Chromatografia cienkowarstwowa TLC

Chromatografia:

(gr. chromatos = barwa + grapho = pisze)

to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych

Historia:

Wprowadzenie analizy chromatograficznej wiąże się z Cwietem, botanikiem rosyjskim, który w czasie swego pobytu w Warszawie przeprowadził rozdział mieszaniny barwników roslinnych na poszczególne składniki, a w publikacji z 1903 r. użył po raz pierwszy terminu „chromatografia” i opisał zasady teoretyczne tego procesu.

Chromatografia cienkowarstwowa jest znana od 1938 roku, kiedy to Izmaiłow i Schreiber podali jej zasadę, jednak dopiero od przełomu lat 50. i 60. datuje się jej szybki rozwój, który spowodował, że pod wieloma względami góruje ona nad innymi technikami chromatograficznymi.

Chromatografia

• Chromatografia należy do metod rozdzielania polegających na zróżnicowaniu szybkości migracji cząsteczek poszczególnych składników mieszaniny. Kady układ chromatograficzny składa sie z trzech elementów:

• fazy ruchomej,

• fazy nieruchomej,

• chromatografowanych substancji.

• W trakcie procesu chromatograficznego badana substancja dzieli sie pomiędzy dwie fazy - ruchoma i nieruchoma.

METODY CHROMATOGRAFICZNE

Do najczęściej wykorzystywanych technik chromatograficznych należą:

• chromatografia cienkowarstwowa (TLC),

• chromatografia gazowa (GC),

• wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC).

Stosowanie tych rodzajów chromatografii jest rozpowszechnione w badaniach toksykologicznych, w tym szczególnie w systematycznej analizie toksykologicznej.

CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA

• TLC - Thin Layer Chromatography

• Jest jedną z najbardziej popularnych metod analitycznych służących do wyodrębnienia i identyfikacji większości związków organicznych oraz wielu związków nieorganicznych.

• U podstaw leżą te same procesy, które decydują o pomyślnym rozdzieleniu substancji innymi metodami chromatograficznymi.

• Są to procesy:

• odwracalnej adsorbcji fizycznej,

• wymiany jonowej

• rozdziału substancji między dwie fazy ciekłe.

Najczęściej zachodzi kombinacja wszystkich trzech zjawisk, z przewagą jednego lub drugiego.

MECHANIZMY ROZDZIAŁU

W zależności od stosowanego sorbentu i układu rozpuszczalników wyróżnia się różne mechanizmy selektywnego rozdziału składników oznaczanej mieszaniny.

• Chromatografia podziałowa,

• Chromatografia adsorpcyjna.

CHROMATOGRAFIA PODZIAŁOWA

• Mniej polarna faza ruchoma przesuwa się nad nie mieszającą się z nią fazą polarną, zaadsorbowaną na biernym podłożu.

• Składniki badanej mieszaniny ulegają podziałowi między te dwie fazy w zależności od ich rozpuszczalności w każdej z nich.

• Umożliwia rozdział związków różniących się nieznacznie współczynnikiem podziału dzięki wielokrotnemu rozdziałowi cząsteczek składników mieszaniny między fazę ruchomą a nieruchomą.

• Fazą stacjonarną jest ciecz osadzona na ziarnach lub włóknach nośnika lub też nośnik, który wchłaniając rozpuszczalniki fazy ruchomej, tworzy półpłynny żel.

• Przykład: żel celulozowy

CHROMATOGRAFIA ADSORPCYJNA

• Cząsteczki rozpuszczalnika w fazie ruchomej współzawodniczą z cząsteczkami substancji o miejsca aktywne na powierzchni adsorbentu.

• Najczęściej używanymi adsorbentami są:

• Żel krzemionkowy,

• Tlenek glinowy.

RODZAJE ADSORBENTÓW -podział
FAZA STAŁA

ŻEL KRZEMIONKOWY

• Jest jednym z najbardziej popularnych adsorbentów stosowanych w chromatografii cienkowarstwowej.

