Chromatografi a
kolumnowa
1
Weronika Górka
ZMiN
Chromatografi a
kolumnowa
1
Weronika Górka
ZMiN
Jest to rodzaj chromatografii, w której
sorbent stanowi wypełnienie kolumny
chromatograficznej. Fazą ruchomą jest
ciecz, a fazą stacjonarną – złoże stałe lub
ciecz zaadsorbowana na złożu
wypełniającym kolumnę. Składniki
mieszaniny przemieszczają się ku dołowi z
szybkością zależną od siły oddziaływań ich
cząsteczek z sorbentem. Poszczególne
związki wędrują z różną szybkością i dzięki
temu można je kolejno odbierać na dole
kolumny.
Chromatografia kolumnowa jest bardzo
dobrą i wydajną techniką służącą do
wydzielania i oczyszczania produktów
naturalnych i syntetycznych. Jest
stosowana we wszystkich metodach
chromatograficznych.
DEFINICJA
2
3
Ogólny podział chromatografii
kolumnowej:
• Gazowa -
analizowana mieszanina jest najpierw
przeprowadzana w fazę gazową w odparowywaczu, następnie podaje
się ją na kolumnę. Później próbka jest porywana przez gaz
nośny (zwykle hel lub wodór) i przechodzi przez długą kolumnę, gdzie
następuje rozdział mieszaniny na poszczególne związki chemiczne. Na
wyjściu znajduje się detektor.
4
• Cieczowa -
technika
rozdzielania, w której fazą
ruchomą jest ciecz.
Chromatografia cieczowa może
być przeprowadzana na kolumnie
lub na płaszczyźnie. Obecnie w
chromatografii cieczowej
generalnie stosuje się bardzo
małe cząstki fazy stacjonarnej
oraz stosunkowo wysokie
ciśnienia, w związku z tym często
nazywana jest wysokosprawną
(lub wysokociśnieniową)
chromatografią cieczową (HPLC).
5
Kolumny chromatograficzne wykonane są ze szkła, tworzyw
sztucznych lub ze stali nierdzewnej . To w nich zachodzi
właściwy proces rozdziału.
Wybór kolumny w zależności od
jej rozmiarów jest uwarunkowany
wielkością chromatografowanej
próbki, czasem jej rozdzielenia
oraz efektem rozdzielenia jaki
chce się uzyskać.
pompa
dozowni
k
kolumn
a
detektor
eluent
próbka
eluat
wynik
Kolumny o małej średnicy wymagają mniej
wypełnienia, mniej eluentu (koszt wypełnienia i eluentu
jest wysoki) i można wykrywać mniejsze stężenia
analizowanych substancji w próbce.
6
Kolumny i ich wypełnienia
chromatograficzne:
Typy kolumn:
• preparatywne (średnica wew. 2,5 – 5cm, długość 1-16m),
• analityczne (średnica. wew. 2-6mm, długość 1-3m),
• mikropakowane (średnica wew. 0,8-1,2mm, długość – kilkanaście
metrów).
• mikrokapilarne (średnica wew., <0,1mm, długość do kilkudziesięciu
metrów),
• kapilarne (średnica wew. 0,2-0,6mm, długość do 15 - 60m).
Najczęściej stosowane są kapilarne i
pakowane. Standardowa handlowa
długość kolumn kapilarnych wynosi
15,30 i 60m, jednak istnieją także
kolumny kapilarne o długościach od 10
do nawet 300m. .
Kolumny kapilarne maja postać zwoju,
wytwarza się je ze szkła lub topionego
kwarcu.
7
Zdjęcia wybranych kolumn
chromatograficznych:
Kolumna chromatograficzna
z kranem teflonowym i
spiekiem
Kolumna Vigreux ze
szlifem
Kolumna pakowana
Kolumna kapilarna
8
Wypełnienia kolumn
chromatograficznych:
Adsorbenty:
• Adsorbenty węglowe,
• Żele krzemionkowe,
• Sita molekularne,
• Polimery porowate.
W wysokosprawnej chromatografii kolumnowej cieczowej
stosuje się najczęściej wypełnienia o rozmiarze ziaren 5-
10µm. Cząstki mniejsze niż 3µm nie są stosowane, gdyż
powodują zbyt duży opór przepływu fazy ruchomej.
Kolumny w tej metodzie wypełnione są sorbentem,
którego właściwości kinetyczne są tym lepsze, im cieńsza
jest grubość warstwy aktywnej.
