CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA I KOLUMNOWA

Chromatografia jest techniką służącą do rozdzielania bądź identyfikowania składników mieszaniny. W każdej metodzie wykorzystuje się fakt, iż poszczególne składniki ulegają zróżnicowanemu podziałowi między dwie, nie mieszające się fazy: stacjonarną i ruchomą. Pierwszą z nich stanowią substancje, wykazujące duże właściwości sorpcyjne, drugą jest ciecz lub gaz. Składniki próbki poruszają się w warstwie ruchomej (eluent), a szybkość ich migracji zależy zarówno od powinowactwa do adsorbentu jak i do eluenta.

Metody chromatograficzne można sklasyfikować w zależności od rodzaju eluenta:

• Chromatografia cieczowa

  • Wysokosprawna chromatografia cieczowa

  • Chromatografia cienkowarstwowa

  • Chromatografia kolumnowa

• Chromatografia gazowa

Oraz w zależności od rodzaju fazy stacjonarnej:

• Chromatografia adsorpcyjna

• Chromatografia podziałowa

W ćwiczeniu wykorzystywano metody chromatografii kolumnowej i cienkowarstwowej.

Wykonanie ćwiczenia:

1. Przeprowadzono analizę jakościową otrzymanej mieszaniny barwników metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC):

   1. Przygotowano płytkę chromatograficzną (zaznaczono linię „startu” i „mety”, kapilarami naniesiono wzorce oraz badany roztwór – ok. 5-6 razy).

   2. Rozwinięto chromatogram (komorę chromatograficzną napełniono do 5 mm eluentem – toluenem i acetonem w stosunku 3:1, ścianki komory wyłożono bibułą, umieszczono chromatogram i odczekano, aż czoło eluenta dojdzie do linii „mety”, płytkę wysuszono suszarką, ustalono skład mieszaniny).

2. Rozdzielono analizowaną mieszaninę za pomocą techniki chromatografii kolumnowej (CC):

   1. Napełniono kolumnę (umieszczono watę, dodano trochę eluenta, przygotowaną uprzednio papkę żelu krzemionkowego wlano do kolumny – zastosowano większą ilość substancji, niż była podana w przepisie, by uzyskać dłuższą „drogę” dla barwników; spuszczono nadmiar rozpuszczalnika i na powierzchnię nasypano warstewkę piasku).

   2. Za pomocą pipetki Pasteura wprowadzono roztwór mieszaniny do środka; po zaadsorbowaniu barwników w piasku wlewano odpowiednie rozpuszczalniki.

   3. Zastosowano kolejno: toluen, który wymył Sudan I, następnie mieszaninę toluenu i acetonu (wymycie czerwieni metylowej) i jako ostatni etanol, który umożliwił oddzielenie oranżu 2-naftalowego.

   4. Poszczególne frakcje zebrano do osobnych fiolek.

3. Sprawdzono skuteczności rozdziału:

   1. Ponownie zastosowano metodę chromatografii cienkowarstwowej; ćwiczenie wykonano analogicznie jak w punkcie 1, z tą różnicą, że na płytkę naniesiono rozdzielone składniki, robiąc kapilarą plamki 20-krotnie – otrzymane próbki są bardzo rozcieńczone w stosunku do wyjściowego preparatu.

   2. Chromatogram wywołano, używając uprzednio przygotowanej komory chromatograficznej.

Opracowanie wyników:

Stosując metodę chromatografii cienkowarstwowej oszacowano wstępnie skład badanej mieszaniny. W próbce znajdowały się barwniki (kolejno): oranż 2-naftalowy, Sudan I (1-fenyloazo-2-naftol) oraz czerwień metylowa.

Dla poszczególnych plamek wyznaczono współczynniki R_f:

Rys. 2. Pomiar współczynnika opóźnienia R_f

Wnioski:

Metodą chromatografii cienkowarstwowej zbadano skład mieszaniny i oszacowano, że w próbce znajdowały się barwniki: oranż 2-naftalowy, Sudan I, czerwień metylowa. Na chromatogramie pierwszym widać również jasnoróżową plamkę (pod plamką czerwieni), która najprawdopodobniej jest zanieczyszczeniem, które było w pierwotnym preparacie. Druga jasnoróżowa plamka znajduje się nad fluoresceiną – ją możemy potraktować jako błąd przypadkowy – przy nanoszeniu wzorców na płytki pracowało wielu studentów i ktoś mógł pomieszać kapilary używane do tego celu; fluoresceina mogła zostać więc zanieczyszczona czerwienią metylową.

Dzięki chromatografii kolumnowej dokładnie rozdzielono poszczególne barwniki syntetyczne. Znajomość składu próbki pierwotnej pozwoliła na dobranie odpowiednich do tego celu rozpuszczalników. I tak zastosowano kolejno: toluen (wymywa najmniej polarne barwniki tj. Sudan I), mieszaninę toluenu i acetonu w stosunku 3:1 (oddzielono czerwień metylową); następnie zastosowano sam aceton, jednakże jego polarność była zbyt słaba, by mogła eluować ostatni składnik, dlatego dodano etanolu, który wymył czerwień metylową. Zastosowana metoda okazała się bardzo dobra, jeżeli chodzi o rozdział. Poszczególne barwniki uległy bardzo wyraźnemu rozwarstwieniu i nie było problemu z zebraniem poszczególnych frakcji. Dowodem tej tezy jest drugi chromatogram, na którym naniesiono same rozdzielone barwniki – na ich „drodze” nie zaobserwowano żadnych innych plamek, które mogłyby wskazywać na zanieczyszczenie preparatu innymi składnikami.

Obliczone współczynniki opóźnienia nie odbiegają daleko od wartości wzorcowych. Różnice mogą wynikać jedynie z niedokładności oka ludzkiego i przyrządów pomiarowych – nie wszystkie plamki były jednakowej wielkości i mogły nie znajdować się dokładnie na linii „startu”; pomiar odległości za pomocą linijki również obarczony jest pewną niepewnością (najmniejszą wartość jaką można odczytać jest 0,5 mm).