• Jest on otrzymywany przez hydrolizę krzemianu sodu, jego kondensację i polimeryzację w trakcie prażenia.

• Aktywność żelu krzemionkowego zapewniają grupy Si-OH (silanolowe) obecne na jego powierzchni. Wytwórcy kontrolują aktywność na etapie prażenia.

• Adsorbent o średnicy ziaren od 5 do 25 μm.

• Zawiera do 13% siarczanu wpania.

• Im większa powierzchnia właściwa, tym silniejsze oddziaływanie pomiędzy fazą stacjonarną a substancją chromatograficzną. Powoduje to wzrost adsorpcji substancji badanej i tym samym jej większą retencję.

• Typy żelu krzemionkowego oznaczane są często w sposób następujący:

• Żel krzemionkowy G - zawiera 13% gipsu jako czynnika wiążącego

• Żel krzemionkowy H bez środka wiążącego

• Żel krzemionkowy F₂₅₄ z fluorescentem

• Żel krzemionkowy UV₂₅₄ z fluorescentem

• Jako fluorescent zazwyczaj stosowany jest siarczek cynku.

• Żel krzemionkowy ma odczyn lekko kwaśny i może być stosowany do rozdziału sterydów, aminokwasów, węglowodorów, tłuszczów, alkaloidów itp.

• Cyfry poniżej F, np. F254 oznaczają długość fali przy której dodany indykator fluoryzuje.

TLENEK GLINU

• Obok żelu krzemionkowego jest najczęściej stosowanym adsorbentem.

• Aktywność tlenku glinu związana jest z obecnością zarówno atomów tlenu jak i glinu.

• Metoda produkcji polega na kondensacji uwodnionego wodorotlenku glinu.

• Może on być produkowany w trzech odmianach kwasowości powierzchni: formie kwasowej, zasadowej i obojętnej.

• Zasadowy tlenek glinu z w/w jest najbardziej popularny.

• Tlenek glinu jest używany do rozdziału sterydów, barwników, witamin i alkaloidów.

CELULOZA

• Chromatografia cienkowarstwowa na celulozie jest odpowiednikiem chromatografii bibułowej.

• Dzięki drobnoziarnistej strukturze nośnika pozwala uzyskać lepszy rozdział, większą czułość i wyraźniejsze plamki.

• Celuloza jest naturalnym polisacharydem zbudowanym z cząsteczek glukozy połączonych wiązaniami β(1,4) glikozydowymi.

• Celuloza jest stosowana do rozdziału związków hydrofilowych, rozpuszczalnych jonów nieorganicznych i kwasów nukleinowych, które mogą zbyt silnie oddziaływać z tlenkiem glinu lub krzemionką.

POLIAMID

• jest to sorbent, który w większości stosowanych w TLC rozpuszczalników pęcznieje tworząc żel o półpłynnej konsystencji.

• Mechanizm rozdziału polega na różnej sorbcji cząsteczek substancji przez bezpostaciowe obszary poliamidu. Grupami aktywnymi są grupy karbonylowe, dzięki czemu jest on szczególnie dobrym sorbentem substancji o właściwościach protonodonorowych, np. kwasów, fenoli, tanin.

SEPHADEX

• Żel dekstranowy jest używany w chromatografii cienkowarstwowej do rozdziału aminokwasów, peptydów i białek.

• Płytek pokrytych tym żelem nie suszy się całkowicie, lecz do momentu, gdy ziarenka żelu są zaledwie widoczne

FAZA RUCHOMA(1)

• Eluent powinien być tak dobrany, aby plamki składników były równomiernie rozmieszczone.

• Zdolność elucyjna rozpuszczalnika zależy głównie od adsorpcji rozpuszczalnika przez adsorbent.

• Należy stosować rozpuszczalniki mniej polarnych w przypadku otrzymywania zbyt wysokich wartości Rf i odwrotnie.

