Reakcje

enzymatyczne-

wprowadzenie

Enzym jako katalizator



Katalizatory reakcji chemicznych w układach biologicznych



Większość enzymów to białka (jest również kilka cząsteczek RNA

aktywnych katalitycznie)



Białka o masie cząsteczkowej pojedynczego łańcucha

polipeptydowego od 9 000 do 155 000



Zwiększają szybkość reakcji same nie ulegając zmianie



Katalizują reakcje przebiegające we względnie łagodnych

warunkach



Enzymy są wysoce specyficzne względem substratów



Aktywność enzymów może być regulowana

Mechanizm działania enzymów

Miejsce aktywne enzymu



Miejsce aktywne enzymu jest regionem, który wiąże
substrat i przemienia go w produkt



Istnieją dwa modele wyjaśniające oddziaływania enzym-
substrat :

Model „zamka i klucza” opracowany w 1890 r
przez Emila Fischera
oraz
Model „indukowanego dopasowania” opracowany

w 1958 r przez

Daniela Koshlanda, Jr

Model „klucza i zamka”



enzym, tzn. jego miejsce aktywne, musi być dopasowany

swoim kształtem do substratu by móc przekształcić go w

produkt.

Model indukowanego dopasowania ,

„ręki i rękawiczki”



mechanizm opierający się na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu

lub odpowiedniej grupy substratów i przekształceniu ich w produkty



enzym może zniekształcić substrat wymuszając w nim konformację

podobną do stanu przejściowego

enzym

substrat

enzym substrat

Enzym-substrat

Kompleks enzym-substrat



Przykład kompleksu enzym-substrat : cytochrom P-450 z kamforą jako

substratem

Miejsce aktywne enzymu



Miejsce aktywne enzymu to obszar
wiążący substraty



Miejsce to zawiera aminokwasy
biorące udział w tworzeniu i
zrywaniu wiązań- reszty
katalityczne enzymu



Miejsce aktywne to trójwymiarowa
szczelina utworzona przez grupy
pochodzące z różnych części
sekwencji aminokwasowej



Miejsce aktywne zajmuje
stosunkowo małą część całkowitej
objętości cząsteczki enzymu



W wiązaniu enzymów z substratami
bierze udział wiele słabych
oddziaływań (elektrostatyczne,
wiązania wodorowe, siły van der
Waalsa, interakcje hydrofobowe)

Struktura lizozymu z uwidocznionymi

resztami aminokwasów tworzących miejsce

aktywne

Wiązania wodorowe między enzymem i

substratem

Swoistość kierunku działania



Enzym katalizuje tylko jedną z termodynamicznie możliwych
reakcji jakim może podlegać substrat

Specyficzność substratowa



Przykładem specyficzności enzymów jest działanie proteaz serynowych



Trypsyna- hydrolizuje wiązanie przy Lys bądź Arg



Chymotrypsyna- hydrolizuje wiązanie przy aminokwasach

aromatycznych i hydrofobowych



Elastaza- hydrolizuje wiązanie przy aminokwasach o krótkich, nie

naładowanych łańcuchach bocznych



O specyficzności substratowej enzymów decydują właściwości i ułożenie

przestrzenne reszt aminokwasów w centrum aktywnym enzymu

trypsyna

chymotrypsyna

elastaza

Proteazy serynowe

Inne enzymy proteolityczne



Stopień specyficzności enzymów może
być różny



Subtilizyna- nie rozróżnia bocznych
łańcuchów aminokwasów przy
hydrolizowanym wiązaniu



Trypsyna- hydrolizuje tylko wiązania po
karboksylowej stronie Lys i Arg



Trombina- enzym biorący udział w
procesie krzepnięcia krwi hydrolizuje
wiązania peptydowe tylko między Arg i
Gly

Budowa enzymów

Enzym zbudowany jest z:



części białkowej



części niebiałkowej



Wiele enzymów do swego działania potrzebuje kofaktorów



Kofaktorami mogą być jony nieorganiczne np. Fe

2+

lub złożone

cząsteczki organiczne

nazywane koenzymami



Metal lub koenzym kowalencyjnie związany z enzymem nazywamy
grupą prostetyczną



Całość katalitycznie aktywnego enzymu nazywamy
holoenzymem



Białkowa część enzymu bez kofaktora to apoenzym

Holoenzym = Grupa prostetyczna + Apoenzym

Przykłady koenzymów, ich witaminowych

prekursorów i chorób wywoływanych ich

niedoborem

Struktura koenzymów NAD

+

i NADP

+



Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD

+

) oraz fosforan

dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP

+

) biorą udział w

reakcjach oksydoredukcyjnych (przenoszą elektrony)



