Chromatografia cienkowarstwowa polarnych lipidów złożonych mózgu
Chromatografia cienkowarstwowa:
Frakcja lipidowa otrzymana z tkanek zwierzęcych po wyekstrahowaniu tłuszczów prostych zawiera, obok fosfolipidów, także cerebrozydy i gangliozydy. Do identyfikacji poszczególnych grup polarnych tłuszczów złożonych przydatna jest metodą chromatografii cienkowarstwowej. Jako nośnik fazy nieruchomej-żel krzemionkowy z domieszką gipsu. Spośród układów rozpuszczalników dobre rozdziały uzyskuje się stosując następujące mieszaniny: chloroform/metanol/kwas octowy(85:25:1), chloroform/metanol/7 M amoniak(65:25:4), chloroform/metanol/woda(65:25:4).
Przygotowanie materiału:0,25g mózgu po wyjęciu z acetonu rozetrzeć w moździerzu i przenieść do probówki Eppendorf’a, zalać 1 ml acetonu, zamieszać i odwirować przez 3 min. w mikrowirówce. Aceton znad osadu zlać i odrzucić, osad zaś zalać 1ml eteru etylowego, zamieszać i odwirować jak powyżej. Supernatant zlać na szkiełko zegarkowe. Czynność jeszcze raz powtórzyć. Supernatany połączyć i pozostawić do odparowania. Suchą pozostałość na szkiełku zegarkowym rozpuścić przed nanoszeniem na płytkę w kropli eteru etylowego.
Nanoszenie próby i rozwijanie chromatografu:Za pomocą mikropipety nanieść 5 i 10 ul ekstraktu lipidowego w miejscu startu. Płytki przenieść do komory chromatograficznej z układem rozpuszczalników: chloroform/metanol/woda (65:25:4). Po osiągnięciu przez czoło rozpuszczalnika odległości zaznaczonej na chromatografie wzorcowym, zakończyć rozwijanie i suszyć chromatogram na powietrzu pod wyciągiem.
Wywołanie chromatogramu: wysuszoną płytkę wywołać w komorze wysyconej parami jodu. Obliczyć wartość Rf oraz zidentyfikować poszczególne lipidy.
Rf= 7,2/2,3=3,13
Ilościowe oznaczanie cholesterolu w surowicy metodą enzymatyczną
Do badania wykorzystujemy zestaw o składzie:
*odczynnik roboczy-bufor fosforanowy pH 6,6, fenolan sodowy+enzymy:eseraza cholesterolu CHE, oksydaza cholesterolu CHO,peroksydaza POD, 4-aminofenazon,
*standard-roztwór wzorcowy cholesterolu 200mg/dl
Przygotowanie prób:
| Kolumna1 | próba zerowa | próba wzorcowa | próba badana |
|---|---|---|---|
| odczynnik roboczy | 1ml | 1ml | 1ml |
| standard cholesterolu | - | 10ul | - |
| surowica | - | - | 10ul |
| woda destylowana | 10ul | - | - |
Próby dokładnie wymieszać, inkubować 10min. w temperaturze 37 C, odczytać absorbancję prób wzorcowych i prób badanych wobec próby zerowej przy długości fali 520nm.
| Kolumna1 | PZ | PW | PB | PBP |
|---|---|---|---|---|
| 520nm | 0 | 0,314 | 0,284 | 0,7525 |
Obliczanie wyników:
Stężenie cholesterolu całkowitego oblicza się według równania:
Stężenie cholesterolu= A(PB)/A(PW) *stężenie wzorca (200mg/dl)
P. normalna : c= 0,2840/0,3140 *200= 180,89
P. patologiczna: c=0,7525/0,3140 *200 = 479,30