9
Wypełnienia kolumn
chromatograficznych:
Można to uzyskać stosując sorbenty o porowatej
powierzchni np. szklanego wnętrza (sorbenty
powierzchniowo-porowate).
Jednak kolumny takie mają małą pojemność sorpcyjną i
małą sprawność, dlatego są rzadko stosowane.
Częściej stosuje się wypełnianie sorbentami
objętościowo-porowatymi, które zapewniają wysoką
sprawność i dużą pojemność sorpcyjną. Wypełnia się
nimi kolumny do rozdzielania preparatywnego.
10
Wypełnienia kolumn
chromatograficznych:
W chromatografii adsorpcyjnej,
prowadzonej w normalnym układzie faz,
jako wypełnienie kolumn stosuje się przede
wszystkim żel krzemionkowy (silikażel).
Żel krzemionkowy jako wypełnienie kolumn
ma dużo zalet:
• posiada uziarnienie o pożądanej wielkości
i odpowiednich rozmiarach porów,
• określoną powierzchnię właściwą,
• dużą wytrzymałość mechaniczną.
Chemiczna struktura powierzchni żelu
krzemionkowego związana jest z obecnością
grup silanolowych ≡ Si-O-H lub
siloksanowych
≡ Si-O-Si ≡. Dezaktywowany żel
krzemionkowy jest przydatny do rozdzielania
mieszanin związków bardzo polarnych, np.
alkoholi, amin lub kwasów.
Natomiast do chromatografowania związków
mało polarnych stosuje się żel
niedezaktywowany.
Silikażel jest powszechnie stosowany jako
środek wchłaniający wilgoć.
11
Typowe błędy podczas rozdziału za pomocą
chromatografii kolumnowej:
• zbyt szeroka kolumna – zbyt duża dyfuzja, nierówny
przepływ
• zbyt wąska kolumna lub za małe ziarna lub zbyt mało
polarny eluent – za wolny przepływ,
• za mało nośnika lub za grube ziarna – zły rozdział
• zbyt mało aktywny nośnik – zły rozdział,
• złe upakowanie kolumny lub nierówne nałożenie próbki –
nierówny rozdział,
• zbyt polarny eluent – brak rozdziału,
• zbyt szybki przepływ – brak rozdziału, nie ustalają się
równowagi międzyfazowe,
• zbieranie zbyt dużych frakcji – złe rozdzielenie substancji.
12
Zastosowanie chromatografii
kolumnowej:
•
służy do rozdziału frakcji octano-etylowej zawierającej m.in.
flawonoidy,
• do analiz bardzo małych ilości związków chemicznych stosuje się
chromatografy typu nanoHPLC. Kolumny tych chromatografów mają
średnicę kilkudziesięciu µm i długość do kilkudziesięciu cm, a analiza
próbki trwa kilkadziesiąt do kilkuset minut. Chromatografy nanoHPLC
charakteryzują się bardzo dużą rozdzielczością kosztem mniejszej
powtarzalności uzyskanych wyników,
• jest obecnie szeroko stosowana w medycynie sądowej (do
identyfikacji próbek pobranych z miejsc zbrodni),
• większość nielegalnych narkotyków można wykryć poprzez badania
krwi lub moczu. Na przykład, zawodnicy są okresowo zobowiązani do
przedłożenia krwi i / lub próbki moczu do testów. Testy te wykonuje się
za pomocą chromatografii gazowej,
13
• przykładem łączenia metod chromatograficznych z innymi metodami
jest metoda oznaczania dwunastu leków przeciwdepresyjnych we krwi
z użyciem chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią
masową (LC/MS),
• metody chromatograficzne stosuje się także w monitorowaniu
zanieczyszczeń - dla identyfikacji małych stężeń nieznanych
zanieczyszczeń w powietrzu i próbkach wody,
• do rozdzielania skomplikowanych mieszanin w perfumach, w
przemyśle petrochemicznym i farmaceutycznym,
• wysokosprawna chromatografia cieczowa z spektrofotometrem
masowym (HPLC-MS) służy także do badania barwników organicznych:
identyfikacja barwników pochodzących z obiektów
zabytkowych: tkanin, malowideł, fresków, polichromowanych rzeźb,
iluminowanych starodruków,
Zastosowanie chromatografii
kolumnowej:
14
Zastosowanie chromatografii
kolumnowej:
•
przy pomocy chromatografii kolumnowej wykryto obecność
błękitu pruskiego,
• badanie dzieła potwierdziło, że jest reprodukcją obrazu z XVI
wieku.
15
