TECHNIKI ANALIZY DNA

Wykrywanie mutacji



Wykrywanie mutacji w sekwencji
DNA jest często kluczowe dla
zrozumienia procesu wywoływania
przez gen specyficznej choroby



Metody molekularne rozwinięte
ostatnio pozwoliły na opracowanie
licznych technik wykrywania mutacji
na poziomie DNA

Techniki analizy DNA



Enzymy restrykcyjne



Hybrydyzacja



Amplifikacja DNA metodą PCR



Analiza RFLP



PCR Multipleks



Hybrydyzacja ASO



PCR w czasie rzeczywistym



Metody przesiewowe



Sekwencjonowanie



Diagnostyka pośrednia



Analiza SSCP

ENZYMY RESTRYKCYJNE



Rozpoznają specyficzne sekwencje
w obrębie dsDNA, co w efekcie
prowadzi do powstania ściśle
określonych fragmentów DNA
zarówno pod względem długości jak i
struktury końców

HYBRYDYZACJA



Tworzenie podwójnej helisy pomiędzy

komplementarnymi niciami DNA lub

RNA pochodzącymi z różnych żródeł



Oddziaływanie badanego fragmentu

DNA i sondy molekularnej prowadzi

do utworzenia hybrydu (kompleksu)

o dwuniciowej strukturze



Sonda musi być zdenaturowana

(jednoniciowa), wyznakowana

radioaktywnie lub fluorescencyjnie

HYBRYDYZACJA TYPU
SOUTHERN (Southern
blotting)



Stosowana najczęściej



Dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA



Można tą metodą wykryć:

- rearanżacje genowe np. delecje albo

insercja

- mutacje punktowe

HYBRYDYZACJA TYPU
NORTHERN BLOT



Dotyczy hybrydyzacji RNA-DNA



Stosowana w celu badania ekspresji
określonych genów



Dostarcza dodatkowych informacji o
występowaniu w badanych
komorkach określonego RNA

DNA fingerprinting



Wykorzystuje się obecność w genomie

polimorficznych sekwencji

powtórzonych VNTR (zmienna liczba

tandemowych powtórzeń)



W wyniku badań hybrydyzacyjnych z

sondami molekularnymi

rozpoznającymi jednocześnie

kilkanaście loci otrzymuje się dla

każdego osobnika charakterystyczny

obraz fragmentów DNA tzw. Fingerprint

(odcisk genetyczny)

AMPLIFIKACJA DNA metodą
PCR



Reakcja ta odzwierciedla naturalny
proces replikacji i umożliwia w
warunkach in vitro szybkie
powielenie wybranych odcinków DNA
lub RNA, przepisanych na cDNA w
reakcji odwrotnej transkrypcji

Analiza RFLP (polimorfizmu

długości fragmentów restrykcyjnych)



Polimorfizmy RFLP objawiają się
utworzeniem lub zanikiem miejsca
rzopoznawanego przez enzymy
restrykcyjne lub zmianą liczby
nukleotydów pomiędzy takimi
miejscami



Zastosowanie – identyfikacja mutacji
punktowych w obrębie miejsca
rozpoznawanego przez enzym
restrykcyjny np. fenyloketonuria

PCR Multipleks



Jednorazowo można amplifikować 10
markerów



Można badać DNA zmieszany i
zdegradowany



Zastosowanie – duże mutacje
genowe, delecje, duplikacje, insercje

HYBRYDYZACJA ASO



Hybrydyzacja z sondą specyficzną
dla produktu DNA



Sonda rozpoznaje allel dziki lu
zmutowany



Zastosowanie – wykrywanie mutacji
punktowych, które nie zmieniają
miejsc restrykcyjnych np.
mukowiscydoza

PCR w czasie

rzeczywistym

(Real time PCR)



Metoda ilościowa oparta na amplifikacji Dna
in vitro – opiera się na pomiarze liczby kopii
Dna, przez pomiar fluoroscencji



Zastosowanie:

- ilościowe określanie ekspansji genów
- testowanie stabilności genetycznej
- ilościowe określanie DNA wirusowego
- detekcja patogenow
- wykrywanie trisomii i mikrodelecji

METODY PRZESIEWOWE – PCR-

SSCP



Analiza konformacji jednoniciowych
DNA



Polega na porównaniu konformacji
badanych fragmentów kwasów
nukleinowych



Umozliwia wykrywanie punktowych
zmian w DNA np. Z.Marfana

METODA SEKWENCJONOWANIA
ENZYMATYCZNEGO SANGERA



Polega na enzymatycznej replikacji
jednoniciowej matrycy Dna,
rozpoczynającej się od jednego
startera, a kończącej wbudowaniem
dideoksynukleotydu do
nowopowstałego łańcucha DNA

PIROSEKWENCJONOWANIE –
SEKWENCJONOWANIE W CZASIE
RZECZYWISTYM



Wykorzystuje się pirofosfoniuan
uwalniany podczas syntezy Dna



W wyniku reakcji enzymatycznych
docohdzi do emisji światła, jego
intensywnosć zależy od ilości
uwalnianego pirofosfonianu, czyli od
liczby wbudowanych nukleotydów



Stosowana do genotypowania
poznanych wcześniej polimorfizmów

DIAGNOSTYKA POŚREDNIA



Analiza asocjacji - porównuje rozkład
alleli różnych polimorfizmów pomiędzy
grupą niespokrewnionych chorych a
grupą kontrolną. Stosowana w
chorobach uwarunkowanych
wielogenowo/ wieloczynnikowo



Analiza sprzężeń – wykrywa
sprzężenia pomiędzy markerami a
poszukiwanymi genami, wymaga
badań rodzinnych. Stosowana w
chorobach jednogenowych

POLIMORFIZM POJEDYNCZEGO NUKLEOTYDU
– SNP (single nucleotide
polymorphism)



Zjawisko zmienności sekwencji DNA,
która polega na zmianie
pojedynczego nukleotydu (A, T, G,
C) pomiędzy osobnikami danego
gatunku lub drugim,
odpowiadajacym chromosomem
danego osobnika