Enzymologia-5

Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych

Najważniejsze metody badania mechanizmów reakcji

1. Określanie struktury enzymu
2. Modyfikacja chemiczna enzymu
3. Ukierunkowana mutageneza genu kodującego enzym
4. Detekcja intermediatów reakcji enzymatycznej
5. Badanie kinetyki reakcji enzymatycznej

Zastosowanie badań strukturalnych do określania
mechanizmów reakcji

Metody: niskotemperaturowa rentgenografia strukturalna, NMR

Szczególne znaczenie – określanie struktury kompleksu enzymu
z analogiem substratu lub analogiem stanu przejściowego

Struktura kompleksu
hydroksymetylotransferazy
serynowej z adduktem
substratu z koenzymem
oraz analogiem drugiego
substratu

Reakcja katalizowana
przez karbamoilotransferazę
asparaginianową

Analog stanu przejściowego

C

O

O

_

_

N

CH

CH

2

C

O

O

P

O

O

O

O

C

NH

2

O

-

_

H

N-fosfonoacetylo-L-asparaginian (PALA)

L-asparaginian

Karbamylofosforan

C

O

O

_

_

H

2

N

CH

CH

2

C

O

O

P

O

O

O

O

C

O

NH

2

_

P

O

C

O

O

C

O

N

CH

CH

2

C

O

O

C

O

O

H

2

H

_

_

_

Stan przejściowy

Struktura kompleksu karbamoilotransferazy asparaginianowej z PALA

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU

Działanie na enzym związkiem chemicznym powodującym inaktywację

Dwa podejścia:

- odczynniki specyficzne wobec grup funkcyjnych określonych reszt
aminokwasowych;

- analogi substratu lub stanu przejściowego reakcji enzymatycznej
zawierające reaktywne ugrupowania chemiczne (ang. affinity labeling)

Cechy odczynnika modyfikującego:

• selektywne zablokowanie określonej grupy funkcyjnej

• charakter lokalny zmiany

• ograniczenie zawady przestrzennej

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU

Pojęcie reszty istotnej dla aktywności enzymu

- modyfikacja chemiczna reszty powoduje całkowitą utratę aktywności przez
enzym;

- stechiometria inaktywacji 1 : 1;

- substrat lub inhibitor kompetytywny chronią enzym przed inaktywacją

Kinetyka inaktywacji enzymu

ln[E

a

]

t

/

[E

a

]

o

t

[I

o

]

[I] >
[I

o

]

[I] <
[I

o

]

k

obs

[I]

tg =

k

1

B. Reakcja jednoetapowa, rząd reakcji n  1

E + n I

 



1

k

E-nI

k

obs

= k

1

[I]

n

wykres k

obs

= f([I]) nie jest linią prostą; wyznaczanie rzędowości

reakcji z wykresu:

log k

obs

= n log [I] + log k

1

k

obs

[I
]

C . R e a k c j a d w u e t a p o w a

v = k

2

[ E  I ] ; K

i n a k t

=

1

1

k

k



w s t a n i e r ó w n o w a g i , g d y k

2

  k

- 1

, t o :

k

o b s

=

1

1

2

1

]

[

]

[



 k

I

k

I

k

k

w y k r e s k

o b s

= f ( [ I ] ) j e s t h i p e r b o l ą .

N a t o m i a s t :

obs

k

1

=

]

[

1

I

2

k

K

inakt

+

2

1

k

,

c z y l i w y k r e s :

obs

k

1

= f (

]

[

1

I

) j e s t p r o s t o l i n i o w y .

A l t e r n a t y w n i e , w p r o w a d z a j ą c :  = l n 2 / k

o b s

o r a z T = l n 2 / k

2

,

o t r z y m u j e m y :

 =

]

[

1

I

T K

i n a k t

+ T ,

c z y l i w y k r e s  = f (

]

[

1

I

) j e s t p r o s t o l i n i o w y .

Z p r o s t o l i n i o w y c h w y k r e s ó w m o ż n a w y z n a c z y ć w a r t o ś c i : K

i n a k t

,

k

2

o r a z T .

k

1

k

-1

E + I

E  I

 



2

k

E - I

Odczynniki reagujące specyficznie z łańcuchami bocznymi niektórych

reszt aminokwasowych.

