Ćwiczenie 3

- Regulaminy pracowni i laboratoriów
mikrobiologicznych

-

Podstawowe wiadomości z zakresu aseptyki i

antyseptyki

REGULAMIN PRACOWNI

MIKROBIOLOGICZNEJ

1.

Przed rozpoczęciem pracy należy włożyć fartuch ochronny.

2.

Zabezpieczyć ewentualne skaleczenia na rękach.

3.

Powierzchnię stołu do posiewów przetrzeć środkiem dezynfekcyjnym.

4.

W czasie wykonywania posiewów i po ich wykonaniu należy starannie

opalać ezę.

5.

Probówki z posiewami ustawiać w statywach.

6.

Jeżeli w czasie posiewu powierzchnia stołu została przypadkowo

zanieczyszczona, to trzeba ją natychmiast przetrzeć środkiem

dezynfekcyjnym.

7.

Zużyte pipety, szkiełka podstawowe i nakrywkowe wrzucać do dzbanków

z płynem dezynfekcyjnym.

8.

Szczególnej ostrożności wymagają posiewy hodowli grzybów, wykonać je

należy ostrożnie, przy pobieraniu materiału z grzybni silnie

zarodnikującej należy ezę zanurzyć uprzednio w płynie, by zapobiec

unoszeniu się zarodników.

9.

W pracowni mikrobiologicznej nie wolno jeść, pić ani palić.

10.

Po zakończonej pracy stół należy przetrzeć środkami dezynfekcyjnymi a

materiał ćwiczeniowy złożyć we wskazane pojemniki.

11.

Ręce po każdej serii badań z drobnoustrojami powinny być

starannie umyte.

12.

Nie wynosić z sali ćwiczeń hodowli, preparatów, odczynników i  szkła

laboratoryjnego.

13.

Każdy wypadek przy pracy z materiałem zakaźnym należy zgłosić

prowadzącemu zajęcia.

Co to jest ASEPTYKA?

Jest to sposób postępowania mający na celu niedopuszczenie
do zakażenia miejsc, płynów lub przedmiotów jałowych.

Np.: w kolbie mamy jałowy bulion (pozbawiony jakichkolwiek
form drobnoustrojów), trzeba rozlać go do 5 probówek tak,
aby był jałowy po rozlaniu, w tym celu stosujemy jałowe
szkło, opalamy wylot kolby i probówki, pipetę.

Postępujemy aseptycznie.

Co to jest ANTYSEPTYKA?

Jest to działanie polegające na niszczeniu
drobnoustrojów

poprzez

stosowanie

środków

chemicznych, mechanicznych, fizycznych

np.: odkażanie, wyjaławianie.

Co to jest DEKONTAMINACJA ?

To proces prowadzący do usunięcia lub zniszczenia drobnoustroju.
Należą tu zatem:

-Sanityzacja

-Dezynfekcja

-Sterylizacja

SANITYZACJA – to usuwanie widocznych zabrudzeń i
zanieczyszczeń a wraz z nimi większość drobnoustrojów
(poprzez mycie, odkurzanie, malowanie).

Na czym polega DEZYNFEKCJA (odkażanie) ?

Jest

to

zespół

czynności

zmierzających

do

unieszkodliwienia form wegetatywnych drobnoustrojów
chorobotwórczych i niechorobotwórczych, znajdujących się w
środowisku zewnętrznym za pomocą czynników chemicznych
i fizycznych.

Dezynfekcja nie niszczy form przetrwalnikowych i
wirusów!

Na czy polega WYJAŁAWIANIE –
STERYLIZACJA ?

Polega

na

niszczeniu

form

wegetatywnych

i

przetrwalnikowych drobnoustrojów. Wykorzystuje się do
osiągnięcia jałowości metody fizyczne, mechaniczne.

Ogólnie sterylizację dzieli się na zimną i cieplną.

WYSOKOTEMPERATUROWA

1.

Sterylizacja cieplna sucha

2.

Pod ciśnieniem w parze nasyconej

3.

Promieniowanie ultrafioletowe (UV)

4.

Promieniowanie jonizujące gamma

NISKOTEMPERATUROWA (mechaniczna, fizyczna,

chemiczna)

1.

Mechaniczna – filtracja

2.

Gazowa - tlenek etylenu

3.

Formaldehydowa, plazmowa, kwasem nadoctowym,
nadtlenkiem wodoru (oksydacja), ozonem, radiacyjna

PODZIAŁ I RODZAJE STERYLIZACJI

STERYLIZACJA CIEPLNA SUCHA

WYSOKOTEMPERATUROWA :

Wyróżniamy:



wyżarzanie (rysunek) – wykonuje się nad

płomieniem

palnika

(sterylizacja

drucików

platynowych, ez, igieł preparacyjnych, skalpeli,

itp.)



opalanie (rysunek) – sterylizacja przedmiotów nie

ulegających spalaniu w płomieniu (eza, brzeg

probówki po wyjęciu korka, aby hodowla nie

uległa

zakażeniu

obcymi

drobnoustrojami

pochodzącymi z kurzu na probówce lub z

powierza)



działanie suchym gorącym powietrzem – np. w

suszarkach; szkło laboratoryjne, ostre narzędzia,

igły chirurgiczne, materiały owinięte w papier,

woski, parafinę, gazę (materiał musi być ułożony

luźno, tak , aby dostęp gorącego powietrza był

jednakowy do wszystkich pakietów, kolb itd.). Czas

ekspozycji jest długi, ale uzależniony od

temperatury – im wyższa temperatura, tym

krótszy czas ekspozycji)