• W chromatografii podziałowej możemy stosować jedynie mniej polarne rozpuszczalniki, ponieważ bardziej polarne wymywają fazę stacjonarną.

• W chromatografii adsorpcyjnej można stosować szeroki zakres rozpuszczalników obejmujący nawet najbardziej polarne.

• W przypadku wyboru rozpuszczalnika lub mieszaniny należy stosować te, które dają Rf od 0,2 do 0,8.

• Pomocnymi w wyborze odpowiedniego składu fazy ruchomej są tzw. szeregi eluotropowe. Są to empiryczne zestawienia rozpuszczalników od najmniej polarnych do silnie polarnych uporządkowane dla danego typu adsorbentu. Na podstawie szeregów eluotropowych można stwierdzić, że mieszaniny różnych rozpuszczalników, dla pewnych ściśle określonych dla nich stężeń, maja takie same właściwości elucyjne.

Rozpuszczalnik	Moc elucyjna
n pentan	0,00
Cykloheksan	0,04
Chloroform	0,4
Aceton	0,56
Etanol	0,88
Woda	Bardzo duża

PRZYGOTOWANIE PŁYTEK

• Płytkę należy oczyścić - wymyć proszkiem lub płynem do czyszczenia, wypłukać w wodzie destylowanej i alkoholu.

• Nanieś zawiesinę sorbentu w wodzie.

• Płytki przechylać w różnych kierunkach, aż do uzyskania warstwy o tej samej grubości.

• Pozostawić do wyschnięcia w pozycji pionowej.

• Równe warstwy można otrzymać wylewając zawiesinę na płytkę i rozprowadzając je za pomocą bagietki.

• Większe ilości płytek można uzyskać za pomocą specjalnych powlekaczy. Umożliwiają one otrzymanie warstw o grubości od 0,1 do 2 mm.

NANOSZENIE PRÓBEK

Próbki rozpuszcza się w małej ilości łatwo lotnego rozpuszczalnika.

Próbki nanosi się na linię startu w postaci plamek okrągłych albo pasma na całej szerokości płytki.

Linia startu powinna być w takiej odległości (15-20 mm) od brzegu aby po jej umieszczeniu w komorze linia startu nie była zanurzona w eluencie.

Miejsce naniesienia można zaznaczyć ostrożnie ołówkiem.

Roztwory nanosi się za pomocą kapilar, mikropipet lub mikrostrzykawek.

Wzorce chromatograficzne nakrapia się obok próbek badanych.

ROZWIJANIE CHROMATOGRAMU (1)

• Proces ten polega na wywołaniu migracji rozpuszczalnika, a w wyniku czego uzyskuje się rozdział badanych substancji.

• W wyniku ruchu rozpuszczalnika i oddziaływania substancji chromatografowanych z sorbentem i fazą ruchomą następuje rozdzielenie składników mieszaniny.

• Składniki silniej oddziaływujące z adsorbentem a słabiej z fazą ruchomą są rozmieszczone w pobliżu linii startowej, składniki zaś słabiej oddziaływujące z adsorbentem a silniej z fazą ruchomą, rozmieszczają się w pobliżu czoła fazy ruchomej.

Komory chromatograficzne o dużej objętości wysyca się zwykle parami rozpuszczalnika.

WYWOŁYWANIE

• Po zakończonym procesie rozdziału należy uwidocznić wytworzone plamki.

• Jeżeli badany związek nie jest barwny, przeprowadza się wywoływanie stosując metody:

• chemiczne

• fizyczne

• biologiczne .

METODY CHEMICZNE (1)

• PARY JODU

- lub jego roztwory w alkoholu reagują z wieloma substancjami, tworząc plamki o żółtym lub brązowym zabarwieniu.

• ROZTWORY NADMANGANIANU POTASU

- w stężonym kwasie solnym lub w wodorotlenku sodu reagują z wieloma substancjami utleniając je. W wyniku tego na fioletowym tle pojawiają się brązowe plamki produktów utlenienia.