E

SH +

I CH

2

C

O

NH

2

CH

2

C

O

NH

2

S

E

E

SH +

N

O

O

CH

2

CH

3

E

S

N

O

O

CH

2

CH

3

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU

 

Odczynniki ukierunkowane na reszty cysteinylowe

 
A. -halogenooctany i -halogenoacetamidy

 

Warunki: pH

 7; labilne w roztworach wodnych; reaktywność I>Br>>Cl;

dla jodopochodnych rekcję należy prowadzić w ciemności
 
B. N-podstawione imidy kwasu maleinowego

Warunki: pH

 7; możliwość śledzenia zaniku absorpcji przy  = 302 nm;

dla NEM

 = 620 M

-1

cm

-1

 

 

E

SH +

E

S

N

C

E

S

COO

S

NO

2

-

OOC

O

2

N

S C N

-

E

SH +

-

OOC

O

2

N

S

-

COO

NO

2

S

E

S

COO

S

NO

2

-

+

COO

S

NO

2

-

-

pH>7

C. Kwas 2-nitro-5-tiocyjanobenzoesowy

Warunki: pH = 8.0; niezbyt duże nadmiary molowe odczynnika (1,5

 do 2 );

dla wytworzonej S-cyjanopochodnej



max

= 330 nm,

 = 7500 M

-1

cm

-1

 
D. Odczynnik Ellmana – kwas 5,5’-ditiobis(5-nitrobenzoesowy)
Używany do ilościowego oznaczania grup tiolowych.

E

CH

2

OH

+

CH

2

FSO

2

E

CH

2

O

CH

2

SO

2

OH

-

E

CH

2

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU

 Odczynnik ukierunkowany na reszty serylowe
 

 Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU

 Odczynniki ukierunkowane na reszty lizylowe
 
 

A. Imidoestry

Warunki: długie czasy reakcji

 
 

B. Kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy

Warunki: Barwny produkt podstawienia;



max

= 420 nm,



= 20 000 M

-1

cm

-1

 
 
 
 

E

(CH

2

)

4

NH

2

+

N

C

NH

2

+

OCH

3

E

(CH

2

)

4

NH

N

C

+

H

2

N

+

E

(CH

2

)

4

NH

2

O

2

N

SO

3

O

2

N

NO

2

2

-

E

(CH

2

)

4

NH

O

2

N

O

2

N

NO

2

C. Fosforan pirydoksalu
 

Warunki: najwyższa selektywność; wytworzenie trwałego wiązania dopiero
w wyniku redukcji zasady Schiffa; reakcję należy prowadzić w ciemności;
cyjanoborowodorek preferowany wobec borowodorku bo można prowadzić
reakcję w roztworze wodnym (uwaga: tylko w pH >7!)

+

E

(CH

2

)

4

NH

2

N

O

3

POCH

2

C

OH

CH

3

H O

2

-

E

(CH

2

)

4

N

N

O

3

POCH

2

C

OH

CH

3

H

+

H

E

(CH

2

)

4

N

N

O

3

POCH

2

C

OH

CH

3

H

H

NaBH

4

lub NaBH

3

CN

pH 7 - 8,5

2

2

-

-

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU
 

Odczynniki ukierunkowane na reszty histydylowe
 

A. Dietylopirowęglan
 
 

Warunki: odczynnik specyficzny dla His w zakresie pH4,5 – 7; produkt modyfikacji
absorbuje w UV -



max

= 240 nm,

 = 3200 M

-1

cm

-1

; odczynnik nietrwały w roztworach

wodnych; w pH 7 czas połowicznego rozpadu = 10 min; im niższe pH tym większa
trwałość odczynnika

 
 

E

CH

2

N

N

H

C

O

EtO

O

C

O

OEt

+

H

E

CH

2

N

N

C

O

EtO

+ CO

2

+ EtOH

H

2

N OH

H

E

CH

2

N

N

+

N C

OEt

O

HO

H

B. Róż Bengalski – odczynnik fotoutleniający
 
 
 

Warunki: ograniczona specyficzność (możliwe utlenienie Cys, Met i Trp);
reakcję prowadzi się w temp 0 - 4

C naświetlając promieniowaniem w zakresie VIS

O

I

HO

I

I

I

Cl

Cl

Cl

Cl

C

O
O

O

- Na

+

E

CH

2

OH +

N

N

C

CH

3

O

E

CH

2

O

O

C

CH

3

N

N

H

pH 7,5

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU
 
Odczynniki ukierunkowane na reszty tyrozylowe
 
A. N-acetyloimidazol

Warunki: duże nadmiary odczynnika. Unikać buforu Tris. Reakcja dość wolna 

+

-

C(NO

2

)

3

E

CH

2

O

-

NO

2

pH 9

+

C(NO

2

)

4

E

CH

2

OH

B. Tetranitrometan

Warunki: można śledzić postęp reakcji przy

 = 350 nm,  = 14.400 M-1cm-1

(anion trinitrokarboniowy). Może zachodzić utlenienie cysteiny.

E CH

2

N

H

+

N

O

O

Br

E CH

2

N

O

H

pH 4 - 5

CH

2

Br

OH

O

2

N

CH

2

+

Br

-

OH

O

2

N

HO

NO

2

E

CH

2

N

E

CH

2

N

H

OH

O

2

N

S

+

Br

-

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU

 Odczynniki ukierunkowane na reszty tryptofanylowe
 

A. N-bromoimid kwasu bursztynowego

Warunki: reakcja w buforze octanowym; gwałtowny przebieg;
ograniczona specyficzność (ulegają też Tyr, Cys. Met)

B. Bromek 2-hydroksy-5-nitrobenzylu (BHNB)

Warunki: duże nadmiary odczynnika (nawet 100

);

reakcja w ciemności; odczynnik słabo rozpuszczalny
w wodzie

 

C. Sól dimetylosulfoniowa
BHNB

odczynnik rozpuszczalny
w wodzie

H

3

C CH

2

N C N CH

2

CH

2

CH

2

N

CH

3

CH

3

HCl

x

EDC

CMC

N

O

H

3

C

CH

2

CH

2

N C N

+

H

3

C

SO

3

2-

C

O

HN

NH

R

1

R

2

R

1

N C N

R

2

H

+

R

1

NH C N R

2

+

E

CO

2

R

2

R

1

NH C

N

E

O

C

O

H

2

O

CO

2

E

C

O

HN

NH

R

1

R

2

R

3

NH

2

HN

R

3

E

O
C

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU

Odczynniki ukierunkowane na reszty Glu i Asp
 
A. Rozpuszczalne w wodzie pochodne karbodiimidu

Schemat przebiegu reakcji

Warunki: reakcja specyficzna
w pH 4 – 6; duże nadmiary
odczynnika; jako aminę stosuje
się najczęściej ester metylowy
glicyny;
w kwaśnym pH konkurencyjna
reakcja hydrolizy jest bardzo
wolna.

Izomeraza fosfotriozowa

HIS95

N

+

H-N

Lys12

NH

3

+

Glu165

HIS95

N

N

Lys12

NH

3

+

Glu165

O

O

H

HIS95

N

+

H-N

Lys12

NH

3

+

Glu165

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU

C

CH

2

OH

CH

2

OPO

3

O

2

-

Substrat

2

-

C

CH

2

Br

CH

2

OPO

3

O

Reaktywny

analog substratu

Izomeraza fosfotriozowa

Mutageneza ukierunkowana

Mutageneza to proces prowadzący do powstania
mutacji, czyli dziedziczonej zmiany sekwencji
nukleotydowej DNA

Mutageneza

ukierunkowana

jest

techniką

umożliwiającą precyzyjne badanie białek:

• umożliwia zrozumienie, w jaki sposób białka
ulegają fałdowaniu

• jak rozpoznają inne cząsteczki, katalizują reakcje.

W przypadku ustalania aminokwasów biorących
udział w funkcji katalitycznej, czy regulacyjnej
enzymu jest to najlepsza metoda udowadniająca lub
obalająca udział konkretnych aminokwasów w
pełnieniu tych funkcji.

Zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszt
istotnych dla aktywności enzymu

Enzym syntaza GlcN-6-P

O

NH

3

OH

O

OH

O

3

PO

H

O

OH

CH

2

OH

O

OH

O

3

PO

H

+

+

H

3

N

O

O

-

O

NH

2

H

3

N

O

O

-

O

O

-

2-

2-

+

+

+

Struktura przestrzenna enzymu

Analiza porównawcza sekwencji syntazy GlcN-6-P z różnych źródeł
podstawą selekcji reszt do ukierunkowanej mutagenezy

Zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszt
istotnych dla aktywności enzymu

Enzym syntaza GlcN-6-P

Aktywność

glutaminazowa

Aktywność

izomerazowa

Aktywność syntazowa

Wersja

K

M (Gln)

(mM)

k

kat

(min

-1

) K

M (Fru-6-P)

(mM)

k

kat

(min

-1

)

K

M (Gln)

(mM)

K

M (Fru-6-P)

(mM)

k

kat

(min

-1

)

Natywna

C1A

D29N

D123N

K603R

K603L

H488F

0,43

-

8,7

0,58

0,38

0,40

0,45

12

0

11,8

8,9

12,3

12,1

11,4

1,40

1,38

1,48

2,1

5,1

14,2

1,57

89

95

88

65

72

32

1,2

0,43

-

8,2

0,60

0,39

0,42

0,42

1,41

1,54

1,42

2,4

6,8

13,1

1,54

930

0,05

850

720

780

420

10,5

Aktywność glutaminazowa: L-Gln + H

2

O  L-Glu + NH

3

Aktywność izomerazowa: Fru-6-P  Glu-6-P

Aktywność syntazowa: L-Gln + Fru-6-P  L-Glu + GlcN-6-

P

Detekcja intermediatów

Niektóre produkty przejściowe reakcji enzymatycznej są stosunkowo
stabilne (głębokie minimum energetyczne) – istnieje możliwość
detekcji metodami spektroskopowymi: spektrofluorymetria, NMR
niskotemperaturowy;

Początkowe etapy reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę

C O + H

2

N (CH

2

)

4

C

N (CH

2

)

4

H

+

NH

3

H

2

N (CH

2

)

4

+

C NH

2

H

NaBH

4

lub NaBH

3

CN

+

H

N (CH

2

)

4

C

H

H

Redukcja produktu przejściowego
w postaci zasady Schiffa prowadzi
do powstania stabilnego adduktu

Wyłapywanie intermediatów za pomocą reakcji chemicznej

Informacje dotyczące mechanizmu działania enzymu,
które można uzyskać z pomiarów kinetycznych

Eksperyment

Możliwe informacje

Określanie zmian szybkości reakcji
w zależności od stężenia substratu

Określanie zależności parametrów
kinetycznych od struktury
substratu

Inhibicja odwracalna

Określanie zależności aktywności
od zmian pH

Badania kinetyki stanu
nieustalonego

Wyznaczanie parametrów kinetycznych;
rozróżnianie mechanizmów reakcji
dwusubstratowych

Rozpoznanie czynników strukturalnych
odpowiedzialnych za wiązanie substratu

Informacje pomocne dla określenia struktury
centrum
aktywnego

Określenie pK

a

reszt istotnych dla katalizy

Wyznaczenie stałych szybkości etapów
reakcji:
detekcja kompleksów enzymu z substratem
i/lub produktami przejściowymi

Zależność aktywności enzymu od zmian struktury substratu

Papaina – proteinaza cysteinylowa

Badania specyficzności substratowej papainy wobec syntetycznych
oligopeptydów wykazały istnienie w centrum wiążącym substrat obecność
7 „subcentrów”
S

2

– specyficzne wobec L-Phe

S

1

’ – stereospecyficzne dla L-aminokwasów, z preferencją dla L-Leu i L-Trp

Tripeptyd Ala-Phe-Arg jest inhibitorem kompetytywnym enzymu

Czy tetrapeptyd Ala-Phe-Arg-Leu jest także inhibitorem?

Ala-Phe-Arg

Ala-Phe-Arg-Leu

Zależność zmian aktywności enzymu od pH

Analiza kształtu zależności v = f(pH) daje możliwość wyznaczenia
pK

a

reszt ulegających jonizacji, które są istotne dla aktywności enzymu

Krzywa dzwonowa

pH optimum = pK

a

reszty katalitycznej

Analiza zależności pK

a

reszt jonizujących od polarności rozpuszczalnika

pozwala na określenie stanu jonizacji reszty

-CO

2

H

-COO

-

+ H

+

W tym przypadku obniżenie polarności rozpuszczalnika jest niekorzystne dla dysocjacji.
pK

a

rośnie przy obniżaniu polarności.

-ImH

+

-Im + H

+

A jak w tym przypadku?

Schemat aparatury do pomiarów kinetycznych metodą
stopped flow

Kinetyka stanów nieustalonych

Kinetyka stanów nieustalonych

Warunki pomiaru:

- stężenia enzymu i substratu na porównywalnym

poziomie

- techniki pomiarowe umożliwiające określanie

niewielkich zmian
stężenia w krótkim czasie (ang. stopped flow)

E + NADH

k

1

k

-1

[E:NAD
H]

Przykład: reakcja wiązania NADH przez

dehydrogenazę mleczanową

. Pomiar zmian stężenia

NADH metodą spektrofluorymetryczną przez 16 ms; Stężenia początkowe enzymu i NADH
identyczne – 8 M.

Reakcja II rzędu, ale ponieważ [E] = [S], to połowiczny czas reakcji można
wyrazić wzorem:  = 1/k [S].

Z eksperymentu otrzymano  = 2 ms

k = 1/ [S] = 6,7  10

7

M

-1

s

-1

Ponieważ k

1

>> k

-1

, to k = k

1

Chymotrypsyna – triada katalityczna

Kinetyka hydrolizy octanu p-nitrofenylu przez chymotrypsynę

Faza I – tworzenie produktu przejściowego - acyloenzymu
Faza II – hydroliza produktu przejściowego

E

CH

2

OH + O

2

N

O C

O

CH

3

Faza I

CH

2

O C

O

CH

3

E

O

2

N

OH

+

H

2

O

CH

3

COOH

Faza II