Pierścień nikotynoamidowy może występować w formie zredukowanej lub

utlenionej

Enzym jako katalizator



Obniża energię aktywacji reakcji



Przyspiesza reakcje



Nie zmienia równowagi reakcji

Porównanie profili swobodnej energii

aktywacji Gibbsa

Reakcja niekatalizowana

Reakcja katalizowana

Przyspieszenie reakcji enzymatycznej

osiąga się przez:



Katalizę poprzez zbliżenie reagujących grup i cząsteczek



Katalizę poprzez odpowiednią deformację cząsteczki substratu



Katalizę poprzez utworzenie kowalencyjnych produktów

pośrednich w reakcji z enzymem lub koenzymem



Katalizę kwasowo-zasadową

Grupy nukleofilowe łańcuchów bocznych

polipeptydu

Dwa typy katalizy kowalencyjnej

Czynniki regulujące szybkość reakcji



Kinetyczne



Temperatura, pH, dyfuzja, kształt cząsteczek,

lepkość



Stężenie substratu



Obecność inhibitorów lub aktywatorów enzymów



Czynniki pośrednie (allosteryczne, sprzężenie

zwrotne, przemiana proenzymu w enzym)



Strukturalne



Połączenie enzymów z innymi strukturami



Regulowany transport przez błony



Szybkość odprowadzania produktów

Kinetyka reakcji enzymatycznych



Przebieg reakcji chemicznej charakteryzowany jest przez stałą
równowagi reakcji i stałą szybkości reakcji



Wszystkie reakcje odwracalne biegną do osiągnięcia stanu
równowagi, a stała równowagi nie mówi o tym, jak szybko ten stan
zostanie osiągnięty



Na proces katalizy enzymatycznej składa się szereg etapów
fizycznych i chemicznych

Model Michaelisa-Menten



Zauważono, że przy małych stężeniach substratu początkowa
szybkość reakcji V

0

jest wprost proporcjonalna do [S]



Przy dużych stężeniach substratu szybkość staje się niezależna od [S]



Zakłada istnienie kompleksu aktywnego Enzym-

Substrat

Stała Michaelisa-Menten



Równanie Michaelisa-Menten opisuje przedstawioną krzywą hiperboliczną



Została w nim zdefiniowana nowa stała- K

m

(stała Michaelisa)



Jest ona miarą stabilności kompleksu ES



Dla wielu enzymów k

2

jest znacznie większe od k

3

i w tych warunkach K

m

staje się miarą powinowactwa enzymu do substratu



Wartość K

m

można wyznaczyć doświadczalnie

Metoda Lineweavera-Burka



Najprostsze przekształcenie równania Michaelisa-Menten



Postać liniowa równania

Hamowanie reakcji enzymatycznych



Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od wielu czynników obecnych w
środowisku



Czynniki te dzieli się na niespecyficzne (inaktywatory) i specyficzne
(inhibitory)



Czynniki niespecyficzne: czynniki fizyczne - pH, temperatura,

czynniki chemiczne - rozpuszczalniki organiczne,
stężone roztwory soli metali ciężkich, niektóre
kwasy aromatyczne



Czynniki specyficzne: czynniki chemiczne, które działają na określony
fragment cząsteczki enzymu



Zjawisko specyficznego hamowania reakcji to inhibicja



Inhibitor blokuje współdziałanie składników biorących udział w reakcji
enzymatycznej (enzym, substrat, koenzym)



Inhibicję można podzielić na odwracalną i nieodwracalną



Inhibicję odwracalną można podzielić na kompetencyjną
(współzawodniczącą) i niekompetencyjną (niewspółzawodniczącą)



Inhibitory nieodwracalne wiążą się ściśle, często kowalencyjnie,
z resztami aminokwasów w miejscu aktywnym enzymu trwale
inaktywując enzym,



Inhibitory odwracalne kompetencyjne współzawodniczą o
wiązanie z miejscem aktywnym enzymu z cząsteczkami substratu,
ten typ inhibicji można przezwyciężyć przez zwiększenie stężenia
substratu



Inhibitory odwracalne niekompetencyjne wiążą się z innymi
miejscami niż centrum aktywne enzymu powodując zmianę
konformacyjną enzymu i obniżając szybkość katalityczną enzymu

Inhibicja enzymów

Inhibicja nieodwracalna



Przykładowe inhibitory tego typu to:



