enzymów:

1. Zastąpienie wody bardziej polarnymi cząsteczkami, np. glicerolem, glikolem polietylenowym

2. Dodatek związków redukujących wiązania dwusiarczkowe np. merkaptoetanol

3. Dodatek związków chelatujących np. EDTA

Modyfikacja i standaryzacja aktywności katalitycznej enzymów:

• Usuwanie wody bez zmian jej stanu fizycznego np. wirowanie, filtracja, strącanie

• Przemiana fazowa wody zawartej w materiale biologicznym – zagęszczanie, suszenie, wymrażanie

odwodnienie ze względów ekonomicznych należy prowadzić dwuetapowo?

Wykład 7:

Formy preparatów enzymatycznych:

Preparaty ciekłe – roztwory o różnym stopniu zatężenia 9ultafiltracja, wyparki próżniowe)

Formy preparatów enzymatycznych:

• Unieruchomienie całej komórki

• Unieruchomione enzymy

Niekwestionowane zalety enzymów jako katalizatorów reakcji chemicznych sprawiły, że znalazły one zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu. Istnieje jednak wiele problemów związanych z ich praktycznym wykorzystaniem

WADY:

Główna wadą enzymów jest ich wysoka cena – wiąże się ona przede wszystkim z dużymi kosztami związanymi z?? środowiska jakim żywa jest komórka. Enzymy są wrażliwe na zmiany warunków fizyko-chemicznych takich jak : temp, pH, czy obecność substancji pełniących rolę aktywatorów lub inhibitorów

Przez długi czas uważano również, że biokatalizatory mogą działać tylko w środowisku wodnym co oznacza ograniczony zakres ich stosowania

Wszystkie wyżej wymienione problemy udaje się przezwyciężyć dzięki opracowaniu metod immobilizacji enzymów

Immobilizacja – możliwość wielokrotnego użycia enzymu – niezależnie od rozwiązań technicznych, które to umożliwiają

Należy unikać eksperymentalnych warunków (tj. ekstre. pH, duże stężenie reagentów, wysoko temp, obecność rozpuszczalników organicznych ważne aby procedura immobilizacji nie wpływała na biologiczną aktywność enzymu (komórki).

Procesy immobilizacji in vivo:

• Naturalne nośniki i matryce

• Struktury subkomórkowe

• Kompartymentacja

Badania wykazały, że:

• Proces immobilizacji pozytywnie wpływa na stabilizowanie struktury białek, co przejawia się w zwiększeniu ich stabilności termicznej i odporności na działanie chemiczne czynników denaturujących

• Immobilizacja enzymów pozwoliła również na zastosowanie ich w środowisku rozpuszczalników organicznych, gdzie białka w formie rozpuszczalnej szybko traciły aktywność katalityczną

• Z technologicznego punktu widzenia, unieruchomienie biokatalizatora

Nie wiem gdzie to ma być ale tego nie masz :P

1. (…) się czysty produkt (pozbawiony enzymu), zaś katalizator można wykorzystać w kolejnej reakcji

• Zastosowanie reaktora przepływowego z immobilizowanym enzymem stwarza możliwość pracy w systemie ciągłym. Ponieważ wydajność reakcji katalizowanej enzymatycznie uzależnione jest zarówno od stężenia substancji jak i produktów reakcji, które często są też inhibitorami enzymu, ciągłe dostarczanie substancji i odbieranie produktu powoduje zwiększenie efektywności procesu biokatalizy.

1. (…)

• Preparaty pojedyncze enzymów katalizujących proste reakcji biochemiczne np. hydrolize, kondensację, czy izomeryzację

• Struktury subkomórkowe (organelle z zachowaną aktywnością do przeprowadzenia określonych procesów często wieloetapowych

• Całe komórki bez zachowania ich funkcji życiowej, często ze wstępną obróbką pozwalającą na zwiększenie transportu substratów i produktów przez błonę komórkową

Typy biokatalizatorów unieruchomionych:

• Kompleksy 2 lub większe ilości enzymów, umożliwiające prowadzenie reakcji bardziej złożonych, np. utleniania połączonego z regeneracją kofaktorów

• Żywe komórki z zachowaniem i wykorzystaniem ich aktywności metabolicznej, często również zdolności do rozmnazania