WYJAŁAWIANIE

POD CIŚNIENIEM W PARZE NASYCONEJ



Wyjaławianie to przeprowadza się w autoklawach - są to
urządzenia zbudowane w specjalny sposób zapewniający
możliwość podwyższania ciśnienia do kilku atmosfer z
jednoczesnym podnoszeniem temperatury (para przegrzana).
Ciśnienie o wartości 1 atm. osiągane jest przy temp. 100

o

C,

podwyższenie tego ciśnienia wewnątrz komory roboczej do 1,5
atm. daje temp. 112

o

C (2 atm - 121

o

C, 3 atm - 134

o

C)



Przetrwalniki laseczek tlenowych i beztlenowych np. Bacillus
subtilis, Clostridium perfringens ulegają zniszczeniu przy
ciśnieniu 1 atm. i 100

o

C w ciągu 5,5h ale już w 112

o

C i 1,5 atm

w ciągu 30 minut, 120

o

C i 2 atm - 8 min, 134

o

C i 3 atm - 10 sek.



W laboratorium mikrobiologicznym w ten sposób wyjaławia
się pożywki, różnego rodzaju płyny, jak również
autoklawuje się hodowle drobnoustrojów w celu ich zabicia
(np. autoklawowana grzybnia może służyć jako pożywka
przy produkcji enzymów drobnoustrojowych).



Ustalono, że najbardziej optymalnymi warunkami
sterylizacji podłóż mikrobiologicznych jest temp. 118-
121

o

C i ciśnienie 1,8 - 2 atm.



Aparat Kocha - to urządzenie, w którym można
przeprowadzić tzw. dezynfekcję fizyczną, gdyż otrzymuje
się w nim temp. 100

o

C. Aparat ten stosowany jest

najczęściej do niszczenia starych hodowli bakteryjnych.

PASTERYZACJA

W przetwórstwie mleczarskim stosuje się ten proces, który
polega na podgrzewaniu mleka do 62

o

C przez 30 min., po

tym czasie następuje szybkie schłodzenie. Efektem
pasteryzacji jest zniszczenie form wegetatywnych,
saprofitycznych i bakterii chorobotwórczych.

Nie można takiego produktu uznać za jałowy.

Możemy wyróżnić:



pasteryzację długą – 62

o

C przez 30 min.



pasteryzację krótką – 71 – 72

o

C przez 15 – 16 sek.

TYNDALIZACJA

(sterylizacja bieżącą parą wodną- sterylizacja

wysokotemperaturowa)

Produkty, których nie można poddawać temperaturze

wyższej niż 100

o

C można także sterylizować metodą

tyndalizacji. Jest to sterylizowanie w 62

o

C przez 30 min.

przez 3 kolejne dni /trzykrotna pasteryzacja/.

Zasada:



W pierwszym dniu zostają zabite formy wegetatywne

drobnoustrojów. Jednocześnie podwyższona temperatura i

wilgotność pobudza formy przetrwalnikowe do przejścia w

wegetatywne, które zostają zabite drugiego dnia. Trzecie

powtórzenie procesu daje gwarancję dokładności

sterylizacji.

PROCES UHT

(Ultra High Temperature)



wstępna pasteryzacja 95

o

C przez 3 sek.



schłodzenie



sterylizacja 130

o

C przez 4 sek.

WYJAŁAWIANIE:

PROMIENIOWANIE ULTRAFIOLETOWE

(PROMIENIE UV)

Polega ono na hamującym lub niszczącym działaniu nadfioletowej
części widma słonecznego na drobnoustroje. Najsilniej bójczo
działają promienie UV o długości fali 230 - 290 nm. Pod wpływem
promieni UV zachodzą zmiany w strukturze białek, powodując
unieczynnienie enzymów, surowic i toksyn.

Na skuteczność wyjaławiania promieniami UV mają wpływ
następujące czynniki:



stopień

zanieczyszczenia

powietrza

cząstkami

mechanicznymi



długość fali promieni emitowanych przez lampy



czas napromieniowania



wilgotność powietrza



właściwości indywidualne poszczególnych drobnoustrojów

WYJAŁAWIANIE:

PROMIENIOWANIE JONIZUJĄCE - GAMMA

Niszczy ono struktury RNA i DNA. Wymaga specjalistycznej
aparatury. Stosowane w przemyśle - sterylizacja konserw i
płynów.

NISKOTEMPERATUROWA

STERYLIZACJA MECHANICZNA - FILTRACJA

Metodę tę stosuje się do podłoży płynnych, które pod

wpływem temperatury zmieniają właściwości fizyczne lub

chemiczne (surowica krwi, mocznik, kwaśny węglan sodu).

Metoda filtracji polega na mechanicznym zatrzymaniu

drobnoustrojów na filtrze, którego pory są mniejsze od

średnicy drobnoustrojów.

Obecnie używa się:



filtrów porcelanowych /Chamberlanda/



filtrów azbestowych /Seitza/



filtrów szklanych /Schotta/



filtrów membranowych

STERYLIZACJA GAZOWA –

TLENEK ETYLENU

W metodzie tej drobnoustroje są niszczone w wyniku
alkalizacji białek, DNA i RNA.
Najnowszą technologią jest zastosowanie 100% tlenku
etylenu, w której kolejne etapy to:



Wytworzenie podciśnienia w komorze, ogrzewanie do 37oC
lub 55oC



Nawilżanie parą wodną, ekspozycja w podciśnieniu na 100%
tlenek etylenu



Opróżnienie komory z tlenku, wypełnienie sterylnym
powietrzem



Degazacja wstępna 0,5-3 godzin, dalsza 12h w 50oC lub 7 dni
w temp. pokojowej