Chromatografia cienkowarstwowa lipidów

Martyna Straszewska 20.11.2012r.

Temat: Chromatografia cienkowarstwowa lipidów.

Lipidy należą do dużej grupy naturalnych związków organicznych, nierozpuszczalnych w wodzie, natomiast rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych takich jak eter etylowy, chloroform, benzen, aceton. Do lipidów zalicza się też pochodne lipidów naturalnych i pokrewne im związki, które zachowują cechy lipidów.

Ze względu na budowę chemiczną lipidy można podzielić na:

a)Lipidy proste - estry kwasów tłuszczowych i alkoholi.

Lipidy właściwe- Są to estry kwasów tłuszczowych i glicerolu.
Woski- Są to estry wyższych kwasów tłuszczowych i alkoholi innych niż glicerol.

b)Lipidy złożone - związki zawierające oprócz kwasów tłuszczowych i alkoholi także inne składniki.

Fosfolipidy-Są to lipidy zawierające kwas fosforowy jako mono lub diester.
Glikolipidy - Są to związki zawierające co najmniej jeden cukier połączony wiązaniem glikozydowym z częścią lipidową.
Inne lipidy złożone

c)Lipidy pochodne - pochodne lipidów prostych i złożonych, powstałych przede wszystkim w wyniku ich hydrolizy, zachowując ogólne właściwości lipidów.

Kwasy tłuszczowe -Tłuszcze zbudowane są z kwasów tłuszczowych, których budowa chemiczna determinuje podział tych związków na kwasy tłuszczowe nasycone, jednonienasycone (monoenowe) i wielonienasycone (polienowe).

Kwasy tłuszczowe nasycone : masłowy,kapronowy,kaprylowy,kaprynowy,laury nowy,palmitynowy,stearynowy

Kwasy tłuszczowe jednonienasycone:oleopalmitynowy,oleinowy,elaidynowy

Kwasy tłuszczowe wielonienasycone - Niezbędne Nienasycone Kwasy Tłuszczowe:linolowy (omega-6),γ-linolenowy (gamma-linolenowy) (omega-6),arachidonowy (omega-6),α-linolenowy (alfa-linolenowy) (omega-3),dokozaheksaenowy (omega-3),eikozapentaenowy (omega-3)

Alkohole
Węglowodory

Funkcje

są najbardziej skoncentrowanym źródłem energii
są wygodnym i głównym źródłem materiału zapasowego
nagromadzony w tkance tłuszcz chroni przed nadmiernym wydzieleniem ciepła, pozwala na adoptowanie się w niskiej temperaturze, wewnątrz organizmu utrzymuje narządy w stałym położeniu, zapobiega ich przemieszczaniu się,
odłożone w organizmie lipidy są magazynem wody
mieszane tłuszcze pożywienia są źródłem witamin rozpuszczalnych w tłuszczach: A, D, E, K i Niezbędnych Nienasyconych Kwasów Tłuszczowych (witamina F),
tłuszcze w pożywieniu oszczędzają gospodarkę białkami i witaminami z grupy B,
pełnią funkcję budulcową, są składnikiem błon komórkowych oraz stanowią ważny element wchodzący w skład wielu hormonów, cholesterolu oraz ważnych substancji wewnątrzkomórkowych.

Chromatografia jest metodą rozdziału wykorzystującą różnice w oddziaływaniu poszczególnych związków z dwiema fazami: fazę stacjonarną (ciecz lub ciało stałe) i fazę ruchomą (ciecz lub gaz). Chromatografia znajduje szerokie zastosowanie jako metoda wyodrębniania i oczyszczania związków (m.in. chromatografia kolumnowa) jak również analiz mieszanin (m.in. chromatografia cienkowarstwowa TLC)
Chromatografia cienkowarstwowa. W metodzie tej stosuje się warstwę fazy stacjonarnej (w naszym ćwiczeniu żel krzemionkowy) naniesionej na podłoże, przylegające do płytki dzięki dodatkowi środka wiążącego np. siarczanu wapnia, gipsu. Fazą ruchomą jest ciecz (rozpuszczalniki organiczne lub ich mieszaniny). Chromatografia cienkowarstwowa służy do szybkiej analizy jakościowej. Stosuje się ją głównie do określenia liczby składników w próbce, do wykrywania określonego związku w mieszaninie oraz jako wstępną próbę przy poszukiwaniu warunków do chromatografii kolumnowej.