• Całe komórki bez zachowania ich funkcji życiowej, często ze wstępną obróbką pozwalającą na zwiększenie transportu substratów i produktów przez błonę komórkową

Obecnie jest kilka klasyfikacji metod unieruchamiania

Najpopularniejsza z nich wyróżnia:

• Unieruchamianie na powierzchni nośnika

• Unieruchomienie bez nośnika

• Unieruchomienie wewnątrz nośnika

Metody immobilizacji enzymów:

1. Metody fizyczne:

• Adsorpcja na nierozpuszczalnych nośnikach

• Inkluzja w sieci polimerowej

• Mikrokapsułkowanie

1. Metody chemiczne

• Kowalencyjne wiązanie z nośnikami rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi w wodzie.

Adsorpcja na nośnikach:

• Metoda najczęściej stosowana

• Mechanizm polega na wytworzeniu wiązań chemicznych między centrami aktywnymi enzymu (lub składników ściany komórkowej) a nośnikiem

• Nośniki rozpuszczalne i nierozpuszczalne w wodzie: dekstran, glikole polietylenowe, skrobie, celuloza, agaroza.

Usieciowanie enzymów:

• Działając na enzymy 2 lub wielofunkcyjnymi odczynnikami uzyskuje się zżelowane precypitaty

• Pecypitaty charakteryzują się obniżoną stabilnością i aktywnością.

Kopolimeryzacja = inkluzja w żelu

• Metoda polega na modyfikacji chemicznej enzymu za pomocą substancji mających podwójne wiązania, a następnie polimeryzacji lub kopolimeryzacji z monomerami jedno lub dwufunkcyjnymi

• Właściwości mechaniczne oraz aktywność utworzonego nośnika można regulować warunkami polimeryzacji

• Enzymy immobilizowane tą metodą zachwują 30-70% aktywności.

Adsorpcja na nierozpuszczalnych nośnikach:

• Metoda prosta, łagodne warunki immobilizowania, możliwość wielokrotnego użycia adsorbentu

• Enzym może być związany wiązaniami jonowymi, wodorowymi, hydrofobowymi lub Van der Waalsa

• Duża pojemność nośników

• Enzymy zachowują 60-100% aktywności

Mikrokapsułkowanie:

• Wodny roztwór enzymu jest indukowany w mikrokapsułkach z półprzepuszczalnych syntetycznych membran, przez które łatwo dyfundują małocząsteczkowe związki (substraty i produkty)

• Wypełniacze – utrzymują kulisty kształt mikrokapsułek i stabilizują enzym przy wysokich wartościach pH ( 10% roztwory hemoglobiny, albuminy żelatyny i polietylenoiminy.

Inkluzja w żelu – pułapkowanie:

• Zamykanie komórek/enzymów w matrycy polimeru

• Metoda polega na tworzeniu sieci polimerowej w obecności enzymów lub całych komórek

• Polimery:

- alginiany

- agar

- pektyna

- żywice

- epokrylowe,

- poliakrylamidy

Matryce do unieruchamiania enzymów

W przypadku klasyfikacji metod immobilizacji ważny jest wybór złoża do unieruchamiania enzymu.

Cechy nośnika:

• Powinien być nierozpuszczalny w środowisku, w którym prowadzona jest reakcja katalizy enzymatycznej (zwykle jest to roztwór wodny)

• Musi charakteryzować się duża zdolnością wiązania enzymu, która (…)

• Nośnik powinien być ponadto odporny na degradację chemiczną i mikrobiologiczną oraz nietoksyczny

• (…) bo zwiększenia ilości tych grup (aktywacja nośnika), o pojemności złoża decyduje również jego porowatość i kontakt cząsteczek.

• O przydatności złoża decyduje też jego właściwości mechaniczne cena oraz dostępność.

