KOLUMNY
CHROMATOGRAFICZNE

Magdalena Bialik
Karina Jeleniewska
Paweł Kalinowski

RODZAJE KOLUMN



Mikrokolumny



Kolumny analityczne – stosowane najczęściej



Kolumny preparatywne

Mikrokolumny



Długość 2-2,5cm



Średnica 0,5 –
1mm



Wielkość ziaren 3,
5, 10um

Kolumny analityczne



Długość 5 – 25 cm



Średnica 3 – 5 mm



Wielkość ziaren 3 – 10
um

Kolumny preparatywne



Długość 25 - 100cm



Średnica 1,2- 10cm i
więcej



Wielkość ziaren 10 - 75um

Wypełnienia



Wypełnienia krzemionkowe



Żywice porowate

Wypełnienia krzemionkowe

ŻEL KRZEMIONKOWY



Materiał o dużej wytrzymałości mechanicznej,
odpowiednich rozmiarach porów, amorficzny.



Modyfikacja poprzez wiązanie aktywnych grup żelu
krzemionkowego z materiałami organicznymi

Faza oktadecylosilanowa (ODS)



najpopularniejsza faza niepolarna –
oktadecylosilanolowa o 18 atomach węgla w
łańcuchu



wykorzystywana do rozdzielana różnych
związków – od niepolarnych do
polarnych



stosowana w chromatografii o odwróconym
układzie faz

Normalny układ faz



faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza
ruchoma



z krzemionką związane są grupy polarne:



R-CN;

R-NO

2

R-NH

2



służą do rozdzielania substancji polarnych



Eluenty- heksan, izooktan, chloroform

Odwrócony układ faz



faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza
ruchoma



z krzemionką związane są grupy niepolarne:



R-CH

3

;

R-C

8

H

17



R-C

18

H

37

;



Eluenty - metanol, izopropanol, woda ( wodne
roztwory buforowe )



Rozdzielanie substancji niepolarnych

Endcapping



jest to proces stosowany po modyfikacji

żelu krzemionkowego grupami ODS



polega na dezaktywacji za pomocą
trimetylochlorosilanu pozostałych grup
silanolowych, otrzymując mniej aktywną fazę
stacjonarną



efektem tego jest przede wszystkim wzrost
hydrofobowości powierzchni

Liczba półek teoretycznych



mówi o sprawności kolumny



im więcej półek teoretycznych tym sprawność
kolumny większa, a uzyskane piki węższe



liczbę półek teoretycznych oblicza się ze
wzoru

N=16(t

r

/W

B

)

2

Sprawność i selektywność



Sprawność kolumn chromatograficznych
decyduje o tym czy pik chromatograficzny jest
ostry czy rozmyty



gdy każdy składnik mieszaniny wprowadzonej
do układu wykazuje zróżnicowaną retencję,
układ chromatograficzny jest selektywny
wobec składników rozdzielanej mieszaniny

WRPT



najmniejsza długość odcinka kolumny, w
której osiąga się stan równowagi między
stężeniami substancji chromatografowanej w
fazie ruchomej i nieruchomej



im wartość H (WRPT) jest mniejsza, tym
kolumna ma więcej półek i jest sprawniejsza

Równanie van Deemtera

Przedstawia zależność wysokości

równoważnej półce teoretycznej od średniej,
liniowej prędkości przepływu fazy ruchomej
przez kolumnę

Czas martwy t

M



czas przebywania w kolumnie substancji,
która nie ma powinowactwa do fazy
stacjonarnej np. metanu; czas zerowy jest
równy czasowi przepływu fazy ruchomej przez
kolumnę

Wyznaczanie t

M



wyznaczanie teoretyczne:

Wyznaczanie t

M



Porównanie wartości
eksperymentalnej z
wartością teoretyczną

Najczęściej czas martwy (objętość
martwą kolumny) w układach

faz

normalnych

wyznacza się stosując

skwalan

, albo

fluoroalkany

, jako

substancję wzorcową, a fazą
ruchomą jest rozpuszczalnik o
średniej sile elucyjnej np.

octan

etylu

.

W układach

faz odwróconych

stosuje się często jako substancję
testową

uracil

lub

D2O

lub stężony

roztwór

azotanu potasu

(detekcja

przy długości fali λ=205-280 nm), a
fazą ruchomą może być metanol
albo acetonitryl.

Zależność pomiędzy prędkością liniowa a natężeniem przepływu

ciekłej fazy ruchomej w kolumnie o różnych średnicach

Czynniki wpływające na sprawność kolumn



wielkość cząstek wypełnienia
kolumny



struktura wypełnienia



opory przenoszenia masy



prędkość i profil przepływu cieczy



kinetyka zjawisk sorpcji – desorpcji
itp.



temperatura

Zredukowana wysokość półki teoretycznej

Wyraża się stosunkiem wysokości półki

teoretycznej H do średnicy cząstek d

p

wypełnienia kolumnowego

Kolumna ma dobrą sprawność gdy h=2-3

R

s

= 2 ( t

R2

– t

R1

/ W

1

+ W

2

)

t

R1

= czas retencji pierwszego piku

t

R2

= czas retencji drugiego piku

W

1

= szerokość piku przy podstawie

pierwszego piku
W

2

= szerokość piku przy podstawie

drugiego piku

Rozdzielczość Rs

R > 1,5 – wykazuje linię podstawy między pikami
R < 1,5 – wykazuje koelucję piku

Współczynnik retencji k

k = (t

R

– t

M

) / t

M

k = t’

R

/ t

M

t

R

= czas retencji

t’

R

= redukowany czas retencji

t

M

= czas retencji związku nie zatrzymywanego

k = n

s

/ n

m

n

s

– liczba moli w fazie stacjonarnej

n

m

– liczba moli w fazie ruchomej

k = C

s

x V

s

/ C

m

x V

m

Cs – stężenie składnika w fazie stacjonarnej
Cm – stężenie składnika w fazie ruchomej
Vs – objętość fazy stacjonarnej

Vm – objętość fazy ruchomej

Selektywność jako współczynnik

rozdzielczości α

α = ( t

RB

– t

M

) / ( t

RA

– t

M

) = k

B

/ k

A

t

RA

,

t

RB

–czasy retencji substancji A i B

k

A

, k

B

– współczynniki retencji substancji

A i B

α = k

B

/ k

A

α = t

r2

/ t

r1

Równanie Purnella

√N α - 1 k

2

Rs = ----- ---------- --------

4 α 1 + k

2

k

2

- współczynniki retencji substancji, której

odpowiada pik 2
N – liczba półek teoretycznych kolumny
α- współczynnik rozdzielenia

Wpływ temperatury na
sprawność kolumny



Chromatografia cieczowa wykonywana jest

głównie w temperaturze otoczenia,

dobierając właściwy eluent.



Mało aparatów z fabrycznym termostatem.



Zmiana temperatury chromatografowania

wpływa na sprawność kolumny i czas

retencji substancji.



Znaczne podwyższenie temperatury

zwiększa możliwości zastosowania

chromatografii cieczowej.

Dziękujemy za uwagę