DIPF –diizopropylofluorofosforan (składnik gazów bojowych

działających na układ nerwowy)



Amid kwasu jodooctowego



Kwas p-chlorortęciobenzoesowy (pCMB)

Inhibicja odwracalna



Inhibitory kompetencyjne są zazwyczaj strukturalnie podobne
do naturalnego substratu enzymu przez co konkurują z naturalnym
substratem o miejsce w centrum aktywnym enzymu



Duże stężenie substratu niweluje działanie inhibitora

Przykład inhibicji kompetencyjnej



Hamowanie przemiany bursztynianu do fumaranu katalizowanej
przez dehydrogenazę bursztynianową

FAD- dinukleotyd flawinoadeninowy

Wpływ inhibitora kompetencyjnego na V

max

i

K

m



Inhibitory kompetencyjne nie wpływają na wartość V

max

, a jedynie zwiększają

wartość K

m

, która jest miarą powinowactwa enzymu do substratu



Obecność inhibitora jedynie pozornie zmniejsza powinowactwo enzymu do

substratu



Inhibitory niekompetencyjne wiążą się w innym miejscu
enzymu niż jego centrum aktywne



Enzym wiąże inhibitor albo substrat lub też inhibitor i substrat

Wpływ inhibitora niekompetencyjnego na
V

max

i K

m



Inhibitory niekompetencyjne wpływają na wartość V

max

, ale nie

zmieniają wartości K

m

Klasyfikacja enzymów



Dla ujednolicenia klasyfikacji enzymów w 1964 r Międzynarodowa
Unia Biochemiczna powołała Komisję Enzymatyczną, która
opracowała system nazewnictwa enzymów

Szczegóły klasyfikacji enzymów

Kontrola aktywności enzymatycznej



Regulacja aktywności enzymatycznej może zachodzić poprzez

sprzężenie zwrotne (produkt końcowy hamuje decydujący etap

syntezy aby zapobiec nagromadzeniu się półproduktów,

niepotrzebnemu zużywaniu substratów i energii)



Regulacja allosteryczna w przypadku enzymów z więcej niż

jednym miejscem aktywnym (związanie substratu w jednym

miejscu aktywnym zmienia konformację enzymu i indukuje

powinowactwo do substratu w innych miejscach aktywnych)



Odwracalne modyfikacje kowalencyjne pozwalają na czasową

zmianę aktywności enzymatycznej poprzez tworzenie lub

rozrywanie wiązań kowalencyjnych pomiędzy enzymem a grupą

niebiałkową (np. fosforylacja)



Nieaktywne prekursory enzymów (proenzymy, zymogeny)

mogą być aktywowane poprzez hydrolizę wiązań peptydowych



Zmiana szybkości rozpadu białka enzymatycznego oraz

jego ilości (poprzez indukcję bądź represję genu kodującego

enzym) pozwala na regulowanie aktywności enzymatycznej

Regulacja przez sprzężenie zwrotne

Asp +
CP

Karbamoil
o-

asparagini
an

P

OA

OM
P

UM
P

CMP

Karbamoilo-

transferazaAs
p

CP- karbamoilofosforan

OA- kwas orotowy

OMP-
orotydynomonofosforan

UMP-
urydynomonofosforan

CMP-
cytydynomonofosforan

Synteza UMP- urydynomonofosforanu

Regulacja allosteryczna



Mechanizm ten wykorzystuje efekt allosteryczny w przypadku gdy

regulowany enzym jest białkiem allosterycznym



Efektor allosteryczny łączy się z białkiem i tym samym powoduje jego

modyfikację



Efektory allosteryczne mogą działać na enzym aktywująco (pozytywne

sprzężenie zwrotne) lub dezaktywująco (negatywne sprzężenie zwrotne)

1- centrum aktywne
enzymu

2- centrum allosteryczne

3- efektor allosteryczny

Białko enzymowe w postaci

monomeru

Białko enzymowe w postaci dimeru

Odwracalne modyfikacje kowalencyjne



Wiele grup niebiałkowych może być odwracalnie dołączanych do
enzymów jednak najczęstszą modyfikacją jest wprowadzanie lub
usuwanie grupy fosforanowej

H

2

O

P

i

białko - OH

białko - O - P = O

O

O

ATP

ADP

fosfataza

białkowa

kinaza

białkowa

Aktywacja proteolityczna



Proteazy trzustkowe (trypsyna, chymotrypsyna i elastaza) powstają jako tzw.

zymogeny



Aktywacja zymogenów polega na nieodwracalnej hydrolizie wiązań peptydowych