Podstawowym parametrem technologicznym jest stabilność operacyjna, która określa czas pracy, po którym zachodzi utrata połowy początkowej aktywności biokatalizatora

W czasie procesu technologicznego immobilizacji biokatalizator stopniowo traci swoją produktywność, co spowodowane jest:

• Wymywaniem enzymu ze złoża oraz rozpuszczaniem się lub ścieraniem matrycy

• Zanieczyszczenia mikrobiologiczne

• Pogarszanie się warunków kontaktu substratu z enzymem na skutek zanieczyszczeń i zatkanie się porów złożę lub mechanicznego zyniatenia matrycy

• Utratą aktywności na skutek zatruwania lub denaturacji enzymu

Pułapkowanie:

• Chitozan

• Alginian

• Karagen

• Kolagen

• Poliakrylamid

• Agaroza

Chitozan – wytwarza się na drodze deacetylacji chityny, składnika budulcowego m.in. pancerzy skorupiaków morskich (…), które są odpadami przemysłu spożywczego (…)

Ma on unikalne właściwości:

• Jest hydrofilowy

• Wykazuje duże powinowactwo do białek

• Posiada też szereg grup funkcyjnych, aminowych i hydroksylowych, podatnych na modyfikacje chemiczne prowadzące do utworzenia wiązań kowalencyjnych z enzymem

• Jest nietoksyczny

• Wykazuje właściwości antybakteryjne

• Jest mało podatny na degradację mikrobiologiczną

Kwas alginowy – naturalnie występujący polisacharyd, (…)

Ilość kwasu alginowego w różnych gatunkach brunatnic jest różna i często wskazuje dość znaczne wahania sezonowe.

W najprostszy sposób można otrzymać poprzez macerację (…)

Jest to liniowy kopolimer kwasu D-mannurowego i L- guluronowego. Cząsteczki te są połączone wiązaniem β-1,4 glikozydowym (…)

Alginiany znajdują szereg zastosowań:

• W przemyśle papierniczym, szczególnie przy fabrykacji kartonu i tektury

• W przemyśle włókienniczym do apertury tkanin (zmiękczania)

• W przemyśle farbiarskim do wyrobu farb poligraficznych

• W przemyśle farmaceutycznych

• Jako lepiszcze używane są do produkcji (…)

W przemyśle kosmetycznym często używany jest alginian sodu, jest on bezbarwny i bezwonny (…)

Rozmiary porów w takich kulkach żelu zależą od stężenia alginianiu (…)

Karagen:

W jego skład wchodzą przede wszystkim karagenina, a także inne polisacharydy i niewielki ilości jodu i bromu, karagen odznacza się dużą aktywnością biologiczną (…)

Kolagen:

• Stanowi główny składnik organizmów ssaków

• Główne białko tkanki łącznej

• Białko odporne na rozciąganie

• Pozyskiwanie – ścięgna

Agaroza:

• Polisacharyd – polimer pochodnych galaktozy

• Otrzymywany przez oczyszczenie z agaru jadalnego

• Agaroza jest łatwo rozpuszczalna w wodzie, w temperaturze (…)

Poliakrylamid:

• Polimer z grupy poliakrylanów otrzymywany przez polimeryzację akrylamidu

• Jest masowo wykorzystywany do produkcji żelu wykorzystywanego jako podkład do elektroforezy, żel powstaje poprzez spontaniczne sieciowanie w wyniku reakcji grup aminowych z karbonylowymi, reakcja jest przeprowadzana w wodzie

• Hydrożele z poliakrylamidu (…)

Unieruchamianie całych komórek:

Immobilizacją drobnoustrojów można określić zespół metod, które ograniczają całkowicie lub częściowo (…)

Należy zaznaczyć, że unieruchomione enzymy i ich przemysłowe użycie (...)

Komórki zwierzęce, zarodki roślin i zwierząt w alginianie

Metody unieruchamiania drobnoustrojów

Wśród wielu znanych technik (…)

Wiązanie w matrycy nośnika – pułapkowanie

Zalety procesów z użyciem komórek immobilizowanych:

• Ułatwione prowadzenie procesów ciągłych oraz ich automatyzacji i kontroli

• Możliwość wielokrotnego użycia komórek

• Tworzenie zazwyczaj mniejszej ilości produktów ubocznych

• Większa specyficzność reakcji enzymatycznych oraz stabilność komórek

• Łatwiejsze oddzielenie końcowego produktu od biomasy

• Większa wydajność z jednostki objętości bioreaktora

• Zmniejszenie objętości użytkowej bioreaktorów i obniżenie kosztów instalacji

• Korzystniejsze warunki (…)

Wady procesów z użyciem komórek immobilizowanych:

• Brak wystarczającej wiedzy na temat ewentualnych zakłóceń funkcji metabolicznych komórki immobilizowanej

• Trudność z matematycznym modelowaniem procesów

• Ograniczenia dyfuzyjne i w związku z tym trudności w przenikaniu substratu i produktu reakcji enzymatycznej

• Częściowe wymywanie komórek ze złoża

• Straty aktywności (…)

W niektórych przypadkach celowe jest wykorzystanie w procesach technologicznych koimmobilizatów

Koimmobilizacja – jednoczesne wiązanie (unieruchamianie) enzymów i komórek drobnoustrojów

Np. (…)

1. Jest to naturalny polimer składający się z cząsteczek glukozamin połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi. [?]