Wykonanie analizy TLC obejmuje następujące czynności: przygotowanie płytki, naniesienie badanego roztworu, rozwinięcie chromatografu, wywołanie chromatografu, analizę wyników:

a)Zanurzamy płytkę w świeżo przygotowanym odczynniku do wykrywania fosfolipidów

b)umieszczamy ją w parach jodu

c)trzecią płytkę zanurzamy w roztworze H1SO4 i suszymy do momentu wystąpienia barw (czerwone bądź brunatne)

Brązowy kolor na chromatografie świadczy o wykryciu tłuszczy nienasyconych. W miejscu wiązania podwójnego przyłączane są dwa atomy chlorowca-jodu. W ekstrakcie znajduje się kwas linolanowy. Kolor różowo-czerowony ukazuje nam wykrycie cholesterolu w roztworach wzorcowych. Barwi się on w wyniku odwodnienia zachodzącego pod wpływem kwasu siarkowego. W ekstrakcie znajduje się kwas linolanowy, cholesterol. Trzeci chromatograf o barwie granatowej ujwanił fosfolipy. W ekstrakcie znajduje się cholesterol, kwas linolanowy.

Wykrywanie glicerolu-próba akroleinowa- przeprowadzana jest w celu wykrycia glicerolu,który odwadnia się do lotnego, nienasyconego aldehydu akrylowego, zwanego akroleiną. Związek ten posiada ostry drażniący zapach i jako aldehyd ma zdolność redukowania jonów srebra do srebra atomowego w alkalicznym środowisku. Występuje w przypalonym oleju np.podczas smażenia ryb, frytek.Polega ona na badaniu odróżniającym tłuszcz od substancji tłustej.

Ogrzewamy dwie substancje jedna to olej, a w drugiej glicerol.Do każdej dodano szczyptę KHSO₄. Pod wpływem ogrzewania oleju wydziela się dym i pasek bibuły barwi się na brunatno-czarny. Glicerol po ogrzaniu wydziela pary,które po chwili barwią pasek bibuły na szary kolor. Srebro zredukowało się.

Zmydlanie tłuszczów – otrzymywanie mydła - Mydła otrzymuje się w wyniku reakcji hydrolitycznego zmydlania trójglicerydów wodorotlenkami. Koniec zmydlania stwierdza się, gdy mała próbka mydła rozpuszcza się w wodzie. Produkuje się je zwykle z tłuszczów nasyconych, aczkolwiek znane są także mydła z tłuszczów nienasyconych. Ich proces produkcji polega na długotrwałym gotowaniu tłuszczów ze stężonym roztworem zasady sodowej, magnezowej lub litowej, na skutek czego dochodzi do zerwania wiązań estrowych oraz powstania gliceryny i mydła właściwego.

W parowniczce porcelanowej ogrzewamy 1,5 ml oleju,a następnie dodajemy 2,5 ml 30 % NaOH i 1,5 ml etanolu.Podgrzewamy próbę,ciągle ją mieszając bagietką szklaną aż do powstania mydła. Później dodajemy wrzącą wodę i mieszamy tak długo aż otrzymane mydło rozpuści się zupełnie.

Mydło nierozpuszczalne

Do 3 probówek zawierających 1 ml wcześniejszego mydła dodaliśmy odpowiednio MgCl₂, CaCl₂, Pb(CH₃COO₂). We wszystkich probówkach wytrącił się osad,lecz po zlaniu klarownego roztworu i dodaniu 3 ml wody destylowanej zauważyliśmy wytworzenie się mydła nierozpuszczalnego we wszystkich probówkach.

Próba Kreisa jest próbą jakościową, umożliwiającą wykrywanie w tłuszczach

jadalnych obecności aldehydu epihydrynowego, który daje reakcje barwną z

floroglucyną w obecności kwasu solnego. Aldehyd epihydrynowy jest jednym z

produktów rozkładu, powstającym podczas jełczenia tłuszczów o dużej zawartości

nienasyconych kwasów tłuszczowych. W tłuszczu zjełczałym aldehyd epihydrynowy znajduje się w postaci acetalowej. Postać acetalową przeprowadza się w stan wolny za pomocą kwasu solnego i dopiero ta reaguje z floroglucyną (kolor krwistoczerwony).

W probówce umieścić 2 ml świeżego oleju i do drugiej probówki dodać 2 ml oleju zjęcząłego. Do obu probówek dodać po 2 ml stężonego kwasu solnego. Wytrząsnąć przez minute. Dodać 2 ml r-ru rezorcyny w toluenie, wytrząsnąć i poczekać do rozdzielenia się warstw. Czerwone zabarwienie wskazało obecność aldehydów.

Reakcja Hubla- wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych – Nienasycone kwasy tłuszczowe w miejsce podwójnego wiązania przyłączają 2 atomy chlorowca.

Do 3 probówek dodajemy 10 kropli wody,oleju i do trzeciej małą ilość margaryny. Następnie dodajemy do każdej z prób po 5 kropli odczynnika Hubla I i Hubla II. Mieszamy.

Rozpuszczalność tłuszczowców - Tłuszcze nie rozpuszczają się w wodzie, ulegają natomiast emulgacji przy zmniejszonym napięciu powierzchniowym przez detergent, zarówno naturalny jak i syntetyczny. W etanolu tłuszcze rozpuszczają się słabo,

natomiast bardzo dobrze rozpuszczają się w acetonie i chloroformie.