• KWAS FOSFOROMOLIBDENOWY

- odczynnik uniwersalny.

• AMONIAKALNY ROZTWÓR AZOTANU (V) SREBRA

- działa jak słaby utleniacz. Z reduktorami (związki fenolu i siarki) tworzy produkty o zabarwieniu od oranżowego do czarnego.

• ROZTWÓR DINITROFENYLOHYDRAZYNY

• do wizualizacji związków zawierających w cząsteczce grupy karbonylowe, zwłaszcza aldehydów i ketonów.

• ALKOHOLOWY ROZTWÓR NINHYDRYNY

- wizualizacja aminokwasów i amin alifatycznych.

• ODCZYNNIK DRAGENDORFFA

• wizualizacja alkaloidów i innych związków o charakterze zasadowym.

• PENTACHLOREK ANTYMONU W CHLOROFORMIE

• wizualizacja karotenoidów, steroidów i izoprenoidów.

• KWAS RUBEANOWODOROWY

- kationy metali.

METODY FIZYCZNE

• Dobrą metoda jest naświetlanie promieniami UV (wizualizacja fizyczna) najczęściej stosowane długości fali to 254nm, 350nm, 366nm.

• Jeżeli adsorbent na płytce zawiera wskaźnik fluoryzujący, to pod wpływem światła fluoryzuje cała płytka, a substancje które wygaszają fluorescencję są widoczne w postaci ciemnych plam.

WSPÓŁCZYNNIK Rf

• Do celów identyfikacji wykorzystuje się rozwijanie próbki badanej obok równocześnie naniesionych wzorców.

• Można też korzystać z wartości Rf podanych w tablicach.

• Współczynnik Rf określa nam miejsce położenia plamki na chromatogramie.

Dpróbki - odległość przebyta przez próbkę

Drozp - odległość przebyta przez rozpuszczalni

Położenie plami subtancji badanej względem związku wzorcowego określa nam współczynnik Rs

Dpróbki - odległość przebyta przez próbkę

Dwzorca - odległość plamki wzorca od startu

ANALIZA WYNIKU

PORÓWNYWANIE WIELKOŚCI PLAM

- metoda półilościowa oparta na fakcie, że rozmiar plamy jest proporcjonalny do logarytmu z ilości naniesionej substancji. Porównuje się wielkości plam, przerysowując je na papier milimetrowy i obliczając następnie ich powierzchnie.

METODA FOTOMETRYCZNA BEZPOŚREDNIA

- polega na przesunięciu wywołanego chromatogramu przed okienkiem fotokomórki. Na podstawie odczytanych wartości absorbancji znajduje się na krzywej kalibracyjnej odpowiadające im ilości substancji.

OZNACZANIE STĘŻENIA W ELUATACH

- zaadsorbowane substancje wymywa się z warstwy za pomocą odpowiednich rozpuszczalników i oznacza ich stężenie kolorymetrycznie lub spektrofotometrycznie. Po zlokalizowaniu plam zeskrobuje się je z płytki do roztworu eluującego i wykonuje pomiar.

ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ

• Rozdział i identyfikacja barwników

• Rozdział i identyfikacja pochodnych ksantyny

• Można wykrywać kwas askorbinowy (witamina C) w soku z cytryny, pomarańczy, kiszonej kapusty

• Analiza fosfolipidów

• Analiza lipidów

• Identyfikacja ksenobiotyków w procedurze Systematycznej Analizy Toksykologicznej

• Analizy ksenobiotyków w różnorodnych próbkach biologicznych (surowice roślinne, gleby, płyny ustrojowe oraz tkanki ludzkie i zwierzęce) z szerokim zastosowaniem do rozwiązywania problemów klinicznych, ekspertyzy sądowej, eksperymentu toksykologicznego, dopingu w sporcie)

• Przewidywanie aktywności farmakologicznej potencjalnych leków

• W analizie związków o działaniu antyhistaminowym

---