2. Dzięki tym właściwością łatwo można go formować w różne kształty, kulki, włókna, kapsułki, membrany i inne. Najczęściej spotykane kuleczki chitozerowe charakteryzują się znaczną porowatością. (…) ulega również precypitacji w roztworach o wysokim pH. (…)silnie naładowany dodatni i może toczyć nierozpuszczalnie w ? ? ? ?

3. (jako skład ściany komórkowej)

4. Produkt produkcji jego i jego pochodnych z roku na rok wzrasta. W ostatnich latach szacowano ją na 200 000 ton rocznie. Świadczy to wyraźnie o ogromnym zapotrzebowaniu(…)

5. (…) β-1,4-glikozydowym kolejność i długość bloków możę być rożna. Możliwe są również wystąpienia pojedynczych cząsteczek zamiast całych bloków.

6. (…)

• Uzywany jest jako środek żelujący, zarówno w produktach spożywczych (dżem, galaretki, soki) jak i kosmetykach (żele pod prysznic, szampony, pasty do zębów mydła)

• Przemyśle spożywczym ; kwas alginowy[?] jest zarejestrowany jako dodatek do żywności pod numerem E400

1. Rozpuszczalne sole metali alkaicznych można przekształcać(…)

2. (…) i do rodzaju dodatków

3. Surowcem do produkcji kolagenu[?] jest [?] kędzierzawa, krasnorost określany potocznie jako mech irlandzki ( chondrus crispus) symbol E400

4. Pozyskiwanie – ścięgna; białko odporne na rozciąganie; głównie białko tkanki łącznej; stanowi powszechny składnik organizmu ssaków.

5. Zel agarowy wykorzystuje się tez do unieruchomienia enzymów zmodyfikowanych chemicznie, agaroza służy jako podłożę w chromatografii powinowactwa (…)

6. ?-akrylamid- jest silną rentotoksyną wchłanianą przez skóre. W związku z tych produkcja żeli polia(…); wymaga stosowanie ścisłych zasad BHP. Właściwości wykresie żele poliakrylamidowe; są bez w użyciu

Hydrożele z poliakrylamiduoprócz zastosowania w elektroforezie są także stosowane jako zagęstnik; przemysł kosmetyczny oraz produkcja okładów(…)

1. (…) całkowicie lub częściowo swobodę ich poruszania się na podłożu stałym czy też wewnątrz specyficznych struktur.

2. Zasadniczym trudnościami są miary metabolizmu na poziomie(…)

3. (…)unieruchomienia bez udziału nośnika [?]

4. (…)

• Wra żliwe jest wpływaniem na metabolizm i przepuszczalność błon

• Możliwe jest związanie gęstości biokatalizatora, a tym samym mniejszyć objętość użytkową stosowanego reaktora

• Produkty nie są zanieczyszczone białkami pochodzącymi z lizy komórek

• Istotne skrócenie czasu trwałości fermentacji wtórnej win musujących oraz procesu dojrzewania i stabilizacji win

• Wyższa reaktywność stabilność enzymów wewnątrzkomórkowych

• Podwyższenie ekonomiki procesu

• Korzystniejsze warunki przenikania tlenu z fazy gazowej do wodnej

1. (…)

• ciągłe poszukiwanie optymalnych i uniwersalnych nośników o dobrej wytrwałości mechanicznej, neutralnych w stosunku do środowiska procesu technologicznego i innych korzystnych właściwości

• bule wystarcających info dotyczących fizjologii drobnoustrojów unieruchomionych

• straty aktywności stabilności komórek oraz reakcji enzymu, wraz z upływem norm

1. prowadzenie procesów ciągłych z komórek immobilizowanych lub koimmobilizowanych wymaga odpowiednich bioreaktorów które zapewniają m. in. Jak najmniejsze straty aktywnych komórek podar[?] odprowadzenie strumienie z górnej(…)