Metody wykrywania

mutacji

Dawid Woś



Pozwalają na wykrycie osób z
wysokim ryzykiem zachorowania
na nowotwory czyli



bezobjawowych nosicieli mutacji.
Umożliwia to skuteczną i tańszą
profilaktykę.

Analizy Molekularne

Metody wykrywania

mutacji

Bezpośrednie
wykrywanie mutacji jest
najbardziej

swoistą

metodą
wykrywania zaburzeń w
obrębie genu. Umożliwia
rozpoznanie nosicielstwa
mutacji niemal ze 100%
pewnością

Pośrednie

wykrywanie

mutacji jest metodą o nieco
mniejszej swoistości pozwala
natomiast
na

potwierdzenie

lub

wykluczenie

nosicielstwa

mutacji

w

wielu

przypadkach, w których nie
można
wykryć zmian bezpośrednio
w genach.

Badanie DNA

IZOLACJA DNA

PC
R

METODY PRZESIEWOWE

SEKWENCJONOWANIE



Krew obwodowa



Nasienie



Wymazy komórkowe



Mocz



Mleko



Plwocina



Kał



Wycinki tkanek



Płyn mózgowo-rdzeniowy



Hodowle bakteryjne i tkankowe

Materiały biologiczne:

Polega na powielaniu fragmentu genomowego

DNA.

Składa się z 3 etapów:
-Denaturacja

92-94

o

C

-Przyłączanie starterów

~ 60

o

C

-Elongacja

72

o

C

Pod koniec pierwszego cyklu otrzymujemy 2

kopie DNA zawierające region który chcieliśmy
zwielokrotnić. Ponieważ w każdym kolejnym
cyklu każda z nici DNA stosowana jest jako
matryca, liczba kopii powielanych fragmentów
rośnie wykładniczo.

Metoda PCR



matryca DNA



polimeraza termostabilna



para specyficznych starterów
(primers)



trójfosforany
deoksyrybonukleotydów (dNTP)



bufor (zawierający Mg

2+

)



woda

Skład mieszaniny reakcyjnej
PCR

G.K.

Prnciple of a Polymerase Chain Reaction (PCR )

5’

3’

separation of strands

and primer attachment

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3

’

5’

primer elongation

separation of strands

and primer attachment

(1

. cycle)

(2.

cycle etc.)

Primer 1

Primer 2

complementary to primer 2

complementary to primer 1

amplification of target sequence



Badanie polimorfizmu fragmentów  DNA
powstających

w

wyniku

działania

endonukleaz restrykcyjnych na nić DNA,
polimorfizm powstały w wyniku delecji,
insercji lub tranzycji prowadzi do zmiany
lub zaniku miejsca rozpoznawanego przez
enzymy restrykcyjne. RFLP jest kluczowym
narzędziem

w

rozpoznawaniu

DNA,

określaniu

obecności

różnych alleli u

osobników.

RFLP- polimorfizm długości

fragmentów restrykcyjnych



Technika ta opiera się na tym, że
jednoniciowe DNA w roztworze wykazuje
określoną

strukturę

drugorzędową.

Struktura ta zależy od rodzaju i sekwencji
zasad tworzących nić DNA. Mutacje
punktowe, delecje i insercje powodują
zmiany struktury drugorzędowej, co jest
wykrywane za pomocą elektroforezy w żelu
poliakrylamidowym.

SSCP - badanie zmian

konformacji jednoniciowego DNA



Podobnie jak SSCP jest techniką względnie prostą.
Jeżeli sekwencje niezmienione (typu dzikiego) oraz
sekwencje z mutacją są obecne w reakcji PCR to
produktami tej reakcji są cztery różne dwuniciowe
fragmenty DNA. Dwa z nich to homodupleksy , czyli
struktury dwuniciowe w pełni komplementarne.
Dwa inne to heterodupleksy zawierające miejsca
niesparowane. Heterodupleksy ze zmianą co
najmniej jednej zasady mogą wykazywać inną w
porównaniu do homodupleksów ruchliwość podczas
elektroforezy na zwykłym poliakrylamidowym żelu

HET- analiza

heterodupleksów



W tej metodzie wykorzystuje się dwa różne
oligonukleotydy, jeden komplementarny do
sekwencji

prawidłowego

genu,

drugi

komplementarny do znanej mutacji w tym
genie.

Sondy

ASO

hybrydyzują

z

komplementarną sekwencją DNA. Wyniki
odczytuje się bezpośrednio z filtrów, na
podstawie intensywności barwy powstałego
krążka.

ASO- metoda analizy genu za pomocą

oligonukleotydów specyficznych dla allela.



Podstawą

działania

mikromacierzy

jest

komplementarność kwasów

nukleinowych.

Mikromacierz

zawiera

sekwencje

komplementarne do badanych sekwencji. Próbkę
kwasu

nukleinowego

wyznakowuje

się

znacznikami fluorescencyjnymi i hybrydyzuje z
mikromacierzą.

Cząsteczki

wyznakowanego

kwasu

nukleinowego

wiążą

się

do

komplementarnych sekwencji. Obraz odczytuje
się ilościowo za pomocą lasera lub mikroskopu.
Intensywność sygnału dla poszczególnych sond
mikromacierzy jest proporcjonalna do ilości
kwasu nukleinowego o danej sekwencji w próbce.

Mikromacierze

Fragment mikromacierzy DNA w

powiększeniu



W tej metodzie genomowe DNA poddaje się
trawieniu enzymami restrykcyjnymi, by następnie
powstałe

fragmenty,

rozdzielić

elektroforetycznie. W celu uzyskania formy
jednoniciowej poddaje się je denaturacji i
przenosi na filtr nitrocelulozowy bądź nylonowy.
Związany

z

filtrem

jednoniciowy

DNA

hybrydyzuje z sondą (DNA wyznakowany i
komplementarny do badanego fragmentu).

W sytuacji gdy występuje duża mutacja układ

prążków jest odmienny niż w próbkach bez
mutacji.

Metoda Southerna

genomowe DNA

trawienie enzymami restrykcyjnymi

rozdział elektroforetyczny

denaturacja dwuniciowego DNA

transfer na filtr nitrocelulozowy bądź nylonowy

hybrydyzacja jednoniciowego DNA z sondą

analiza autoradiogramu (duża mutacja - układ

prążków

jest odmienny niż w próbkach bez mutacji)



Gerard Drewa, Tomasz Ferenc; Podstawy
genetyki dla studentów i lekarzy.



Kurzawski Grzegorz; Analizy molekularne
DNA i RNA w wykrywaniu dziedzicznych
predyspozycji do nowotworów.

Bibliografia: